蛋白質的離子交換層析技術研究進展

蛋白質離子交換層析技術離子交換層析原理離子交換劑實驗條件的確定具體操作方法常見問題及處理12345應用實例6當前1頁，總共34頁。1.離子交換層析的原理以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。蛋白質（以靜電引力為主）的離子交換層析兩性分子，不同pH，所帶電荷種類和數(shù)目不同高級結構，大分子，多位點吸附除靜電力還有氫鍵、疏水作用、范德華力等當前2頁，總共34頁。待分離的目標分子和雜質一起進入平衡后的離子交換劑，目標分子和雜質因帶電量不同，與離子交換劑有不同的結合程度，通過逐漸增加鹽離子濃度，將目標分子和雜質分別洗脫下來，從而實現(xiàn)目標分子和雜質的分離。當前3頁，總共34頁。2.離子交換劑基本結構2.1指標2.2分類2.3當前4頁，總共34頁。2.1離子交換劑的基本結構基質應具備的特點：機械穩(wěn)定性強，適合高流速化學穩(wěn)定性好，在很寬的pH范圍內保持穩(wěn)定，能耐去污劑、有機溶劑。球形，顆粒均勻。親水性。高交換容量，要有較大的孔徑。水不溶性基質活性基團平衡離子++平衡離子當前5頁，總共34頁。2.2離子交換劑的指標交換容量：離子交換劑能結合溶液中可交換離子的能力，通常用有效交換容量和實際交換容量來表示。膨脹度：干態(tài)的交換劑吸水后造成體積膨脹的程度。粒徑：一般都在3-300μm交聯(lián)度及網(wǎng)孔結構：交聯(lián)度越高，機械強度越好，耐壓性能越好。電荷密度：基質顆粒單位表面積的取代基數(shù)量。對于蛋白質，介質的電荷密度往往較低。以免結合過牢，難以洗脫且易變性。粒徑↓→分辨率↑，分離效果↑，但流速↓實際交換容量指每克干介質或每毫升濕膠包含的帶電功能基團的數(shù)量有效交換容量指每克干介質或每毫升濕膠在一定的實驗條件下吸附某物質的實際容量當前6頁，總共34頁。2.3離子交換劑的分類根據(jù)活性基團的酸堿性質和解離性質：酸堿性質：解離性質：陽離子交換劑：活性基團為酸性，結合陽離子陰離子交換劑：活性基團為堿性，結合陰離子強離子交換劑：活性基團為強酸強堿弱離子交換劑：活性基團為弱酸弱堿類型名稱英文符號陰離子強堿季銨基Q季銨基乙基QAE弱堿二乙氨基乙基DEAE陽離子強酸磺丙基SP磺乙基SE弱酸羧甲基CM蛋白質分離純化時，條件必須溫和，通常用弱離子交換劑當前7頁，總共34頁。2.3離子交換劑的分類由于樹脂的孔徑過小，且電荷密度過高，疏水性過強使得大分子結合過牢而不易洗脫，同時，會造成變性。通常用于蛋白質的離子交換劑多為纖維素等多糖類。纖維素葡聚糖瓊脂糖多糖類高效型非孔型聚乙烯醇型其它當前8頁，總共34頁。2.3離子交換劑的分類開放性長鏈，較大的表面積，吸附容量最大離子基團少，排列稀疏，與蛋白質結合不太牢固，易于洗脫良好的穩(wěn)定性，洗脫劑的選擇范圍廣纖維素當前9頁，總共34頁。2.3離子交換劑的分類目前使用交聯(lián)葡聚糖主要來自Pharmacia公司，主要有4種類型，都是以SephadexG為骨架商品名分別為SephadexA-25SephadexC-25SephadexA-50SephadexC-50SephadexA-25以SephadexG，即交聯(lián)葡聚糖為骨架A:陰離子C:陽離子凝膠吸水值的10倍25為每克凝膠膨脹時吸水2.5克葡聚糖當前10頁，總共34頁。