選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座

專題2微生物培養(yǎng)與應用課題1微生物試驗室培養(yǎng)選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第1頁培養(yǎng)基能夠分為哪幾類？培養(yǎng)基普通都含有哪些營養(yǎng)物質，另外還要滿足哪些要求？取得純凈培養(yǎng)物關鍵是什么？什么是消毒、滅菌，慣用方法有哪些？制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基方法步驟？

學習目標怎樣倒平板？選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第2頁微生物類群原生生物：原核生物:真菌:病毒:如酵母菌如草履蟲、單細胞藻類等無細胞結構真核細胞細菌、藍藻原核細胞？選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第3頁選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第4頁一、培養(yǎng)基1.概念：人們按照微生物對_________不一樣需求，配置出供其____________營養(yǎng)基質。營養(yǎng)物質生長繁殖2.培養(yǎng)基類型和用途按物理性質固體培養(yǎng)基:加瓊脂；用于分離、判定、計數液體培養(yǎng)基：不加凝固劑；用于工業(yè)生產。半固體培養(yǎng)基：加少許瓊脂；可用于保藏菌種。選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第5頁按化學成份合成培養(yǎng)基：成份明確；分類判定。天然培養(yǎng)基：成份不明確；用于工業(yè)生產。按目標用途分判別培養(yǎng)基：培養(yǎng)基中加入某種試劑或化學藥品，區(qū)分出不一樣類型微生物。選擇培養(yǎng)基：依據某一個或一類微生物特殊營養(yǎng)要求或對一些物理、化學抗性設計培養(yǎng)基。如用青霉素選出酵母菌等。選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第6頁選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基應用加入青霉素分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽分離金黃色葡萄球菌不加氮源分離固氮菌不加含碳有機物無碳培養(yǎng)基分離自養(yǎng)型微生物加入青霉素等抗生素分離導入了目標基因受體細胞在微生物學中，將允許特定種類微生物生長，同時抑制或阻止其它種類微生物生長培養(yǎng)基。選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第7頁判別培養(yǎng)基依據微生物代謝特點在培養(yǎng)基加入某種指示劑或化學藥品配制而成，用以判別不一樣微生物只起判別作用，并不能抑制其它微生物

選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第8頁固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第9頁培養(yǎng)基普通都含有哪些營養(yǎng)物質，另外還要滿足哪些要求？選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第10頁不論哪種培養(yǎng)基，普通都含有水、碳源、和氮源、無機鹽等營養(yǎng)物質另外還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質,比如:生長因子(即細菌生長必需，而本身不能合成化合物,如維生素、一些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧氣、二氧化碳、滲透壓等要求。選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第11頁一.培養(yǎng)基：微生物生存環(huán)境和營養(yǎng)物質1.基本成份：碳源、氮源、水、無機鹽⑴碳源無機碳源：有機碳源：CO2、CO32-、HCO3-牛肉膏、蛋白胨等自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物⑵氮源無機氮源：有機氮源：NH4＋、NO3-牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等注：對于異養(yǎng)微生物，含C、N化合物既為碳源，也是氮源。選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第12頁牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一個應用最廣泛和最普通細菌基礎培養(yǎng)基。1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方H2O定容至1000mlNacl5g蛋白胨10g牛肉膏5g瓊脂20.0g選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第13頁培養(yǎng)基配制標準⑴目標明確：⑵營養(yǎng)全方面、濃度適宜、百分比恰當⑶適宜pH值：有機碳源異養(yǎng)型：依據微生物種類、培養(yǎng)目標選擇原料自養(yǎng)型：不加碳源加入緩沖劑（CO2碳源）生產科研選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第14頁2.無菌范圍：試驗操作空間消毒操作者手、衣著消毒試驗用具滅菌試驗操作過程二.無菌技術：預防外來雜菌污染1.消毒與滅菌：酒精燈旁操作超凈工作臺選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第15頁二、無菌操作技術1.取得純凈培養(yǎng)物關鍵？預防外來雜菌入侵2、無菌技術除了用來預防試驗室培養(yǎng)物被其它外來微生物污染外，還有什么目標？防止操作者本身被微生物感染選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第16頁消毒與滅菌消毒：使用較溫和物理或化學方法僅殺死物體表面或內部一部分對人體有害微生物（不包含芽孢和孢子）。滅菌：使用強烈理化原因殺死物體內全部微生物，包含芽孢和孢子。滅菌與消毒技術是微生物相關工作中最普通也是最主要技術。選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第17頁芽孢

