微生物病理技能訓(xùn)練教程

目錄TOC\o"1-2"\h\z\u第一部分微生物病理基礎(chǔ)知識(shí) 11－1鞭毛菌亞門及其所致病害的特點(diǎn) 11－2接合菌亞門及其所致病害的特點(diǎn) 31－3子囊菌亞門及其所致病害的特點(diǎn) 41－4擔(dān)子菌亞門及其所致病害的特點(diǎn) 71－5半知菌亞門及其所致病害的特點(diǎn) 8第二部分微生物病理實(shí)驗(yàn)基本操作 92－1植物病理徒手制片技術(shù) 92－2培養(yǎng)基的配制和滅菌 112－3植物病原菌的分離和培養(yǎng) 152－4真菌孢子的萌發(fā) 182－5植物病原物的接種 202－6植物病原生物繪圖技術(shù) 21第三部分微生物病理技能訓(xùn)練 23實(shí)訓(xùn)一植物病原細(xì)菌觀察 23實(shí)訓(xùn)二鞭毛菌亞門真菌及其所致病害癥狀觀察 25實(shí)訓(xùn)三接合菌亞門真菌及其所致病害癥狀觀察 29實(shí)訓(xùn)四子囊菌亞門真菌及其所致病害癥狀觀 30實(shí)訓(xùn)五擔(dān)子菌亞門真菌及其所致病害癥狀觀察 35實(shí)訓(xùn)六半知菌亞門真菌及其所致病害癥狀觀察 38微生物病理技能訓(xùn)練教程第一部分微生物病理基礎(chǔ)知識(shí)1－1鞭毛菌亞門及其所致病害的特點(diǎn)1、鞭毛菌亞門的主要特點(diǎn)(1)鞭毛菌亞門真菌的共同特征是無性產(chǎn)生具1-2根鞭毛的游動(dòng)孢子，因此通常稱作鞭毛菌。(2)鞭毛菌有性產(chǎn)生休眠孢子囊和卵孢子。(3)鞭毛菌營養(yǎng)體從原質(zhì)團(tuán)到無隔菌絲體，屬低等真菌。(4)鞭毛菌大多具有水生習(xí)性，因此只有在高濕、多雨、低洼積水和通風(fēng)透光不好的條件下，侵染植物導(dǎo)致病害。(5)鞭毛菌繁殖時(shí)，有的整個(gè)營養(yǎng)體全部轉(zhuǎn)變?yōu)榉敝丑w，稱為整體產(chǎn)果，如壺菌；有的只是營養(yǎng)體的一部分轉(zhuǎn)變?yōu)闋I養(yǎng)體，稱為分體產(chǎn)果。(6)游動(dòng)孢子囊形態(tài)多樣，均可釋放游動(dòng)孢子。(7)游動(dòng)孢子具1-2根鞭毛。鞭毛有茸鞭和尾鞭兩種。每個(gè)游動(dòng)孢子具單鞭或雙鞭兩種類型。(8)鞭毛(Flagellum)的結(jié)構(gòu)是9+2型。既鞭桿是由9根纖絲組成一個(gè)圓筒型體，圓筒型體中心還有2根纖絲。纖絲之間填充有膠質(zhì)鞘。共31條亞纖絲。2、鞭毛菌亞門的致病特點(diǎn)(1)常見癥狀：腐爛、斑點(diǎn)、猝倒、流膠。(2)果實(shí)上腐爛使果變褐色、呈軟腐狀，病部長出白色綿毛狀或灰白色霜狀霉層。(3)莖基和根部被害使皮層變褐色腐爛。(4)葉上斑點(diǎn)，若由疫霉引起，病斑較大，暗褐色圓形水漬病斑；若由霜霉引起，病斑較小，黃色至褐色，邊緣不明顯，病斑受葉脈限制呈多角形，后期在病斑上長出白色至灰白色霜狀霉層。(5)病菌以卵孢子越冬，由孢子囊和游動(dòng)孢子引起初侵染和再侵染，借雨水和氣流傳播。(6)潛伏期短，可多次再侵染，一般在低溫多雨潮濕多霧、晝夜溫差大的氣候條件下，病害容易發(fā)生。3、與園藝植物有關(guān)的鞭毛菌(1)根腫菌屬（Plasmodiophora）由根腫菌屬的病菌引起的，在病組織內(nèi)這些呈魚卵狀排列的是病菌的休眠孢子囊。休眠孢子囊在寄主細(xì)胞內(nèi)分散呈魚卵塊狀，萌發(fā)時(shí)產(chǎn)生前端有2根鞭毛長短不一的游動(dòng)孢子。休眠孢子囊對(duì)不適宜的環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，能在土中存活多年，是病菌的初侵染源。（2）腐霉屬（Pythium）①腐霉是低等的鞭毛菌，無性繁殖在菌絲頂端形成孢子囊，孢子囊近球形或不規(guī)則形，成熟后一般不脫落，萌發(fā)時(shí)產(chǎn)生游動(dòng)孢子。②有性繁殖在藏卵器內(nèi)形成一個(gè)卵孢子。③如引起黃瓜、茄子等幼苗瘁倒病的病菌，都屬于腐霉屬。(3)疫霉屬（Phytophthora）①孢子囊在孢囊梗上，孢囊梗無限生長。②孢子囊卵圓形，成熟時(shí)脫落，萌發(fā)時(shí)產(chǎn)生游動(dòng)孢子，或直接萌發(fā)長出芽管。③有性生殖在藏卵器內(nèi)形成一個(gè)卵孢子。(4)霜霉科（Peronosporaaceae）①高等的鞭毛菌，都是植物體上的活體寄生菌，菌絲蔓延在寄生的細(xì)胞間，以吸器伸入寄主的細(xì)胞內(nèi)吸收養(yǎng)分。②孢囊梗有限生長，呈樹枝狀分枝。③孢子囊在孢囊梗上形成，孢子囊卵圓形，頂端乳頭狀突起，萌發(fā)產(chǎn)生游動(dòng)孢子，或直接長出芽管。④有性生殖形成卵孢子。(5)白銹菌屬(Albugo)①活體寄生物，菌絲在寄主細(xì)胞間蔓延，以吸器伸入寄主細(xì)胞內(nèi)吸收營養(yǎng)。②孢囊梗不分枝，短棍棒狀，密集在寄主表下，排列成柵欄狀，每一孢囊梗頂端串生孢子囊。③孢子囊橢圓形，成熟后寄主表皮散出如白銹粉。④卵孢子壁厚，表面有瘤狀突起。1－2接合菌亞門及其所致病害的特點(diǎn)1、接合菌亞門的主要特點(diǎn)（1）菌絲體無隔多核，細(xì)胞壁由甲殼質(zhì)組成。（2）無性生殖形成孢子囊，產(chǎn)生不能游動(dòng)的孢囊孢子。（3）有性生殖形成接合孢子。2、接合菌亞門的致病特點(diǎn)其多為腐生菌，廣泛分布于土壤和糞肥中，少數(shù)為弱寄生菌，可引起果實(shí)貯藏期腐爛。已知接合菌亞門分2個(gè)綱、7個(gè)目、約600個(gè)種。與園藝植物病害有關(guān)的是接合菌綱、毛霉目、根霉屬。3、與園藝植物有關(guān)的接合菌根霉菌（Rhizopus）（1）菌絲發(fā)達(dá)，分布在基物上和基物內(nèi)，有匍匐絲和假根。（2）孢囊梗從匍匐絲上長出，頂端形成孢子囊，內(nèi)生孢囊孢子，孢子囊壁破散出孢囊孢子。（3）有性生殖形成接合孢子（不常見）。（4）黑根霉引起貯藏甘薯軟腐病。1－3子囊菌亞門及其所致病害的特點(diǎn)1、

