發(fā)酵工業(yè)無(wú)菌技術(shù)

發(fā)酵工業(yè)無(wú)菌技術(shù)第1頁(yè)/共67頁(yè)4.1滅菌與消毒的區(qū)別滅菌：用物理或化學(xué)方法殺死或除去環(huán)境中所有微生物，包括營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌芽孢和孢子消毒：用物理或化學(xué)方法殺死物料、容器、器皿內(nèi)外的病源微生物。第2頁(yè)/共67頁(yè)培養(yǎng)基滅菌的目的

1，在發(fā)酵過(guò)程中夾雜其它雜菌造成的后果：生產(chǎn)菌和雜菌同時(shí)生長(zhǎng)，生產(chǎn)菌喪失生產(chǎn)能力；在連續(xù)發(fā)酵過(guò)程中，雜菌的生長(zhǎng)速度有時(shí)會(huì)比生產(chǎn)菌生長(zhǎng)得更快，結(jié)果使發(fā)酵罐中以雜菌為主；雜菌及其產(chǎn)生的物質(zhì)，使提取精制發(fā)生困難雜菌會(huì)降解目的產(chǎn)物；雜菌會(huì)污染最終產(chǎn)品，雜菌會(huì)污染最終產(chǎn)品；發(fā)酵時(shí)如污染噬菌體，可使生產(chǎn)菌發(fā)生溶菌現(xiàn)象。第3頁(yè)/共67頁(yè)2，工業(yè)上具體措施包括：（1）使用的培養(yǎng)基和設(shè)備須經(jīng)滅菌；（2）好氧培養(yǎng)中使用的空氣須除菌處理；（3）設(shè)備應(yīng)嚴(yán)密，發(fā)酵罐維持正壓環(huán)境；（4）培養(yǎng)過(guò)程中加入的物料應(yīng)經(jīng)過(guò)滅菌；（5）使用無(wú)污染的純粹種子。3，培養(yǎng)基滅菌的目的殺滅培養(yǎng)基中的微生物，為后續(xù)發(fā)酵過(guò)程創(chuàng)造無(wú)菌的條件。第4頁(yè)/共67頁(yè)4，培養(yǎng)基滅菌的要求（1）達(dá)到要求的無(wú)菌程度（10-3）（2）盡量減少營(yíng)養(yǎng)成分的破壞，在滅菌過(guò)程中，培養(yǎng)基組分的破壞，是由兩個(gè)基本類(lèi)型的反應(yīng)引起的：培養(yǎng)基中不同營(yíng)養(yǎng)成分間的相互作用；對(duì)熱不穩(wěn)定的組分如氨基酸和維生素等的分解。第5頁(yè)/共67頁(yè)4.2發(fā)酵工業(yè)污染的防治策略4.2.1污染的危害1.使生物反應(yīng)的基質(zhì)或產(chǎn)物，因雜菌的消耗而損失，造成生產(chǎn)能力的下降。2.雜菌也會(huì)產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，這就使產(chǎn)物的提取更加困難，造成得率降低，產(chǎn)品質(zhì)量下降。3.有些雜菌會(huì)分解產(chǎn)物，使生產(chǎn)失敗。4.雜菌大量繁殖后，會(huì)改變反應(yīng)液的pH值，使反應(yīng)異常。5.如果發(fā)生噬菌體污染，生產(chǎn)菌細(xì)胞將被裂解，使生產(chǎn)失敗。

