章核酸的理化性質(zhì)研究方法詳解演示文稿

章核酸的理化性質(zhì)研究方法詳解演示文稿當(dāng)前1頁，總共23頁。（優(yōu)選）章核酸的理化性質(zhì)研究方法當(dāng)前2頁，總共23頁。核酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)和作為高聚物決定其理化性質(zhì)：核酸的糖苷鍵和磷酸二酯鍵：可被水解；磷酸基和堿基：酸堿性質(zhì)；堿基：紫外吸收特性；雙螺旋結(jié)構(gòu)：變性和復(fù)性。當(dāng)前3頁，總共23頁。一、核酸的水解（一）酸水解糖苷鍵比磷酸酯鍵更易被酸水解，產(chǎn)生嘌呤和嘧啶堿（二）堿水解RNA的磷酸酯鍵更易被堿水解（RNA的核糖上有2’-OH，在堿作用下形成磷酸三酯，極不穩(wěn)定易水解，產(chǎn)生核苷2’，3’-環(huán)磷酸酯，繼續(xù)水解產(chǎn)生2’-核苷酸和3’-核苷酸）當(dāng)前4頁，總共23頁。（三）酶水解專一水解核酸的磷酸二酯鍵的酶稱為核酸酶(nuclease)。能識別特定的核苷酸順序，并從特定位點水解核酸的內(nèi)切酶稱為限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）。

當(dāng)前5頁，總共23頁。1、核酸酶的分類（1）按底物專一性分類：核糖核酸酶（ribonuclease,RNase）：作用于核糖核酸；脫氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease,DNase）：作用于脫氧核糖核酸；（2）按底物作用的方式分類：核酸外切酶（endonuclease）：從多核苷酸鏈的末端開始,逐個將核苷酸切下的酶；核酸內(nèi)切酶(exonuclease)：從多核苷酸鏈的內(nèi)部開始水解核酸的酶。當(dāng)前6頁，總共23頁。（3）按磷酸二酯鍵斷裂的方式分類：一種是在3’-OH與磷酸基之間斷裂，其產(chǎn)物是5’-磷酸核苷酸或寡核苷酸,如（1）；另一種是在5’-OH與磷酸基之間斷裂，其產(chǎn)物是3’-磷酸核苷酸或寡核苷酸,如（2）。PPPNNN(1)(2)(1)(2)5’3’當(dāng)前7頁，總共23頁。2、核糖核酸酶類牛胰核糖核酸酶、核糖核酸酶T1、核糖核酸酶T2等；3、脫氧核糖核酸酶類牛胰脫氧核糖核酸酶、牛脾脫氧核糖核酸酶、限制性內(nèi)切酶等。4、N－糖苷酶當(dāng)前8頁，總共23頁。核酸酶底物切點產(chǎn)物胰核糖核酸酶RNA內(nèi)切核酸酶嘧啶3’端，留下3’－P3’嘧啶單核苷酸或3’-嘧啶核苷酸結(jié)尾的寡聚核苷酸蛇毒磷酸二酯酶RNA，DNA外切核酸酶3’端，留下3’－OH5’－單核苷酸牛脾磷酸二酯酶RNA，DNA外切核酸酶5’端，留下5’－OH3’－單核苷酸大腸桿菌核酸外切酶Ⅰ單鏈DNA外切核酸酶5’端，留下5’－OH3’－單核苷酸及一個末尾二核苷酸大腸桿菌核酸外切酶Ⅲ雙鏈DNA外切核酸酶3’端，留下3’－OH5’－單核苷酸當(dāng)前9頁，總共23頁。當(dāng)前10頁，總共23頁。二、核酸的酸堿性質(zhì)1、堿基的解離C的N3有一對未共用電子，可與質(zhì)子結(jié)合；C的烯醇式羥基具有釋放質(zhì)子的能力；U的N3酸性解離的pK1’=9.5;T的N3酸性解離的pK1’=9.9;A的N1pK1’=4.15G的N7pK1’=3.2

N1pK2’=9.6；N9pK3’=12.4當(dāng)前11頁，總共23頁。2、核苷的解離戊糖的存在增強(qiáng)了堿基的酸性解離：A的N1pK1’由4.15降為3.63；C的pK1’由4.6降為4.15；當(dāng)前12頁，總共23頁。3、核苷酸的解離HpK1’＝1.5當(dāng)前13頁，總共23頁。核苷酸有磷酸與堿基，為兩性電介質(zhì)；U的堿基堿性極弱，不能形成兼性離子；A,G,C中，pK1’：第一磷酸基-PO3H2的解離；pK2’：含氮環(huán)＝N+H-的解離；pK3’：第二磷酸基-PO3H-的解離；故其pI＝（pK1’

+pK2’）／2DNA變性雙鏈打開后，堿基即參與酸堿滴定。

當(dāng)前14頁，總共23頁。三、核酸的紫外吸收Py和Pu有共軛雙鍵，使堿基、核苷、核苷酸和核酸能吸收紫外光，最大吸收峰為260nm。不同核苷酸當(dāng)前15頁，總共23頁。A260＝εCL公式中，A260為光密度

ε，為260nm處的堿苦摩爾消光系數(shù)

C，為每升溶液中堿基的摩爾數(shù)

L，為比色杯內(nèi)徑的厚度如：已知鳥嘌呤溶液的A260＝0.325，

ε＝7.2X103，L＝1cm，則：C＝0.325/(7.2X103X1)＝4.5X10-5（mol/l）紫外光區(qū)最大吸收：260nm，定性定量分析當(dāng)前16頁，總共23頁。第五節(jié)DNA的理化性質(zhì)及其應(yīng)用一、核酸的一般理化性質(zhì)核酸具有酸性；粘度大；當(dāng)前17頁，總共23頁。二、DNA的變性

在理化因素作用下，DNA雙螺旋的兩條互補(bǔ)鏈松散而分開成為單鏈，從而導(dǎo)致DNA的理化性質(zhì)及生物學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變，這種現(xiàn)象稱為DNA的變性(denaturation)

。變性時維持雙螺旋穩(wěn)定性的氫鍵斷裂，堿基間的堆積力遭到破壞，但不涉及到其一級結(jié)構(gòu)的改變。

當(dāng)前18頁，總共23頁。①增色效應(yīng)：指DNA變性后對260nm紫外光的光吸收度增加的現(xiàn)象；②旋光性下降；③粘度降低；④生物學(xué)功能喪失或改變。引起DNA變性的因素主要有：①高溫，②強(qiáng)酸、強(qiáng)堿，③有機(jī)溶劑等。DNA變性后的性質(zhì)改變：

當(dāng)前19頁，總共23頁。

DNA的變性溫度：加熱DNA溶液，使其對260nm紫外光的吸收度突然增加，達(dá)到其最大值一半時的溫度，就是DNA的變性溫度（融解溫度，Tm）。當(dāng)前20頁，總共23頁。

Tm的高低與DNA分子中G+C的含量有關(guān)，G+C的含量越高，則Tm越高。Tm＝69.3+0.41(％G＋C)12nd當(dāng)前21頁，總共23頁。三、DNA的復(fù)性與分子雜交將熱變性后的DNA溶液緩慢冷卻，在低于變性溫