子囊菌亞門的主要特點(diǎn)（1）營養(yǎng)體全世界發(fā)現(xiàn)32,000種，占真菌的1/3，都是高等真菌，寄生，形態(tài)千差萬別，但共同點(diǎn)是形成子囊。子囊(Ascus)，子囊孢子(Ascospore)。簡單的僅為單細(xì)胞，但大多數(shù)有發(fā)達(dá)的菌絲體，菌絲有隔，每個(gè)細(xì)胞有一個(gè)、二個(gè)、多個(gè)核，壁以幾丁質(zhì)為主，營養(yǎng)體可以形成厚垣孢子。有的菌絲可以直接形成粉孢子，芽孢子。很多可以形成營養(yǎng)菌絲的組織體。（2）子囊菌的無性繁殖產(chǎn)生分生孢子或孢子器，非常發(fā)達(dá)，形狀多樣，圓形，卵形，棒形，絲狀，鐮刀形(新月形)，蠟?zāi)c形，有單孢，雙孢，多孢。有的有色，有的無色。分生孢子梗：可以分枝或不分枝，散生，叢生，束生，(孢梗束Coremium)，有的分生孢子梗著生在簡單的分生孢子痤上(Sporodochium)，有的形成在分生孢子盤上(Acervulus)，有的形成分生孢子器上(Pycnidium)。分生孢子作用：在一個(gè)生長季可以反復(fù)發(fā)生，是再侵染的來源，“可以遠(yuǎn)距離傳播”，有的高等子囊菌在一生中僅發(fā)生無性，無有性。（3）子囊菌的有性繁殖①子囊：子囊形狀有圓形，橢圓形或棒狀。子囊壁有的單層壁，有的雙層壁,有的囊壁成熟后溶解，有的不溶，有的子囊頂有孔口，有的無孔口。子囊有的單個(gè)散生，有的多個(gè)并列，有的叢生。子囊之間的有的有側(cè)絲。②子囊孢子（Ascospore）：形態(tài)多種多樣，圓形，橢圓形，絲狀，單胞，雙胞，多胞，無色或有色。在子囊內(nèi)排列的有散生，單列，雙列，并列，螺旋形排列。③子囊果（Ascocarp）：在子囊外部具一菌組織包被的殼，這種類型的子實(shí)體稱子囊果。子囊果的類型A、閉囊殼—完全封閉呈球形。B、子囊殼—球形或瓶狀，頂端有孔口。C、子囊盤—盤狀或杯狀，頂端開口大。D、子囊座—子囊著生在子座的空腔內(nèi)。2、

與園藝植物有關(guān)的子囊菌(1)外囊菌屬（Taphrina）無子囊果，子囊平行排列在寄主表面呈柵狀。無性繁殖是子囊孢子在子囊內(nèi)芽殖產(chǎn)生芽孢子，芽孢子還可繼續(xù)芽殖。常見病狀：畸形，葉片皺縮、果實(shí)膨大等。(2)白粉菌目(Eryshiphales)①