第6頁(yè)/共67頁(yè)4.2.2雜菌污染的防治雜菌的檢查與類(lèi)型判斷顯微鏡檢查法平板劃線培養(yǎng)肉湯培養(yǎng)發(fā)酵過(guò)程的異常觀察法：溶解氧水平異常變化、通過(guò)傳感器或取樣分析觀察PH的變化、尾氣中CO2異常變化污染的原因分析種子帶菌、空氣帶菌、設(shè)備滲漏、滅菌不徹底、操作失誤和技術(shù)管理不善分析污染雜菌的種類(lèi)分析污染雜菌的時(shí)間分析污染雜菌的程度第7頁(yè)/共67頁(yè)雜菌污染的途徑及其預(yù)防種子帶菌及其預(yù)防：1.培養(yǎng)基及其器具徹底滅菌2.避免菌種在移接中污染3.避免菌種在培養(yǎng)和保藏中污染過(guò)濾空氣帶菌及其防治設(shè)備的滲漏或死角染菌及其防治培養(yǎng)基滅菌不徹底導(dǎo)致染菌及其防治操作不當(dāng)造成染菌噬菌體染菌及其防治第8頁(yè)/共67頁(yè)4.3發(fā)酵工業(yè)的無(wú)菌技術(shù)工業(yè)上具體措施包括：（1）使用的培養(yǎng)基和設(shè)備須經(jīng)滅菌；（2）好氧培養(yǎng)中使用的空氣應(yīng)經(jīng)除菌處理；（3）設(shè)備應(yīng)嚴(yán)密，發(fā)酵罐維持正壓環(huán)境；（4）培養(yǎng)過(guò)程中加入的物料應(yīng)經(jīng)過(guò)滅菌；（5）使用無(wú)污染的純粹種子。第9頁(yè)/共67頁(yè)滅菌的方法（1）化學(xué)法化學(xué)藥品滅菌法

（2）物理法干熱滅菌法濕熱滅菌法射線滅菌法過(guò)濾除菌法火焰滅菌法第10頁(yè)/共67頁(yè)4.4發(fā)酵培養(yǎng)基及設(shè)備管道滅菌4.4.1濕熱滅菌原理濕熱滅菌中的相關(guān)定義殺死微生物的極限溫度稱(chēng)為致死溫度。在致死溫度下，殺死全部微生物所需的時(shí)間稱(chēng)為致死時(shí)間；在致死溫度以上，溫度愈高，致死時(shí)間愈短。微生物的熱阻：是指微生物在某一特定條件（主要是溫度和加熱方式）下的致死時(shí)間。相對(duì)熱阻是指某一微生物在某條件下的致死時(shí)間與另一微生物在相同條件下的致死時(shí)間的比值。第11頁(yè)/共67頁(yè)微生物相對(duì)熱阻營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和酵母細(xì)菌芽孢霉菌孢子病毒和噬菌體1.03×1062~101~5各種微生物對(duì)濕熱的相對(duì)熱阻濕熱滅菌的優(yōu)點(diǎn)蒸汽來(lái)源容易，操作費(fèi)用低，本身無(wú)毒；蒸汽有強(qiáng)的穿透力，滅菌易于徹底；蒸汽有很大的潛熱；操作方便，易管理。第12頁(yè)/共67頁(yè)4.4.1濕熱滅菌的理論基礎(chǔ)

一，培養(yǎng)基濕熱滅菌需解決的工程問(wèn)題1.將培養(yǎng)基中的雜菌總數(shù)N0

殺滅到可以接受的總數(shù)N（10－3），需要多高的溫度、多長(zhǎng)的時(shí)間為合理。2.滅菌溫度和時(shí)間的確定取決于：（1）雜菌孢子的熱滅死動(dòng)力學(xué)（2）反應(yīng)器的形式和操作方式（3）培養(yǎng)基中有效成分受熱破壞的可接受范圍二、微生物的熱死滅動(dòng)力學(xué)方程第13頁(yè)/共67頁(yè)

實(shí)驗(yàn)證明，微生物營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的均相熱死滅動(dòng)力學(xué)符合化學(xué)反應(yīng)的一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，即：N：任一時(shí)刻的活細(xì)菌濃度（個(gè)/L）t：時(shí)間（min）活菌的減少率與N的關(guān)系第14頁(yè)/共67頁(yè)

