核酸分子雜交專家講座

1核酸分子雜交NucleicAcidHybridization核酸分子雜交專家講座第1頁21.

Basicprincipleofnucleicacidhybridization2.

Basicmethodofnucleicacidhybridization3.BiochipTechnology4.Preparation&labelofnucleicacidprobes5.

FactorsofnucleicacidhybridizationContents核酸分子雜交專家講座第2頁3核酸分子雜交技術(shù)發(fā)展史Hall等1961年工作開始，探針與靶序列在溶液中雜交，經(jīng)過平衡密度梯度離心分離雜交體。Bolton等1962年設(shè)計(jì)了第一個(gè)簡(jiǎn)單固相雜交方法，稱為DNA-瓊脂技術(shù)。60年代末，Britten等研究液相中DNA復(fù)性以比較不一樣起源核酸復(fù)雜度，用UV260nm吸光度來監(jiān)測(cè)互補(bǔ)鏈復(fù)性程度。60年代中期Nygaard等將DNA或RNA探針固定在硝酸纖維素（NC）膜上。Brown等應(yīng)用這一技術(shù)評(píng)定了爪蟾rRNA基因拷貝數(shù)。是當(dāng)代膜雜交試驗(yàn)基礎(chǔ)。固相化學(xué)技術(shù)和核酸自動(dòng)合成儀誕生。70年代末期到80年代早期，分子克隆成為可能。能夠從基因組DNA文庫和cDNA文庫中取得特定基因克隆，制備大量探針DNA。1975年英國愛丁堡大學(xué)Southern建立了Southern印記雜交技術(shù)，用于轉(zhuǎn)化子分析。核酸分子雜交專家講座第3頁4TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1993.

"fortheirdiscoveriesofsplitgenes"

年上海交通大學(xué)微生物研究所核酸分子雜交專家講座第4頁5DNAmRNA法國科學(xué)家Chambon遺憾hybridizationelectronmicrographofOvalbuminmRNAandDNA核酸分子雜交專家講座第5頁6OvalbumingenehnRNAmodificationSplicingofhnRNAMaturemRNA核酸分子雜交專家講座第6頁7SectionIBasicprincipleofnucleicacidhybridization核酸分子雜交專家講座第7頁8denaturationrenaturation

核酸分子雜交是基于核酸分子變性和復(fù)性原理基礎(chǔ)上產(chǎn)生和發(fā)展起來。核酸分子雜交專家講座第8頁9DNA變性是指在物理或化學(xué)原因作用下，DNA分子互補(bǔ)堿基對(duì)之間氫鍵斷裂，使雙鏈DNA分子變成兩條單鏈DNA過程。I.Denaturation&renaturationofDNA核酸分子雜交專家講座第9頁101.FactorsthatcauseDNAdenaturation酸堿熱變性劑（尿素酰胺）有機(jī)溶劑（乙醇丙酮）核酸分子雜交專家講座第10頁112.changesinphysicalandchemicalpropertiesofdenaturedDNA

Hyperchromiceffect粘度下降

浮力上升核酸分子雜交專家講座第11頁12λ（nm）A82℃OD260（A260）光密度（OD）亦稱光吸收值（A）增色效應(yīng)：DNA變性時(shí)，其溶液OD260增高。HyperchromiceffectistheincreaseofOD260ofamaterialthatoccurswhentheDNAduplexisdenatured.核酸分子雜交專家講座第12頁13OD260應(yīng)用核酸濃度測(cè)定核酸純度測(cè)定dsDNA：1OD260=50ug/mlssDNA/RNA：1OD260=40ug/ml寡核苷酸：1OD260=20ug/mlDNAOD260OD280=1.8~2.0>2.0RNA污染<1.8蛋白質(zhì)、酚污染RNAOD260OD280=1.8~2.0>2.2降解為核苷酸<1.7蛋白質(zhì)、酚污染核酸分子雜交專家講座第13頁14

Tm：雙鏈DNA變性二分之一所需要溫度稱為解鏈溫度或融解溫度（meltingtemperature,Tm）。不一樣DNA含有不一樣Tm值，普通為85~90℃，其大小與G+C含量成正比。Tm=（G+C）%×0.41+69.3Thermaldenaturation核酸分子雜交專家講座第14頁15PCR熱變性溫度，普通為93~97℃。核酸分子雜交專家講座第15頁16

變性DNA在適當(dāng)條件下，兩條互補(bǔ)鏈可恢復(fù)天然雙螺旋構(gòu)象，這一現(xiàn)象稱為復(fù)性。減色效應(yīng)：

DNA復(fù)性時(shí)，其溶液OD260降低。3.RenaturationofDNAHypochromiceffectisthedecreaseofOD260ofamaterialthatoccurswhentheDNAisrenatured.核酸分子雜交專家講座第16頁17BasepairingofDNArenaturation核酸分子雜交專家講座第17頁18DNA濃度

