實驗三酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA

試驗五

1.酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA)

2.補體結(jié)合反應(yīng)實驗三酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA第1頁1.酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA)實驗三酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA第2頁免疫標(biāo)識技術(shù)定義：

將抗原-抗體反應(yīng)與標(biāo)識技術(shù)相結(jié)合，用放射性同位素、酶或熒光素標(biāo)識已知抗體或抗原，經(jīng)過檢測標(biāo)識物，間接測定未知抗原或抗體。分類：放射免疫測定法：131I，32P免疫熒光技術(shù)：FITC，PE免疫酶測定法：HRP，AP實驗三酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA第3頁免疫酶測定法

(EnzymeImmunoAssay,EIA)用酶標(biāo)識抗原或抗體進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。

辣根過氧化物酶(HRP)，堿性磷酸酶(AP)特點：高度特異性：保持抗原抗體反應(yīng)特異性高靈敏度：酶催化底物顯色高效性，pg水平微量檢測定性定量檢測：反應(yīng)液顏色深淺或光密度值分類：酶聯(lián)免疫吸附試驗：可溶性抗原或抗體酶免疫組化法：組織中或細(xì)胞表面抗原。實驗三酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA第4頁酶聯(lián)免疫吸附試驗

(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)用酶標(biāo)識抗原或抗體檢測液體（血液、細(xì)胞液）中未知抗體或抗原方法。1.定義2.分類間接法（IndirectELISA）：將已知抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)識二抗檢測液相中未知抗體雙抗體夾心法（SandwichELISA)：將已知抗體吸附于固相載體，酶標(biāo)識一抗檢測液相中可溶性抗原競爭法（CompetitiveELISA)：將已知抗體或抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)識抗原或抗體檢測液相中可溶性抗原或抗體實驗三酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA第5頁酶聯(lián)免疫吸附試驗

(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)3.原理（以間接性ELISA為例）：顯色實驗三酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA第6頁試驗內(nèi)容：

間接法測定溶血素——定性檢測實驗三酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA第7頁試驗材料脫纖維綿羊紅細(xì)胞——抗原兔抗綿羊紅細(xì)胞抗體（溶血素）——待測兔血清HRP標(biāo)識羊抗兔IgG——二抗包被緩沖液：0.05MpH9.6碳酸鹽緩沖液洗滌液：含0.05%Tween200.01MpH7.4PBS底物緩沖液：pH5.0磷酸鹽檸檬酸緩沖液底物溶液：OPD10mg，底物緩沖液25ml，30%H2O240μL酶標(biāo)板，酶標(biāo)儀實驗三酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA第8頁試驗方法1.抗原處理：脫纖維綿羊血加3mLN.S，混勻rpm，5min加3mLN.S，混勻rpm，5min取2mL壓積紅細(xì)胞加入2mL蒸餾水，震蕩破碎紅細(xì)胞用包被緩沖液稀釋成1：400備用2.包被抗原：取酶標(biāo)板，加入100μL/孔抗原稀釋液4℃，濕盒內(nèi)，18h實驗三酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA第9頁取出包被好抗原酶標(biāo)板（4孔/組），甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（200μL/孔）洗滌3次，3min/次3.加待測血清標(biāo)識各孔，加入對應(yīng)液體100μL/孔1234陰性空白陽性待測4.加二抗：37℃，濕盒內(nèi)，30min甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（200μL/孔）洗滌3次，3min/次各孔加入酶標(biāo)二抗100μL/孔37℃，濕盒內(nèi)，30min5.顯色：甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（200μL/孔）洗滌3次，3min/次加入底物溶液100μL/孔避光顯色，10min6.觀察結(jié)果試驗方法實驗三酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA第10頁預(yù)期結(jié)果陽性：顯色為黃色陰性：無色1234陰性陰性陽性陽性實驗三酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA第11頁注意事項洗滌徹底，防止交叉污染。按次序加樣，孔底無氣泡。包被和溫育在濕盒內(nèi)進(jìn)行。實驗三酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA第12頁2.補體結(jié)合反應(yīng)

（ComplementfixationTest,CFT）實驗三酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA第13頁概念：補體結(jié)合反應(yīng)：是指在補體參加下，以綿羊紅細(xì)胞（SRBC）和溶血素（抗SRBC抗體）作為指示系統(tǒng)抗原抗體反應(yīng)。實驗三酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA第14頁補反中包含兩個系統(tǒng)五種成份：待檢系統(tǒng)：已知Ag或Ab、待檢Ab或Ag及僅供一組Ag-Ab系統(tǒng)反應(yīng)定量補體。指示系統(tǒng)：綿羊紅細(xì)胞和溶血素。原理：實驗三酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA第15頁待測系統(tǒng)抗原+未知血清12補體12Step1抗原抗體復(fù)合物形成Step2補體結(jié)合和耗竭指示系統(tǒng)SRBC+抗SRBC抗體Step3SRBC裂解121：NoAb；

2：Ab實驗三酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA第16頁AgY待測血清

YYYYYYYYAb陽性NoAb陰性AgAgAg實驗三酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA第17頁抗原：傷寒菌裂解產(chǎn)物待測血清：56℃，30min補體：豚鼠血清2%綿羊紅細(xì)胞溶血素材料：實驗三酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA第18頁方法：12345試驗管血清對照管抗原對照管補體對照管SRBC對照管待測血清0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.4mL0.8mL抗原補體N.S搖勻，37℃，水浴15min溶血素SRBC0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL………………………………………………搖勻，37℃，水浴15min（1份/2人）實驗三酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA第19頁預(yù)期結(jié)果：1．管內(nèi)液體混濁呈淺紅色為不溶血，管內(nèi)液體透明呈紅色為溶血。溶血不