白粉菌目的真菌一般稱作白粉菌，引致各種植物白粉病(Powderymildew)。②

菌絲白色，大都表生，產(chǎn)生吸器吸取植物營養(yǎng)。③

主要寄生在葉片上，有的發(fā)生在新梢或芽上。在病部形成白粉或小黑點(diǎn)。④無性世代：非常發(fā)達(dá)，由菌絲形成分生孢子梗和分生孢子。分生孢子鏈生或單生，不斷產(chǎn)生。形成白粉。⑤有性世代：寄生后期在菌絲的上部形成閉囊殼(小黑點(diǎn))，有附屬絲，便于傳播。閉囊殼內(nèi)有一個(gè)或多個(gè)子囊，子囊內(nèi)有2-8個(gè)子囊孢子，子囊孢子單孢無色。⑥寄生專化性：專性寄生，有生理小種，寄主有8435種。有的白粉菌只有一種寄主，而一種寄主可寄生多種白粉菌。如：桑樹有桑表白粉，桑里白粉。柞樹有七種白粉病。⑦白粉病發(fā)生的條件：對(duì)溫度要求不嚴(yán)格，干旱地區(qū)、潮濕地區(qū)都可發(fā)生，白粉菌的孢子在水中反而不易發(fā)芽或破裂，在潮濕的空氣中易發(fā)芽，該孢子滲透壓很高，36-68個(gè)大氣壓，因此很易吸收周圍的空氣中的水分。⑧白粉菌分屬依據(jù)：閉囊殼附屬絲的形狀和殼內(nèi)子囊的數(shù)目。白粉菌（閉殼菌）：菌絲以吸器吸收營養(yǎng)；子囊著生在閉囊殼內(nèi)，外部有附著絲；菌絲分化成分生孢子梗，頂端串生分生孢子，呈白粉狀故名白粉菌。(3)核菌①主要特點(diǎn)A、這類真菌種類多，形態(tài)變化大，子囊著生在具有孔口的子囊殼內(nèi)。B、子囊殼散生或聚生在寄主的組織中，子囊內(nèi)具8個(gè)子囊孢子。C、病害流行是分生孢子多次再侵染。D、病害癥狀：引起樹皮腐爛、潰瘍、瘤腫和枝枯；侵害果實(shí)引起腐爛和輪紋等癥狀。②主要種類A、小叢殼屬Glomerella子囊殼小，球形，半埋生在子座內(nèi)；子囊棍棒狀，無側(cè)絲；子囊孢子單孢無色，長橢圓形，稍彎曲。有性世代在自然界很少發(fā)生，無性世代為炭疽菌屬(Colletotrichum)。如棉花炭疽病G.gossypii，蘋果梨炭疽病G.cingulata。B、黑腐皮殼屬（Valsa）子囊殼埋生子座基部，有長頸伸出子座；子囊孢子臘腸狀，單胞無色或暗色。無性世代是殼囊孢屬(Cytospora)。只能為害樹皮，不能為害綠色部分。蘋果樹腐爛病。C、囊孢殼屬（Physalospora）無子座。子囊殼黑色，埋生于寄主組織內(nèi)。子囊較大，棍棒狀，子囊孢子單胞，無色，長度一般大于20um.引起園藝病害如梨輪紋病等。D、間座殼屬（Diaporthe）子囊殼埋生在子座基部，梨形或球形，黑色，頂端有短喙?fàn)钔黄稹Ｗ幽覉A柱形，有頂環(huán)。子囊孢子線形多胞。無性世代不發(fā)生。如引起茄褐紋病。（4）腔菌①主要特點(diǎn)A、子囊著生在子座的空腔內(nèi)，子囊間無側(cè)絲，子囊具雙層壁。B、無性生殖發(fā)達(dá)，可形成各種形態(tài)的分生孢子，對(duì)植物危害主要是分生孢子侵染。C、病害癥狀：斑點(diǎn)、瘡痂和腐爛。②主要種類A、痂囊腔菌屬Elsinoe子囊在子囊腔中不規(guī)則散生，每個(gè)子囊腔只有一個(gè)球形子囊，子囊孢子長圓筒形，3隔4胞、無色。為害植物主要是無性世代，在分生孢子盤上產(chǎn)生分生孢子。(痂圓孢屬Sphaceloma)我國有性世代未發(fā)現(xiàn)，主要無性。代表：葡萄黑痘病。球座菌屬GuignardiaB、球座菌屬Guignardia本屬與上屬形態(tài)基本一致，本屬子囊孢子單胞（假雙孢）。無性世代很發(fā)達(dá)，包括在葉點(diǎn)菌屬和莖點(diǎn)菌屬。葡萄黑腐病菌G.biwellii，葡萄房枯病菌G.baccae。C、球腔菌屬M(fèi)ycosphaerella子囊座著生在寄主葉片表皮層下；假囊殼為埋生、球形，或扁圓形，孔口扁平或呈乳頭狀突起。子囊孢子橢圓形、無色，雙胞大小相等。無性世代包括許多屬，如葉點(diǎn)菌屬Phyllosticta，莖點(diǎn)菌屬Phoma，尾孢屬Cercospora。代表：禾本科植物黑霉病D、黑星菌屬Venturia假子囊殼很小，表面生有剛毛，埋生或表生。子囊孢子橢圓形，雙胞大小不等，淡色，個(gè)別褐色，可為害植物葉片和果實(shí)。無性黑星孢Fusicladium代表病害：梨黑星病V.pirina蘋果黑星病V.inaequelis（5）盤菌①子囊果呈盤狀或杯狀，內(nèi)生子囊。②子囊盤有些從菌核或假根菌核上長出，③盤菌一般很多不產(chǎn)生分生孢子。④盤菌引起植物病害大多腐生，少數(shù)寄生。核盤菌屬Sclerotinia菌絲體可以形成菌核（真菌核和假菌核），菌核萌發(fā)后可形成長柄子囊盤，子囊棍棒狀，平行排列，有擬側(cè)絲。子囊孢子橢圓形或仿綞形，單胞無色。無性世代不發(fā)生。寄主范圍很廣，可侵染32科160多種植物。代表：油菜、向日葵菌核病1－4擔(dān)子菌亞門及其所致病害的特點(diǎn)1銹菌①膠銹菌屬（Gymnosporangium）冬孢子雙細(xì)胞，有可以膠化的長柄。沒有夏孢子階段。梨銹病（G.haraeanum）冬孢子階段在檜柏上，性孢子和銹孢子在梨樹上引起梨銹病。②柄銹菌屬(Puccinia)孢子雙細(xì)胞、有柄，夏孢子單細(xì)胞，小麥銹?。盒←湺掍P病(P.graminis)；小麥條銹病(P.striiformis)；小麥葉銹病(P.reconditef.sptritici)。③層銹菌屬（Phakopsora）冬孢子單細(xì)胞，無柄，不整齊地排列成數(shù)層；夏孢子表面有刺。[棗層銹菌（P.ziziphi-vulgaris）引起棗樹銹病]。④多胞銹菌屬（Phragmidium）冬孢子3至多細(xì)胞，壁厚，表面光滑或有瘤狀突起，柄的基部膨大。[玫瑰多胞銹菌（P.rosae-multiflorae）引起玫瑰銹病]。⑤單胞銹菌屬（Uromyces）冬孢子單細(xì)胞，有柄，頂壁較厚；夏孢子單細(xì)胞，有刺或瘤狀突起。[瘤頂單胞銹菌（U.appendiculatus）引起菜豆銹病]。⑥柵銹菌屬（Melampsora）冬孢子單細(xì)胞，無柄，排列成整齊的一層；夏孢子表面有疣或刺。[亞麻柵銹菌（M.lini）引起亞麻銹菌病]。（2）黑粉菌目（Ustilaginales）以雙核菌絲在寄主的細(xì)胞間寄生，有吸器伸入寄主細(xì)胞內(nèi)。典型特征是形成黑色粉狀的冬孢子。黑粉菌分類主要以冬孢子的形狀、大小、有無不孕細(xì)胞、萌發(fā)的方式及冬孢子球的形態(tài)等。引起園藝植物的病害有：茭白黑粉病、慈。（3）層菌病原菌特征：具較發(fā)達(dá)的擔(dān)子果，大多腐生，少數(shù)是植物病原菌。擔(dān)子果如膏藥狀、馬蹄狀、傘狀。層菌常產(chǎn)生有性孢子，很少產(chǎn)生無性孢子。病害主要通過土壤中的菌核、菌絲或菌索進(jìn)行傳播和蔓延。層菌是弱寄生菌，經(jīng)傷口侵入到果樹的根部或枝干的維管束，主要破壞木質(zhì)部，造成根腐或木腐。1－5半知菌亞門及其所致病害的特點(diǎn)1、半知菌亞門的主要特點(diǎn)常見的有4種：（1）分生孢子梗束（synnema）：呈束狀，基部聚生在一起，頂部分散，著生孢子。（2）分生孢子座（sporodochium）：很短的分生孢子梗聚集而成，墊狀或瘤狀，其上產(chǎn)生分生孢子。（3）分生孢子器（pycnidium）：分生孢子器（pycnidium）：球形、近球形、瓶狀或不規(guī)則形的子實(shí)體，具孔口，孢子梗聚生其內(nèi)。（4）分生孢子盤（acervulus）：菌絲糾結(jié)形成盤狀的子實(shí)體，有的分生孢子盤中央或四周具深褐色的剛毛。3、