DNA片段大小

DNA片段復(fù)雜性

適當(dāng)復(fù)性溫度

適當(dāng)離子強(qiáng)度影響復(fù)性速度原因：核酸分子雜交專家講座第18頁19II.核酸分子雜交

不一樣起源含有互補(bǔ)序列兩條核酸單鏈在一定條件下按堿基配對(duì)標(biāo)準(zhǔn)形成雙鏈過程。

DNA-DNA

DNA-RNA

RNA-RNA探針待測(cè)核酸分類核酸分子雜交專家講座第19頁20

DNA-DNA雜交雙鏈分子變性復(fù)性

DNA-RNA雜交雙鏈分子

RNA-RNA

雜交雙鏈分子

寡核苷酸-DNA或RNA

雜交雙鏈分子核酸分子雜交專家講座第20頁21核酸分子雜交技術(shù)基本原理

有互補(bǔ)特定核苷酸序列單鏈DNA或RNA混在一起時(shí)，其對(duì)應(yīng)同源區(qū)段將會(huì)退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)。如把一段已知基因（DNA或RNA）核酸序列用適當(dāng)標(biāo)識(shí)物（如放射性同位素、生物素等）給予標(biāo)識(shí)，看成探針（probe),與變性后單鏈DNA或RNA進(jìn)行雜交。再用適當(dāng)方法（如放射自顯影或免疫組織化學(xué)等技術(shù)）把標(biāo)識(shí)物檢測(cè)出來，就可確定靶核苷酸序列是否存在、拷貝數(shù)及表示豐度等。核酸分子雜交專家講座第21頁22

應(yīng)用：(1)檢測(cè)特定生物有機(jī)體之間是否存在親緣關(guān)系；(2)用來揭示核酸片段中某一特定基因存在是否、拷貝數(shù)及表示豐度。核酸分子雜交專家講座第22頁23第二節(jié)核酸分子雜交

基本方法核酸分子雜交專家講座第23頁24

液相雜交固相雜交原位雜交Southernblot（檢測(cè)DNA）Northernblot（檢測(cè)RNA）斑點(diǎn)雜交/狹縫雜交核酸分子雜交專家講座第24頁25三種印跡技術(shù)比較SouthernblotNorthernblotWesternblot核酸分子雜交專家講座第25頁26

是指將電泳分離、原位變性單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移到固相支持物上，然后，與核酸探針雜交，檢測(cè)DNA方法。一、Southern

Blot核酸分子雜交專家講座第26頁27帶有DNA片段凝膠DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳轉(zhuǎn)膜雜交、顯影凝膠濾膜（尼龍膜/硝酸纖維素膜）吸附有DNA片段膜Southern印跡雜交技術(shù)流程膠內(nèi)變性核酸分子雜交專家講座第27頁28基本步驟DNA制備、酶切電泳分離原位DNA變性DNA轉(zhuǎn)膜預(yù)雜交、雜交、洗脫雜交結(jié)果檢測(cè)（二）待測(cè)DNA樣品電泳分離（三）凝膠中核酸變性（四）Southern轉(zhuǎn)膜（一）待測(cè)核酸樣品制備（五）Southern雜交（六）雜交結(jié)果檢測(cè)核酸分子雜交專家講座第28頁29細(xì)胞組織化學(xué)試劑裂解細(xì)胞勻漿器研磨破碎組織中細(xì)胞蛋白酶、RNA酶消化大部分蛋白質(zhì)和RNA酚/氯仿除去殘余蛋白質(zhì)DNA（100kb±）乙醇（一）待測(cè)核酸樣品制備核酸分子雜交專家講座第29頁30

部分消化

充分消化限制酶消化EEEEEEHHDNA片段：（最長(zhǎng)DNA片段控制在大約2kb）核酸分子雜交專家講座第30頁311000500250100750121：DNAmarker2：試驗(yàn)組（EcoRI）0.8~1％非變性瓊脂糖凝膠（二）待測(cè)DNA樣品電泳分離核酸分子雜交專家講座第31頁32堿變性：DNA原位變性，形成單鏈分子，方便進(jìn)行分子雜交。酸中和：凝膠pH值恢復(fù)中性，方便DNA片段轉(zhuǎn)移。（三）凝膠中核酸變性核酸分子雜交專家講座第32頁33