K：比熱死速率常數(shù)（min-1）取邊界條件t=0，N=N0，對(duì)（1）積分得或第15頁(yè)/共67頁(yè)lnN0/N=kt2.303logN0/N=ktt=2.303/klogN0/N對(duì)數(shù)殘存規(guī)律工廠的經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)，高溫滅菌時(shí)間15－30s,維持8－25min。第16頁(yè)/共67頁(yè)培養(yǎng)基達(dá)到完全滅菌時(shí)，滅菌溫度和滅菌時(shí)間對(duì)培養(yǎng)基養(yǎng)分破壞的比較（以VitB1為準(zhǔn)）滅菌溫度0C滅菌時(shí)間min營(yíng)養(yǎng)成分破壞率（％）

10040099.3110366711515501204271300.581450.0821500.011第17頁(yè)/共67頁(yè)第18頁(yè)/共67頁(yè)4.4.2培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì)一、無(wú)菌的標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)微生物熱死滅方程，要求滅菌后達(dá)到絕對(duì)無(wú)菌是很難做到的，也是不必要的。因此在工程設(shè)計(jì)中常取N=10-3。二、分批滅菌分批滅菌的設(shè)計(jì)在發(fā)酵罐中進(jìn)行實(shí)罐滅菌，是典型的分批滅菌。全過(guò)程包括升溫、保溫、降溫三個(gè)過(guò)程。第19頁(yè)/共67頁(yè)第20頁(yè)/共67頁(yè)孢子熱死亡的規(guī)律符合

積分得（8）

在分批滅菌過(guò)程中

因?yàn)樯郎亍⒗鋮s階段T是時(shí)間t的函數(shù)，K不是常數(shù)，所以：

式中Kh是保溫階段的孢子比熱死亡速度常數(shù)第21頁(yè)/共67頁(yè)保證間歇滅菌成功的要素（1）內(nèi)部結(jié)構(gòu)合理(主要是無(wú)死角)，焊縫及軸封裝置可靠，蛇管無(wú)穿孔現(xiàn)象（2）壓力穩(wěn)定的蒸汽（3）合理的操作方法。發(fā)酵罐的接管圖第22頁(yè)/共67頁(yè)培養(yǎng)基間歇滅菌過(guò)程中應(yīng)注意的問(wèn)題（1）溫度和壓力的關(guān)系（2）泡沫問(wèn)題（3）投料過(guò)程中，麩皮和豆餅粉等固形物在罐壁上殘留的問(wèn)題（4）滅菌結(jié)束后應(yīng)立即引入無(wú)菌空氣保壓三、連續(xù)滅菌的設(shè)計(jì)1，連續(xù)滅菌的流程（1）噴射加熱連續(xù)滅菌噴射加熱連續(xù)滅菌流程第23頁(yè)/共67頁(yè)典型的噴射加熱連續(xù)滅菌時(shí)的溫度和時(shí)間曲線圖（2）薄板換熱器連續(xù)滅菌薄板換熱器連續(xù)滅菌流程第24頁(yè)/共67頁(yè)薄板換熱器連續(xù)滅菌時(shí)的溫度和時(shí)間曲線圖（3）噴淋冷卻連續(xù)滅菌噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程第25頁(yè)/共67頁(yè)連消器噴射加熱器第26頁(yè)/共67頁(yè)薄板換熱器維持罐第27頁(yè)/共67頁(yè)第28頁(yè)/共67頁(yè)第29頁(yè)/共67頁(yè)四、連續(xù)滅菌與間歇滅菌的比較1，連續(xù)滅菌的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)–保留較多的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量–容易放大–較易自動(dòng)控制；–糖受蒸汽的影響較少；–縮短滅菌周期；–在某些情況下，可使發(fā)酵罐的腐蝕減少；–發(fā)酵罐利用率高；–蒸汽負(fù)荷均勻。缺點(diǎn)–設(shè)備比較復(fù)雜，投資較大。第30頁(yè)/共67頁(yè)優(yōu)點(diǎn)–設(shè)備投資較少–染菌的危險(xiǎn)性較小–人工操作較方便–對(duì)培養(yǎng)基中固體物質(zhì)含量較多時(shí)更為適宜缺點(diǎn)–滅菌過(guò)程中蒸汽用量變化大，造成鍋爐負(fù)荷波動(dòng)大，一般只限于中小型發(fā)酵裝置。2，分批滅菌的優(yōu)缺點(diǎn)五、影響滅菌的因素第31頁(yè)/共67頁(yè)