與園藝植物有關(guān)的半知菌(1)叢梗孢菌①粉孢屬(Oidium)分生孢子梗直立。頂部產(chǎn)生菌鍵型的分生節(jié)孢子(粉孢子)。分生孢子串生，單胞無色。引起白粉病，為白粉菌的無性階段[橡膠粉孢(O.heveae)引起三葉橡膠樹的白粉病]。②輪枝孢屬(Verticillium)分生孢子梗輪狀分枝，產(chǎn)孢細(xì)胞基部略膨大；分生孢子為內(nèi)生芽殖型，單細(xì)胞，卵圓形至橢圓形，單生或聚生。〔黃萎輪枝孢(棉黃萎病菌V.albo-atrum)引起棉花黃萎病〕。③青霉屬(Penicillium)分生孢子梗直立，頂端一至多次分枝，形成掃帚狀。分枝頂端產(chǎn)生瓶狀小梗，小梗頂端產(chǎn)生成串的分生孢子，分生孢子球形、單孢。[指狀青霉病菌（P.digitatum）引起柑桔綠霉病]。④葡萄孢屬(Botrytis)分生孢子梗無色，頂端細(xì)胞膨大成球形，上面有許多小梗；分生孢子單胞，無色，橢圓形，著生小梗上聚集成葡萄穗狀。[灰葡萄孢(B.cinerea)引起多種植物灰霉病。]⑤褐孢屬(Fulvia)分生孢子梗黑色，頂端或中部形成分枝，分生孢子黑褐色，卵圓形、圓筒形或不規(guī)則形。引起的病害如番茄葉霉病、黃瓜黑星病等。⑥尾孢屬（Cercospora）分生孢子梗屈膝狀，青褐色至黑褐色，分生孢子多細(xì)胞，線形、鞭形至蠕蟲形。如花生褐斑病、菜豆紅斑病、豇豆煤霉病等。⑦鏈格孢屬(Alternaria)分生孢子梗深色，頂端單生或串生淡褐色至深褐色、磚隔狀的分生孢子。分生孢子倒棍棒形、橢圓形或卵圓形，頂端有喙?fàn)罴?xì)胞。[大孢鏈格孢(A.macrospora)引起棉花輪紋斑病]。⑧鐮孢霉屬(Fusarium)大型分生孢子多細(xì)胞，鐮刀型；小型分生孢子單細(xì)胞，橢圓形至卵圓形。麥類赤霉病，瓜類枯萎病。（2）黑盤孢菌黑盤孢目真菌的分生孢子梗產(chǎn)生在分生孢子盤上。有的分生孢子盤四周或分生孢子梗之間具有黑色的剛毛。黑盤孢目真菌引起的病害如蘋果褐斑病、蘋果、辣椒、茄子、黃瓜棉花等的炭疽病等。（3）球殼孢菌分生孢子器球形，暗褐色，分生孢子單胞，無色，圓柱形至紡錘形。分生孢子著生在分生孢子器內(nèi)。引起的病害如蘋果樹腐爛病、梨干腐病、蘋果及梨輪紋病、棉花褐斑病、芹菜斑枯病、茄子褐紋病等。（4）無孢菌:除產(chǎn)生厚垣孢子外，不產(chǎn)生任何其它孢子。只有菌絲體，有時(shí)可形成菌核。第二部分微生物病理實(shí)驗(yàn)基本操作2－1植物病理徒手制片技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