2.3離子交換劑的分類123TECHNOSepharose系列SepharoseCL-6BBio-Gel系列34μm90μm200μm90μm粒徑大孔珠狀顆粒狀Q型SP型SepharoseHP弱型（DEAE，ANXCM）強型（Q，SP）SepharoseFFQ型SP型SepharoseBBDE型CM型瓊脂糖當前11頁，總共34頁。2.3離子交換劑的分類高效型：SOURCE系列、MonoBeads系列剛性的骨架結構：高硬度、高流速親水表面：低特異性吸附非孔型：MiniBeads系列所有的結合都發(fā)生在顆粒表面液膜擴散小，快速；顆粒小，分辨率高聚乙烯醇型：Toyopearl系列多孔型三維網(wǎng)狀結構，富含羥基，高度親水其它當前12頁，總共34頁。無孔型有孔型無孔型微孔型大孔型無孔型，交換發(fā)生在表面；有孔型，需進入基質內部再發(fā)生交換當前13頁，總共34頁。2.3離子交換劑的分類高效型：SOURCE系列、MonoBeads系列剛性的骨架結構：高硬度、高流速親水表面：低特異性吸附非孔型：MiniBeads系列所有的結合都發(fā)生在顆粒表面液膜擴散小，快速；顆粒小，分辨率高聚乙烯醇型：Toyopearl系列多孔型三維網(wǎng)狀結構，富含羥基，高度親水其它當前14頁，總共34頁。3.實驗條件的確定離子交換劑3.1色譜柱3.2緩沖液3.3當前15頁，總共34頁。3.1離子交換劑按規(guī)模：分析型分離，一般用柱色譜；大規(guī)模工業(yè)化分離，有柱色譜、膨脹床吸附、分批分離等多種模式按目的：在預處理和初分級階段，目的是提取和濃縮目標分子；在細分級和最后的精制階段，目的是去除雜質，獲得單一組分。目標分子的大?。哼x擇合適孔徑的基質目標分子的電荷及pH穩(wěn)定性：在起始緩沖液中，目標分子和介質的功能基團帶相反的電荷，以利于目標分子結合在色譜柱上，起始相洗脫，雜質和介質的功能基團帶相反的電荷，從而吸附在色譜柱上。這時，收集流穿峰即可。當前16頁，總共34頁。3.2色譜柱通常用高徑比較小的柱子離子交換柱的高度一般在5-20cm確定基本參數(shù)后，可通過直徑↑→擴大分離規(guī)模。當前17頁，總共34頁。3.3緩沖液緩沖離子：與功能基團帶相同的電荷pH：蛋白質的pI→緩沖液的pH→緩沖液的種類

離子強度：離子強度↑→利于洗脫，不利于吸附當前18頁，總共34頁。4.離子交換的操作方法預處理4.1裝柱、平衡4.2上樣、洗滌4.3洗脫4.4色譜柱的再生4.5當前19頁，總共34頁。4.1預處理預裝柱：SOURCE、MonoBeads、MiniBeads系列

無需處理，直接使用。濕膠：無需預處理，使用前傾去上清，添加起始緩沖液，攪勻后裝柱即可干膠：需溶脹。通常室溫1-2d，沸水浴2h。Sephadex系列：不能用蒸餾水，避免強烈攪拌。纖維素系列：①制造的過程中，產生一些細顆粒，將纖維素在水中攪勻后，自然沉降，傾去上清漂浮物，反復數(shù)次即可。②制造完后，未經處理，含很多雜質成分，需洗滌，用0.5mol/L的NaOH和0.5mol/L的HCl進行“堿-酸-堿”反復浸泡，每次半小時，期間用蒸餾水洗至中性。當前20頁，總共34頁。4.2裝柱、平衡裝柱：排空柱底部的死體積，輕輕攪勻交換劑與緩沖液的混合液，玻棒引流，使液體沿柱壁流下，盡可能一次性注入，讓介質自然沉降。保持柱的垂直狀態(tài)，防止產生氣泡、防止分層。平衡：用起始緩沖液平衡，檢測下端流出液與起始緩沖液在pH、電導、離子強度方面是否達一致。對于弱離子交換劑，本身具有一定的緩沖能力，平衡時間很長。通常用酸或堿將pH調至起始pH；或用與起始緩沖液pH相同，但離子強度更大的緩沖液，加快pH平衡，最后用起始緩沖液平衡。