有些細菌在一定條件下，細胞里面形成一個橢圓形休眠體，叫做芽孢。芽孢壁很厚，對惡劣環(huán)境有很強抵抗力。每一細胞僅形成一個芽孢，所以其沒有繁殖功效。細菌、原生動物、真菌和植物等產生一個有繁殖或休眠作用生殖細胞。能直接發(fā)育成新個體。孢子——特殊休眠結構選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第18頁消毒方法：1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化學藥劑消毒法:用75%酒精進行皮膚消毒;氯氣消毒水源4、紫外線適用對象：操作空間、液體、雙手等選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第19頁滅菌方法：1、灼燒滅菌2、干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。3、高壓蒸汽滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第20頁請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。假如需要，請選擇適當方法。（1）培養(yǎng)細菌用培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）試驗操作者雙手思考消毒滅菌滅菌選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第21頁練習：思索并討論下面儀器分別用什么樣消毒和滅菌方法？培養(yǎng)基培養(yǎng)皿空氣接種環(huán)雙手牛奶②巴氏消毒③化學消毒⑤紫外線消毒⑥高壓蒸氣滅菌①灼燒滅菌④干熱滅菌選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第22頁單個或少數菌體2.特征：大小、形狀、光澤度、顏色、透明度等。3.功效：1.定義：三、菌落判定菌種主要依據固體培養(yǎng)基上大量繁殖子細胞群體選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第23頁1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方H2O定容至1000mlNacl5g蛋白胨10g牛肉膏5g瓊脂20.0g四.大腸桿菌純化培養(yǎng)㈠制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基1.計算：培養(yǎng)基用量依配方計算各成份用量2.稱量：3.溶化：牛肉膏黏稠，用稱量紙稱取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加蓋牛肉膏、稱量紙、少許水加熱溶解→取紙→蛋白胨、NaCl→瓊脂→補水定容4.調pH、分裝、封口：5.滅菌：6.倒平板：培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第24頁倒平板約50℃預防皿蓋上水珠落入培養(yǎng)基，造成污染灼燒滅菌，預防瓶口微生物污染培養(yǎng)基選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第25頁1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么方法來預計培養(yǎng)基溫度？問題討論

答：用手觸摸，剛不燙手。2.為何需要使錐形瓶瓶口經過火焰？

答：灼燒滅菌，預防瓶口微生物污染培養(yǎng)基。選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第26頁3.平板冷凝后，為何要將平板倒置？4.在倒平板過程中，假如不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為何？

答：皿蓋凝結水珠，預防水珠落入培養(yǎng)基，造成污染；平板倒置，預防培養(yǎng)基表面水分揮發(fā)。

答：最好不用，空氣中微生物可能在皿蓋與皿底之間培養(yǎng)基上滋生。選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第27頁二.大腸桿菌純化培養(yǎng)：㈠制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基㈡純化大腸桿菌：⑴平板劃線法：菌種劃3個平板1個不劃線1.接種：接種環(huán)預防劃破培養(yǎng)基（重復試驗）（空白對照）選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第28頁問題2：每次劃線前灼燒接種環(huán)目標：問題3：劃線結束后灼燒接種環(huán)目標：防止接種環(huán)上可能存在微生物污染培養(yǎng)基殺死上次劃線結束后殘留菌種及時殺死接種環(huán)上殘留菌種，防止污染環(huán)境和操作者。問題1：第一步灼燒接種環(huán)目標：問題討論選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第29頁2.在灼燒接種環(huán)之后，為何要等其冷卻后再進行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后劃線操作時，為何總是從上一次劃線末端開始劃線？

答：線條末端細菌數目比線條起始處要少，每次從上一次劃線末端開始，能使細菌數目伴隨劃線次數增加而逐步降低，最終能得到由單個細菌繁殖而來菌落。選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第30頁4.為何不能劃破培養(yǎng)基？一旦劃破，會造成劃線不均勻，難以到達分離單菌落目標；二是存留在劃破處單個細胞無法形成規(guī)矩菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個條狀菌落。選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第31頁6支試管，分別加入9ml無菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106⑵稀釋涂布平板法：a.梯度稀釋菌液：菌液選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第32頁⑵稀釋涂布平板法：a.梯度稀釋菌液：b.涂布平板：不超出0.1ml各梯度分別涂布3個平板1個不涂布作空白對照滴灼試涂稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第33頁⑴平板劃線法：二.大腸桿菌純化培養(yǎng)：㈠制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基㈡純化大腸桿菌：1.接種：⑵稀釋涂布平板法：2.培養(yǎng)：將接種后培養(yǎng)基和一個未接種培養(yǎng)基放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h后，觀察并統計選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第34頁微生物培養(yǎng)與觀察選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第35頁大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂(EMB)上經典特征

在普通瓊脂培養(yǎng)基上：圓形，邊緣整齊，表面光滑，半透明。經典大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂平板上特征為:深紫黑色、光滑、濕潤、帶有金屬光澤圓形菌落。選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第36頁1.未接種培養(yǎng)基表面是否有菌落生長？假如有菌落生長，說明了什么？

2.在接種大腸桿菌培養(yǎng)基上，能否觀察到獨立菌落？它們大小、形狀、顏色相同嗎？

五、結果分析與評價若有，說明培養(yǎng)基滅菌不徹底

相同菌落，接種符合要求選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第37頁3.培養(yǎng)12h和24h后，觀察到試驗結果相同嗎？假如不一樣，請分析產生差異原因？4.假如在培養(yǎng)基上觀察到不一樣形態(tài)菌落，請分析其可能原因。

大小會有顯著不一樣無菌操作未到達要求：培養(yǎng)基滅菌不徹底；可能是接種時或培養(yǎng)時污染選修一微生物的實驗室培養(yǎng)專家講座第38頁六.菌種保藏1.暫時保藏：試管固體斜面培養(yǎng)基上4℃2.長久保留：菌種易被污染、變異甘油管藏1ml甘油＋1ml菌液－20℃斜面保藏