采用一臺(tái)連續(xù)滅菌設(shè)備，培養(yǎng)液流量為18m3/h，發(fā)酵罐裝料量為36m3，原始污染度為106個(gè)，要求滅菌度N＝10-3個(gè)罐，滅菌溫度為398k，查圖得此時(shí)得反應(yīng)速度常數(shù)＝11min-1，試求維持時(shí)間t。第32頁(yè)/共67頁(yè)解：發(fā)酵罐培養(yǎng)液原有菌數(shù)：＝36×106×103×103＝3.6

×1013(個(gè)/罐）

由公式得：

t=2.303/klgN0/N第33頁(yè)/共67頁(yè)（1）培養(yǎng)基成分對(duì)滅菌的影響油脂，糖類(lèi)及一定濃度的蛋白質(zhì)可增加微生物的耐熱性，另一些物質(zhì)，如高濃度的鹽類(lèi)，色素等可削弱其耐熱性。（2）培養(yǎng)基的物理狀態(tài)對(duì)滅菌的影響（3）培養(yǎng)基中微生物數(shù)量對(duì)滅菌的影響（4）培養(yǎng)基中氫離子濃度對(duì)滅菌的影響培養(yǎng)基中氫離子濃度直接影響滅菌的效果。培養(yǎng)基的酸堿度越大，所需殺滅微生物的溫度越低。第34頁(yè)/共67頁(yè)（5）微生物細(xì)胞中水分對(duì)滅菌的影響細(xì)胞含水越多，蛋白質(zhì)變性的溫度越低（6）微生物細(xì)胞菌齡對(duì)滅菌的影響老細(xì)胞水分含量低、低齡細(xì)胞水分含量高（7）空氣排除情況對(duì)滅菌的影響（8）攪拌對(duì)滅菌的影響（9）泡沫對(duì)滅菌的影響第35頁(yè)/共67頁(yè)六、發(fā)酵罐的滅菌

培養(yǎng)基的滅菌如果是采用連續(xù)滅菌法。則發(fā)酵罐應(yīng)在加入滅菌的培養(yǎng)基前先行單獨(dú)滅菌。通常是用蒸汽加熱發(fā)酵罐的夾套或蛇管并從空氣分布管中通入蒸汽，充滿整個(gè)容器后，再?gòu)呐艢夤苤芯従徟懦?。容器?nèi)的蒸汽壓力保持1公斤，20分鐘。在保溫結(jié)束后，關(guān)鍵是隨即通入無(wú)菌空氣，使容器保持正壓，防止形成真空而吸入帶菌的空氣。七、補(bǔ)料液的滅菌

在發(fā)酵過(guò)程中，往往要向發(fā)酵罐中補(bǔ)入各種不同的料液。這些料液都必需經(jīng)過(guò)滅菌。滅菌的方法則視料液的性質(zhì)、體積和補(bǔ)料速率而定。如果補(bǔ)料量較大，而具有連續(xù)性時(shí)，則采用連續(xù)滅菌較為合適。也有利用過(guò)濾法對(duì)另補(bǔ)料液進(jìn)行除菌。補(bǔ)料液的分批滅菌，通常是向盛有物料的容器中直接通入蒸汽。所有的附屬設(shè)備和管道都要經(jīng)過(guò)滅菌。第36頁(yè)/共67頁(yè)4.5空氣除菌4.5.1空氣中微生物的分布和發(fā)酵工業(yè)對(duì)空氣無(wú)菌程度的要求無(wú)菌空氣的概念