觀察植物病害病原物的形態(tài)，進(jìn)行病原物的分類鑒定，研究受病組織的組織結(jié)構(gòu)病變，受病植物組織與病原物的解剖學(xué)關(guān)系以及對(duì)于難得一見病原物的保存?zhèn)溆玫?，都需將材料制成適當(dāng)?shù)娘@微玻片標(biāo)本。因此，徒手制片技術(shù)也是植物病理學(xué)研究的重要手段之一。通過本次實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)學(xué)習(xí)實(shí)踐常用的徒手制片技術(shù)，為普通植物病理學(xué)和農(nóng)業(yè)植物病理學(xué)的深入學(xué)習(xí)以及以后開展病理學(xué)的有關(guān)研究工作奠定堅(jiān)實(shí)的制片技術(shù)基礎(chǔ)。二、內(nèi)容、材料和方法

徒手制片的方法有整體封藏法、徒手切片法、組織透明制片法和涂抹制片法等多種。限于時(shí)間本實(shí)驗(yàn)實(shí)踐最為常用的整體封藏法和徒手切片法兩種。(一)整體封藏法

對(duì)于生長在植物病部表面或培基上的菌絲體、分生孢子、分生孢子梗和其他孢子器官以及線蟲等，可直接擇取少許封藏在適當(dāng)?shù)母≥d劑中，在顯微鏡下觀察，根據(jù)材料的特點(diǎn)和觀察的目的可采用不同的方法封藏制片。常用的方法的概括為挑、刮、撥、撕四種。

1挑：對(duì)于在植物受病部位或基質(zhì)表面生長繁茂的霉?fàn)畈≡w(如霜霉菌)粉狀病原體(如銹菌、白粉菌)以及培養(yǎng)基上的許多培養(yǎng)菌，可用尖細(xì)的解剖針等直接挑取封埋制片，挑取病原體的量，在保證選材典型的前提下，越少越好，以免互相重疊，分辯不清。

取黃瓜霜霉病葉，小麥白粉病葉分別挑取霉?fàn)钗锖头蹱钗镧R檢病原菌的形態(tài)特點(diǎn)。

2刮：對(duì)病部病原體稀少，或用放大鏡也難辯認(rèn)霉層的病害標(biāo)本，可采用兩側(cè)具刀的三角刮針(或可用刀片代替)刮取病原物制片。刮的方法是，用刮針的一刃，蘸浮載劑少許，在病部順同一個(gè)方向刮取2—3次，將刮得的病原蘸在載玻片的浮載劑中封片鏡檢。浮載劑在保證浮載質(zhì)量的前提下要盡量少，否則少量的病原體在大滴的浮載劑中極易分散漂流，在顯微鏡下難以尋找。取玉米小斑病葉，在病斑背面刮制片，鏡檢分生孢子梗和分生孢子的形態(tài)。

3撥：對(duì)于產(chǎn)生在植物表皮下或半埋生于基物內(nèi)的病原體孢子器官。如子囊殼、分生孢子器、閉囊殼等，可將病原體連同寄主組織一同撥下，放入浮載劑中，用兩支解剖針，一支穩(wěn)定材料，另一支撥出植物組織，使病原體外露制片。取小麥全蝕病或白粉病標(biāo)本，撥小黑點(diǎn)制片，鏡檢子囊果的形態(tài)。

4撕：對(duì)于寄生在植物表皮細(xì)胞上的病原真菌，也可以將此有病原物的表皮撕下來制片鏡檢，這種方法不僅能看到病原物形態(tài)，而且可以觀察病原物與寄主的解剖學(xué)關(guān)系。

在毛毛雨天自田間取回感染白粉病的麥苗(或在保溫箱中取接種染病的麥苗)。用刀片割破葉背表皮再用小鑷子輕輕撕下，放在浮載劑中制片鏡檢白粉病菌分生孢子梗、分生孢子和吸器形態(tài)。(二)徒手切片法

欲觀察受病組織病變，病菌侵入和寄主體內(nèi)擴(kuò)展過程，以及埋生在基物內(nèi)真菌子實(shí)體的形態(tài)結(jié)構(gòu)等，都需將有關(guān)材料切成薄片，進(jìn)行鏡檢，徒手切片是最常用的簡便易行的方法，不需要特殊的設(shè)備，而且節(jié)省時(shí)間，切成的片子不僅可作臨時(shí)觀察，也可進(jìn)一步制成永久性玻片標(biāo)本。

徒手切片的基本用具是剃刀或刀片。切片時(shí)先選取材料并作適當(dāng)?shù)男拚宰笫值氖持负湍分改笞〔牧?，中指頂住材料下端，使材料上端突出于手指以?—3毫米。右手握穩(wěn)刀，從左向右后方斜向切割。注意刀口必須以材料面垂直。否則所得切面不正。同時(shí)雙手不應(yīng)緊靠身體，而是要活動(dòng)自如。用臂力均勻地沿刀口后部起拉向前方，連續(xù)切割4—5片后，用毛筆蘸水輕輕沿刀口取下，放入盛有水的淺玻皿中，在此過程中左手握著的材料不要放下，否則再切時(shí)難按原位置拿材料，此外，在切片過程中，必須常用毛筆蘸水濕潤材料，以免材料干涸不便切割。

對(duì)于過于柔軟或較薄的材料，可以夾在“夾持物”中，進(jìn)行切片更為方便。新鮮胡鮮卜和馬鈴薯塊都可作“夾持物”用。實(shí)驗(yàn)室中通常將通草、接骨木或向日葵的莖髓，剪成適當(dāng)大小，浸于70%酒精中備用。

切割一定數(shù)量的薄片后，用移置環(huán)在淺玻皿中選取合用的材料薄片，放在載玻片的水滴中，鏡檢合格者即酒精燈上將水烘干并擺正材料，然后加一滴乳酚油或其浮載劑；放在展片臺(tái)上略加熱，鏡檢如無氣泡，即可小心加蓋片，用吸水紙吸除多余的浮載劑，最后貼好標(biāo)簽，平放于切片板上，待干燥適宜時(shí)封固。