（四）Southern轉(zhuǎn)膜及固定（250-500g）毛細(xì)管虹吸印跡法毛細(xì)轉(zhuǎn)移真空轉(zhuǎn)移電轉(zhuǎn)移核酸分子雜交專家講座第33頁34核酸分子雜交專家講座第34頁35核酸分子雜交專家講座第35頁36轉(zhuǎn)移后，各個(gè)DNA片段在膜上相對(duì)位置與在凝膠中相對(duì)位置依然一樣，因而稱為印跡（blot）。瓊脂糖凝膠硝酸纖維素膜印跡（blot）注意：做好點(diǎn)樣方向標(biāo)識(shí)核酸分子雜交專家講座第36頁37預(yù)雜交：目標(biāo)是將膜上全部能與DNA結(jié)合位點(diǎn)全部封閉，降低本底，使背景清楚潔凈。甲酰胺20×SSCDenhardt氏溶液鮭精DNASDS雜交：預(yù)雜交液+探針DNA（六）Southern雜交預(yù)雜交液（五）探針制備核酸分子雜交專家講座第37頁38洗膜：高低1×SSC:Na+濃度0.2mol/L2×SSC:Na+濃度0.4mol/L0.2×SSC:Na+濃度0.04mol/L0.1×SSC:Na+濃度0.02mol/LNa+濃度除去：未反應(yīng)探針與濾膜疏松結(jié)合探針非特異性結(jié)合探針核酸分子雜交專家講座第38頁39

X-ray片雜交膜放射自顯影（七）雜交結(jié)果檢測(cè)非放射性雜化分子檢測(cè)核酸分子雜交專家講座第39頁40DNA分子雜交應(yīng)用:

可進(jìn)行DNA片段定位和分子量測(cè)定

可用于基因酶切圖譜分析、基因突變分析

可用于檢出特異DNA片段

可用于基因文庫和cDNA文庫篩選核酸分子雜交專家講座第40頁41分子雜交試驗(yàn)流程①②③核酸分子雜交專家講座第41頁42

是指待測(cè)RNA樣品經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到固相支持物上，然后與標(biāo)識(shí)核酸探針進(jìn)行固-液相雜交，檢測(cè)RNA（mRNA）方法。二、NorthernBlot樣品是RNA。電泳前，不酶切。電泳前，樣品變性。電泳過程中，樣品保持變性狀態(tài)。電泳后，樣品不再變性，直接轉(zhuǎn)膜。需要尤其注意預(yù)防RNA被降解。全部器皿都要進(jìn)行處理，盡可能除盡RNA酶。核酸分子雜交專家講座第42頁43三、Westernblotting核酸分子雜交專家講座第43頁44

將RNA或DNA變性后直接點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，再采取特定探針進(jìn)行雜交，這種雜交方法稱為斑點(diǎn)雜交（dotblotting）或狹縫雜交（slotblotting）。四、斑點(diǎn)及狹縫雜交核酸分子雜交專家講座第44頁45多孔過濾加樣器加樣板支撐板抽真空板接真空泵印跡為圓形，稱為斑點(diǎn)印跡印跡為線狀，稱為狹縫印跡核酸分子雜交專家講座第45頁46正常對(duì)照組試驗(yàn)組1試驗(yàn)組2試驗(yàn)組3用于特定基因表示定性及定量研究用于基因突變分析核酸分子雜交專家講座第46頁47

標(biāo)識(shí)探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交并對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)一個(gè)方法稱原位雜交。五、原位雜交

（insituhybridization）

檢測(cè)基因在細(xì)胞內(nèi)表示與定位

檢測(cè)染色體中特定基因位置等

可用于基因克隆篩選菌落原位雜交(裂菌)核酸分子雜交專家講座第47頁48基本步驟：原位雜交分為：組織、細(xì)胞固定預(yù)處理預(yù)雜交、雜交雜交結(jié)果檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)原位雜交和組織切片原位雜交（10％甲醛等）（蛋白酶、SDS、TritonX-100）（核素和非核素標(biāo)識(shí)探針）核酸分子雜交專家講座第48頁49菌落原位雜交核酸分子雜交專家講座第49頁50核酸分子雜交專家講座第50頁51HPVFISH熒光原位雜交(FluorescenceinsituHybridization)人類染色體端粒DNA熒光原位雜交照片核酸分子雜交專家講座第51頁52三種印跡技術(shù)比較SouthernblotNorthernblotWesternblot膠內(nèi)變性上樣前變性上樣前變性變性膠預(yù)雜交-核酸分子雜交專家講座第52頁53第三節(jié)生物芯片技術(shù)核酸分子雜交專家講座第53頁54生物芯片

生物芯片（biochip）是近年來在生命科學(xué)領(lǐng)域中快速發(fā)展起來一項(xiàng)高新技術(shù)，主要是指經(jīng)過微加工技術(shù)和微電子技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA及其它生物組分準(zhǔn)確、快速與大信息量檢測(cè)。核酸分子雜交專家講座第54頁55DNA芯片