當前21頁，總共34頁。4.3上樣、洗滌上樣加樣量：目的物含量為有效交換容量的10-20%。方法：預裝柱，通過恒流泵加樣。自裝柱，采用排干法：加樣時，不能攪動床面，要保持床面的完整。洗滌加樣完后，用起始緩沖液填滿柱上端，擰緊上口，用恒流泵泵入起始緩沖液當前22頁，總共34頁。4.4洗脫緩沖離子：與功能基團帶相同的電荷pH：蛋白質的pI→緩沖液的pH→緩沖液的種類離子強度：離子強度↑→利于洗脫，不利于吸附當前23頁，總共34頁。4.4洗脫-般采用分部洗脫和連續(xù)洗脫。分部洗脫：幾種不同洗脫能力的緩沖液相繼進行洗脫優(yōu)點：設備和操作簡單；洗脫迅速；洗脫液體積小缺點：性質相近的組分不易分開；同一組分出現(xiàn)多個峰連續(xù)洗脫：逐漸增強洗脫緩沖液的洗脫能力，分辨率↑梯度混合器當前24頁，總共34頁。4.5色譜柱的再生與清洗一般，高濃度鹽（通常是2M的NaCl）溶液清洗對于一些結合較牢固的物質，如變性的蛋白，沉淀而聚集的蛋白，疏水性蛋白或脂蛋白等一些膠狀物，用酸和堿洗脫疏水性更強的蛋白、脂蛋白以及脂類，用非離子去污劑或有機溶劑（70%的乙醇或30%異丙醇）逆向清洗。瓊脂糖：鹽和0.5M的NaOH纖維素：鹽和0.1M的NaOH葡聚糖：避免在pH小于3的環(huán)境，可用1M的NaAC0.5M的NaOH交替清洗。當前25頁，總共34頁。5.常見問題及處理層析速度太慢5.1蛋白質不與樹脂結合5.2純化蛋白質的產率低5.3蛋白質分辨效果差5.4當前26頁，總共34頁。增加柱壓并輕敲柱壁的方法以除去氣泡，確保在引入任何溶液時不要產生氣泡樣品蛋白質損失量允許的情況下，支撐物應取出并清洗用高徑比較小的柱子過柱前的樣品要超聲或超濾處理產生氣泡樹脂基質發(fā)生粘連層析柱太細細小顆粒堵柱5.1層析速度太慢問題處理當前27頁，總共34頁。降低初始上樣緩沖液離子強度注意計算蛋白質的等電點樹脂應充分平衡或用嚴格的再生方法初始上樣緩沖液離子強度過大樹脂pH值因解吸作用而發(fā)生變化樹脂未進行適當平衡或再生的樹脂未洗凈5.2蛋白質不與樹脂結合問題處理當前28頁，總共34頁。樹脂上的蛋白質未洗凈pH值不合適或蛋白質發(fā)生沉淀水解酶破壞了目的蛋白或樹脂中有微生物滋生5.3純化蛋白質的產率低增強溶液離子強度；更換活性高的反離子或使用去垢劑等方法解決。適當調節(jié)PH蛋白提取過程中應加水解酶抑制劑抑制蛋白水解問題處理當前29頁，總共34頁。5.4蛋白質分辨效果差流速太快或層析柱過短梯度洗脫時洗脫液濃度變化太快上柱蛋白質過多降低流速可采用連續(xù)洗脫等梯度變化較慢的洗脫減少上樣量問題處理當前30頁，總共34頁。6.應用實例混合物的分離6.1蛋白質的柱上復性6.2當前31頁，總共34頁。6.1混合物的分離Bio-Rex70層析分離眼鏡蛇神經毒素的6種單乙?；苌镅坨R蛇神經毒素，一種小分子堿性蛋白，分子中6個氨基（5個側鏈Lys殘基和一個游離的N端氨基）均能被乙?；梢阴；苌?形成的6種單乙酰基衍生物中凈電荷數(shù)相同，但表面的電荷分布不同。據(jù)此，可以用Bio-Rex70將它們分開。當前32頁，總共34頁。6.1混合物的分離兩步連續(xù)離子交換制備色譜分離純化PEG-rhG-SCF蛋白質聚乙二醇化的反應，生成非PEG化蛋白和不同程度的PEG化蛋白的混合物。因蛋白質PEG化程度越高，其等電點越低，根據(jù)電荷量的差異，通過SP-SepharoseFF和SOURSEQ30作為陽、陰離子色譜連續(xù)兩步將之分離開來。當前33頁，