徒手切片的缺點(diǎn)是對(duì)于微小或過大，柔軟、多汁、肉質(zhì)及堅(jiān)硬的材料不易切取，也難制成連續(xù)切片，此外切片的厚薄也難一致。切片機(jī)切片即可克服這些缺點(diǎn)。三、作業(yè)和思考題

1每人交兩片符合質(zhì)量要求的玻片標(biāo)本。

2整體封藏法和徒手切片法兩種基本徒手制片技術(shù)都在什么情況下使用?徒手切法制片有什么優(yōu)缺點(diǎn)?怎樣解決這種方法本身存在的問題?2－2培養(yǎng)基的配制和滅菌一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康奈⑸锏纳L發(fā)育都有一定的營養(yǎng)需要，培養(yǎng)基即人工培養(yǎng)微生物、為其生長發(fā)育提供所需營養(yǎng)的基質(zhì)。培養(yǎng)基配好后必須經(jīng)過滅菌方能用于分離培養(yǎng)微生物試驗(yàn)，因此培養(yǎng)基的配制和滅菌是植物病理實(shí)驗(yàn)室中最基本的工作，通過本次實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)植病實(shí)驗(yàn)室中常用培養(yǎng)基的配制方法和高壓滅菌鍋的使用方法。二、內(nèi)容、材料和方法

(一)培養(yǎng)基的配制

培養(yǎng)基按組成成分及對(duì)這些成分了解的程度分為天然培養(yǎng)基、半組合培養(yǎng)基和組合培養(yǎng)基三類，從物理性質(zhì)上又分為液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基兩類，培養(yǎng)基的種類不同，配制方法也有差異，限于時(shí)間，本次實(shí)驗(yàn)僅配制馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。1馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）

這是植病實(shí)驗(yàn)室最常用的培養(yǎng)基(簡稱PSA)，主要用于植物病原真菌的分離和培養(yǎng)，有時(shí)也用于植物病原細(xì)菌。

成分：馬鈴薯200克蔗糖10克

瓊脂20克加水至1000毫升

方法：將馬鈴薯洗凈去皮切塊，加水煮沸半小時(shí)，用雙層紗布濾去薯塊，補(bǔ)足水量，加入瓊脂，加熱熔化，再加糖，待完全化后，乘熱用雙層紗布過濾分裝，塞好棉塞高壓滅菌。

馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基略帶酸性，培養(yǎng)真菌無需調(diào)節(jié)pH，培養(yǎng)細(xì)菌則調(diào)節(jié)pH至中性，此培養(yǎng)基留作下次實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)病原真菌用，故不必調(diào)節(jié)pH。

5人分作一組，1、2組各作此培養(yǎng)基500毫升，其中200毫升分裝試管，每管約10毫升，滅菌后擺成斜面；其余300毫升，分裝在3個(gè)250—300毫升的三角瓶中，每瓶裝100毫升左右，滅菌后妥善保存，留待下次實(shí)驗(yàn)使用。2牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）

這種培養(yǎng)基主要用于細(xì)菌的分離和培養(yǎng)

成分：牛肉浸膏3克蛋白胨10克蔗糖10克

酵母浸膏1克瓊脂20克加水至1000毫升

方法：先將瓊脂加熱熔化于大部水中，再將其它各成分用少量水化開加入，調(diào)節(jié)pH至7，趁熱用雙層紗布過濾，分裝，塞棉塞高壓滅菌。

牛肉浸膏和酵母浸膏十分粘稠，不易稱重，稱重時(shí)用小燒杯盛裝，以玻璃棒沾取，故要先稱好杯和棒的重量后，再開始沾取浸膏稱重，稱后將杯和棒上粘著的浸膏洗凈于鍋中。

調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至中性的方法如下：配成1N的HCl和NaOH，并另分別稀釋配成1/20N的HCl和NaOH。取培養(yǎng)基2毫升，加蒸餾水7.5毫升，加指示劑溴百里酚藍(lán)指示劑5滴，這時(shí)如培養(yǎng)基的測(cè)樣呈黃色則用有刻度吸管加入1/20N的NaOH若呈藍(lán)色則加入1/2ON的HCl，使培養(yǎng)基最后呈草綠色即調(diào)節(jié)到中性，此刻所加酸或堿的毫升數(shù)的25倍即等于在1000毫升培養(yǎng)基中所需要加入lN的NaOH或HCl的毫升數(shù)(注意這次是作500毫升培養(yǎng)基)，加蒸餾水稀釋的目的防止調(diào)節(jié)過程中培養(yǎng)基凝固。調(diào)節(jié)pH至中性的簡便方法是用石蕊示紙。也可以用多孔白色瓷板，在孔中加少量培養(yǎng)基和溴百里酚藍(lán)或其它指示劑1—2滴，根據(jù)顏色反應(yīng)，在所配的培養(yǎng)液中加入少量lN的NaOH或HCl，然后再取樣測(cè)定，如此反復(fù)多次，達(dá)到所需求的反應(yīng)為止。

5人分為一組，3、4兩組各作此培養(yǎng)基500毫升，其中200毫升分裝試管，每管約100毫升，滅菌后擺成斜面，其余300毫升分裝在3個(gè)250—300毫升的三角瓶中，每瓶裝100毫升左右，滅菌后妥善存放，留待下次實(shí)驗(yàn)使用。

圖：培養(yǎng)基的分裝裝置與棉塞。A.

培養(yǎng)基的分裝1.正確2.管內(nèi)太短，外部太松B.