通過(guò)除菌處理使空氣中含菌量降低在一個(gè)極低的百分?jǐn)?shù)，從而能控制發(fā)酵污染至極小機(jī)會(huì)。此種空氣稱(chēng)為“無(wú)菌空氣”?？諝庵形⑸锏姆植家话阍O(shè)計(jì)時(shí)以含量為103~104個(gè)／m3進(jìn)行計(jì)算。第37頁(yè)/共67頁(yè)提問(wèn)引出新課請(qǐng)問(wèn)你在實(shí)驗(yàn)室已接觸過(guò)哪些“無(wú)菌空氣”的例子？第38頁(yè)/共67頁(yè)發(fā)酵對(duì)空氣無(wú)菌程度的要求酵母菌培養(yǎng)氨基酸液體曲抗生素一般按染菌機(jī)率為10-3來(lái)計(jì)算，即1000次發(fā)酵周期所用的無(wú)菌空氣只允許1~2次染菌。第39頁(yè)/共67頁(yè)4.5.2空氣除菌方法1、輻射滅菌α射線、X射線、β射線、γ射線、紫外線、超聲波2、加熱滅菌利用空壓機(jī)所產(chǎn)生的熱來(lái)進(jìn)行滅菌第40頁(yè)/共67頁(yè)3、靜電除菌對(duì)1μm的微粒去除率達(dá)99％，消耗能量小，每處理1000m3的空氣每小時(shí)只耗電0.4~0.8kW?？諝獾膲毫p失小，一般僅(3~15)×133.3Pa。但對(duì)設(shè)備維護(hù)和安全技術(shù)措施要求較高。靜電除塵器1-鋼絲（電暈電極）；2-鋼管（沉淀電極）；3-高壓絕緣瓷瓶；4-鋼板；5-空氣出口；6-封頭；7-鋼板；8-法蘭；9-空氣出口第41頁(yè)/共67頁(yè)用靜電除菌凈化空氣有如下優(yōu)點(diǎn)：(1)阻力小，約1.01325×104Pa；(2)染菌率低，平均低于10~15％；(3)除水、除油的效果好；(4)耗電少。

缺點(diǎn)是設(shè)備龐大，需要采用高壓電技術(shù)，且一次性投資較大；對(duì)發(fā)酵工業(yè)來(lái)說(shuō)，—其捕集率尚嫌不夠，需要采取其它措施。4、介質(zhì)過(guò)濾常用的過(guò)濾介質(zhì)：棉花、玻璃纖維、活性炭、超細(xì)玻璃纖維紙、石棉濾板、燒結(jié)材料、新型過(guò)濾介質(zhì)。第42頁(yè)/共67頁(yè)4.5.3空氣過(guò)濾除菌（一）、空氣過(guò)濾除菌流程第43頁(yè)/共67頁(yè)第44頁(yè)/共67頁(yè)1、高空采風(fēng)、兩次冷卻、兩次分油水、適當(dāng)加熱流程

特點(diǎn)：兩次冷卻、兩次分油水、適當(dāng)加熱?？諝獾谝淮卫鋮s到30～35℃，第二級(jí)冷卻至20～25℃，經(jīng)分水后加熱到30～35℃，因?yàn)闇囟壬?，相?duì)濕度下降。第45頁(yè)/共67頁(yè)第46頁(yè)/共67頁(yè)

2、冷熱空氣直接混合式空氣除菌流程

特點(diǎn)：省去一級(jí)冷卻和分離設(shè)備及空氣再加熱設(shè)備，簡(jiǎn)化了流程，使冷卻水用量也降低了。壓縮空氣從貯罐出來(lái)分兩路，一部分進(jìn)冷卻器，經(jīng)分離器分離水、油霧后與另一部分未處理過(guò)的高溫壓縮空氣混合，使混合后的空氣溫度為30～35℃，相對(duì)濕度為50～60%。

第47頁(yè)/共67頁(yè)第48頁(yè)/共67頁(yè)其他幾種空氣除菌流程第49頁(yè)/共67頁(yè)高效前置過(guò)濾除菌流程

在壓縮機(jī)前設(shè)置一臺(tái)高效過(guò)濾器，這樣便可降低過(guò)濾器負(fù)荷（即多次過(guò)濾），達(dá)到空氣除菌的要求。

第50頁(yè)/共67頁(yè)第51頁(yè)/共67頁(yè)第