蛋白質(zhì)芯片

其它芯片生物芯片包含：按用途分：-樣品制備芯片

-生化反應(yīng)芯片-檢測(cè)芯片核酸分子雜交專家講座第55頁56是指將許多特定DNA片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積支持物上，然后與待測(cè)熒光標(biāo)識(shí)樣品進(jìn)行雜交，雜交后用熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，經(jīng)過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一位點(diǎn)熒光信號(hào)做出檢測(cè)、比較和分析，從而快速得出定性和定量結(jié)果。該技術(shù)亦被稱作DNA微陣列(DNAmicroarray)。一、基因芯片基因芯片(genechip)核酸分子雜交專家講座第56頁57基因芯片(genechip)

Cy3Cy5核酸分子雜交專家講座第57頁58許多特定DNA片段或cDNA片段作為探針Cy3Cy5核酸分子雜交專家講座第58頁59核酸分子雜交專家講座第59頁60芯片制作工藝流程圖（光引導(dǎo)原位聚合技術(shù)）核酸分子雜交專家講座第60頁61生物芯片研究總流程圖主要基因芯片生產(chǎn)廠商：Affymetrix企業(yè)Clontech企業(yè)Panomics企業(yè)核酸分子雜交專家講座第61頁62是將高度密集排列蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測(cè)蛋白樣品反應(yīng)時(shí)，可捕捉樣品中靶蛋白，再經(jīng)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析一個(gè)技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)分子間親和反應(yīng)蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)蛋白質(zhì)芯片作用原理核酸分子雜交專家講座第62頁63蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)抗原芯片原理圖核酸分子雜交專家講座第63頁64第四節(jié)探針制備與標(biāo)識(shí)核酸分子雜交專家講座第64頁65核酸探針（probe）：

探針是指帶有檢測(cè)標(biāo)識(shí)，能與被檢測(cè)核苷酸片段互補(bǔ)一段已知核苷酸片段。cDNA探針基因組DNA探針寡核苷酸探針RNA探針探針種類：核酸分子雜交專家講座第65頁66一、合成寡核苷酸探針注意標(biāo)準(zhǔn)(1)長(zhǎng)度（10-50bp);(2)G:C對(duì)含量40%-60%；(3)探針內(nèi)防止互補(bǔ)；(4)防止同一堿基連續(xù)出現(xiàn)；(5)與非靶序列有70%以上同源性或連續(xù)8個(gè)以上堿基序列相同，最好不用。核酸分子雜交專家講座第66頁67(1)標(biāo)識(shí)前后探針基本結(jié)構(gòu)、化學(xué)性質(zhì)相同;(2)特異性強(qiáng)、本底低、重復(fù)性好；(3)操作簡(jiǎn)單、節(jié)時(shí)；(4)安全、無環(huán)境污染。二、標(biāo)識(shí)物1、

一個(gè)理想標(biāo)識(shí)物應(yīng)滿足：核酸分子雜交專家講座第67頁682、標(biāo)識(shí)物種類32P、35S、3H、125I等半抗原：生物素（biotin）、地高辛（Dig）熒光素：異硫氰酸熒光素（FITC）、羅丹明等酶：辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等化學(xué)發(fā)光探針：增強(qiáng)魯米諾發(fā)光體系、吖啶類化合物發(fā)光體系和堿性磷酸酶催化1，2-二氧環(huán)己烷發(fā)光體系非核素標(biāo)識(shí)物核素標(biāo)識(shí)物核酸分子雜交專家講座第68頁69體內(nèi)標(biāo)記體外標(biāo)記化學(xué)法酶法三、標(biāo)識(shí)方法缺口平移法隨機(jī)引物標(biāo)識(shí)法PCR標(biāo)識(shí)法末端標(biāo)識(shí)法核酸分子雜交專家講座第69頁70利用標(biāo)識(shí)物分子上活性基團(tuán)與探針分子上基團(tuán)（如磷酸基團(tuán)）發(fā)生化學(xué)反應(yīng)將標(biāo)識(shí)物直接結(jié)合到探針分子上?；瘜W(xué)法：多聚體乙撐亞胺聚苯醌酶（如HRP）交聯(lián)多聚體乙撐亞胺酶DNA戊二醛交聯(lián)核酸分子雜交專家講座第70頁71酶法：OH5'5'3'

32P-dATP

生物素-dUTPorNTP

地高辛-dUTPorNTP

熒光素-dNTP核酸分子雜交專家講座第71頁72DNaseI5'5'3'3'5'5'3'3