棉塞的做法3.整個(gè)棉塞太松4.管內(nèi)太緊，外部太短松此外，1、2、3、4各組均制備15管試管裝和2瓶三角瓶裝的無菌水。(二)培養(yǎng)基的滅菌

為了得到某種病原物的純培養(yǎng)，配好的培養(yǎng)基必須經(jīng)過滅菌才能使用，滅菌是指用物理或化學(xué)方法完全殺死器物表面及其內(nèi)部的所有微生物，滅菌與消毒的概念不同，消毒則是指消滅器物或植物組織表面的某些微生物(能常稱雜菌)，而不是消滅所有的微生物。

滅菌的方法很多，植病實(shí)驗(yàn)室常用的有干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌兩種方法，一般培養(yǎng)皿、吸管等玻璃儀器用干熱滅菌法進(jìn)行滅菌。而培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)用的土壤，則用高壓蒸汽滅菌法進(jìn)行滅菌，具體滅菌方法和步驟如下：1干熱滅菌法

(1)將培養(yǎng)皿、吸管等玻璃器皿洗凈干燥后，用舊報(bào)紙包好，或裝入特制的鐵筒中(每個(gè)吸管用紙包好后裝入鐵筒)，包紙時(shí)應(yīng)將吸取的一端放在取時(shí)先折開的一端，以便取用時(shí)手勿觸及要求滅菌的一端。

(2)將包裝好的玻璃儀器擺入電熱烘箱中，彼此間留有一定的空隙以便流通空氣。

(3)關(guān)緊箱門，打開排氣孔接上電源。

(4)待箱內(nèi)空氣排出到一定程度時(shí)，閉上排氣孔，繼續(xù)加熱至一定溫度后，用定溫固定溫度，滅菌溫度一般165℃—175℃保持1小時(shí)即可。

(5)待自然降溫冷卻后(2高壓蒸汽滅菌法

高壓蒸汽滅菌法又稱濕熱滅菌，它的原理是利用高壓來提高蒸汽的溫度，達(dá)到滅菌的目的，其操作步驟如下：

(1)關(guān)好排水閥門放入清水至標(biāo)度為止，注意水量一定要加足，否則容易造成事故。

(2)將要滅菌的培養(yǎng)基、滅菌水等裝入鐵絲籠中，并用牛皮紙蓋好后放入滅菌鍋中，關(guān)上器蓋，旋緊螺旋時(shí)，先將每個(gè)螺旋旋轉(zhuǎn)到一定程度(不要太緊)，然后再旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺旋，以達(dá)到平衡旋緊，否則易造成漏氣，達(dá)不到徹底滅菌的目的。

(3)通電加溫，同時(shí)打開排氣活門，排盡鍋內(nèi)的空氣，即活門沖出的全部是蒸氣時(shí)則表示徹底，此時(shí)可關(guān)閉排氣活門，如果過早關(guān)閉活門，排氣不徹底，也達(dá)不到徹底滅菌的目的。通常當(dāng)壓力表指針升至5磅時(shí)，打開排氣活門放氣，降至零點(diǎn)，再關(guān)閉活門。

(4)壓力表的指針上升時(shí)，鍋內(nèi)溫度也逐漸升高，當(dāng)壓力表指針升至15磅時(shí)，蒸氣溫度相當(dāng)于120℃—121℃(等于一個(gè)大氣壓)，此時(shí)開始計(jì)算滅菌時(shí)間，控制熱源，使處于15磅壓力保持30分鐘，即能達(dá)到完全滅菌的目的，然后停止加溫。

(5)稍微打開一點(diǎn)排氣活門，使鍋內(nèi)蒸氣緩慢排除，然后逐漸開大活門，氣壓徐徐下降，注意勿使排氣過快，否則會(huì)使鍋內(nèi)的培養(yǎng)基沸騰而沖脫或沾濕棉花塞，但排氣太慢又使培養(yǎng)基在鍋內(nèi)，受高溫處理時(shí)間過長，這樣對(duì)培養(yǎng)基也是不利的。一般從排氣到打開鍋蓋以10分鐘左右為好。

(6)當(dāng)壓力表指針降到零、鍋內(nèi)蒸氣完全排盡時(shí)，打開鍋蓋取出培養(yǎng)基，如需制備固體斜面培養(yǎng)基時(shí)，則應(yīng)趁熱將試管斜放在桌上，上面蓋上報(bào)紙以免落灰塵，冷卻后便可收起。(7)最后將高壓滅菌器內(nèi)的剩余水排出。

(8)抽取上述滅菌的培養(yǎng)基，放入25℃三、思考題

1培養(yǎng)基有哪幾種類別?各有什么特點(diǎn)和用途?

2干熱滅菌和高壓蒸汽法適用范圍如何?電熱烘箱和高壓鍋如何操作?各有哪些使用注意事項(xiàng)?

3怎樣檢查培養(yǎng)基滅菌是否徹底?2－3植物病原菌的分離和培養(yǎng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

在研究病原菌的形態(tài)、生理、生態(tài)以及病原菌對(duì)寄主植物的致病性等多種試驗(yàn)中，常常需要病原菌的純培養(yǎng)物。然而，在自然情況下，病原菌通常是與其他雜菌混生在一起的，從受病組織或其他基物中將病原菌單獨(dú)分選出來，叫作分離。分離和培養(yǎng)是植病實(shí)驗(yàn)室最基本的操作技術(shù)之一。通過本次實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)植物病原菌分離培養(yǎng)的原理和常用的方法。二、內(nèi)容、材料和方法

(一)分離材料的選擇

分離材料的選擇對(duì)分離培養(yǎng)的成敗有著決定的影響，因?yàn)樵诟胁≈参锸芎Σ课坏膬?nèi)外，要有多種腐生菌，為減少腐生菌的污染，分離所用的病害材料應(yīng)盡可能新鮮，并且最好在病、健交接處選材取樣。病、健交接處，除材料新鮮，污染的可能性小外，病原菌的生活力強(qiáng)、比較活躍，容易分離成功。

(二)分離方法

病原菌分離的方法因材料不同而異，植病實(shí)驗(yàn)室最常見的方法有組織分離法和稀釋分離法兩種。

1.組織分離法：這種方法適用于大部分病菌的分離，此法又分為小塊組織分離和大塊組織分離兩種方法。分別以玉米大斑病、小麥根腐病和梨褐腐病為試材進(jìn)行。

(1)葉斑病類病原菌的分離（玉米大斑病病菌的分離）

取玉米大斑病病葉，在病、健交界處剪取2—3毫米長的病組織。用10%漂白粉（次氯酸鈣）溶液消毒（漂白粉溶液現(xiàn)用現(xiàn)配）3-5min，時(shí)間長短依病組織不同而異，然后直接移至PSA平板培養(yǎng)基上(為防止細(xì)菌污染，可在培養(yǎng)基中加入1000ppm鏈霉素10毫升)，倒置于20—25℃室溫下，待菌落長出后挑取前緣菌絲，回接于PSA斜面培養(yǎng)基上，在25℃溫箱中培養(yǎng)，待菌落顏色變深后，在無菌條件下鏡檢是否是玉米大斑病菌，弱僅有玉米大斑病菌的孢子，則說明已獲得了純培養(yǎng)，否則，則需要繼續(xù)轉(zhuǎn)至斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，直至獲得純培養(yǎng)。

(2)種子內(nèi)部病原菌的分離（小麥根腐病菌的分離）

選擇典型的小麥黑胚粒3—4個(gè)，在70%的酒精中浸2—3秒鐘后，以鑷子夾住投入0.1%升汞溶液中表面消毒2—3分鐘（處理時(shí)間可自30秒至30分鐘不等），然后取出小麥粒，以滅菌水沖洗3次，再移至已倒好的馬鈴薯瓊脂平板培養(yǎng)基上，注意要以小麥的黑胚部位著靠在培養(yǎng)基上，倒置在25℃溫箱中培養(yǎng)，待菌落長出后，挑取前緣菌絲于馬鈴薯斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)3-4天后，無菌條件下鏡檢是否獲得純培養(yǎng)。

(3)病組織內(nèi)部病原菌的分離（梨褐腐病菌的分離）

取梨褐腐病病果沾取95%酒精，用酒精火焰三次消毒后，以在燈焰滅過菌的解剖刀在果面病、健交界處切開，挑取豆粒大小的病組織放到馬鈴薯瓊脂平板培養(yǎng)基上，每皿放3—4塊，倒置于25℃溫箱中培養(yǎng)2—3天。菌絲長出后轉(zhuǎn)至馬鈴薯瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3-4天后，無菌條件下鏡檢是否獲得純培養(yǎng)。

2.稀釋分離法：稀釋分離法適用于細(xì)菌、土壤菌及產(chǎn)生孢子多的真菌等病原菌的分離，本次實(shí)驗(yàn)以白菜軟腐病作為材料進(jìn)行分類離。

白菜軟腐病最易伴生腐生細(xì)菌，分離時(shí)需以病組織接種健康菜幫上，經(jīng)數(shù)次轉(zhuǎn)種予以純化，其純化方法是將菜幫經(jīng)多次換水沖洗后，再用無菌水洗三次，切成適當(dāng)大小，放在15厘米直徑的培養(yǎng)皿中，菜幫下襯以吸水紙保溫。用無菌解剖刀挑取病組織少許抹在菜幫的人為傷口上，培養(yǎng)在20—25℃下，經(jīng)1天左右呈現(xiàn)腐爛，如此反復(fù)轉(zhuǎn)種幾次，至病斑純凈為止。

分離時(shí)，在新的水爛斑邊緣挑取少量病組織在無菌水試管中配成菌懸液，取滅菌培養(yǎng)皿3付，標(biāo)好次序，其內(nèi)各置無菌水1毫升，用移置環(huán)移取菌懸液一環(huán)，放在第1皿水中混合均勻，從中挑取一環(huán)稀釋液至第2皿，再以同法稀釋成第3皿，取熔化后冷至45℃左右的(一般將化好的培養(yǎng)基瓶靠近鼻尖，以不燙為度)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，每皿倒約15毫升，沿著桌面輕輕搖勻，凝固后倒置于26—28℃的溫箱中培養(yǎng)，1—2日后可見白色，圓形或近圓形直徑為1—2毫米的菌落，從中選典型菌落用移植環(huán)（劃線法）移入牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每組轉(zhuǎn)4—5管，注意過早出現(xiàn)的大型菌落多為腐生細(xì)菌。

以上分離實(shí)驗(yàn)也可以劃線法進(jìn)行，方法是先取兩付滅菌培養(yǎng)皿，每皿倒入約15毫升熔化的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，沿桌面輕輕搖勻，制成平板，然后用移置環(huán)沾取一環(huán)稀釋好的菌懸液，在第一個(gè)培養(yǎng)皿平面培養(yǎng)基的左方長方形區(qū)內(nèi)劃平行線5—7條，再以此移置環(huán)繼續(xù)向右(和左方小區(qū)內(nèi)的幾條平行線成一定角度)劃5—7條平行線，依此法劃兩皿，倒置于26平板劃線操作示意圖三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

(一)清潔環(huán)境：分離工作嚴(yán)格說應(yīng)在無菌條下進(jìn)行，無菌室或無菌箱是分離不可缺少的設(shè)施。若限于條件實(shí)驗(yàn)只能在普通房間進(jìn)行時(shí)，必須對(duì)房間進(jìn)行徹底掃除，清潔環(huán)境、搞好衛(wèi)生。地上多灑些水，以消除室內(nèi)塵埃，分離開始前準(zhǔn)備好一切用品，避免工作過程中頻繁走動(dòng)，以破壞環(huán)境帶來雜菌，工作臺(tái)上鋪好濕毛巾，點(diǎn)燃酒精燈。(二)實(shí)驗(yàn)材料及用品準(zhǔn)備

本次實(shí)驗(yàn)3-5人一組，請(qǐng)認(rèn)真檢查好下試材和用品是否齊備。

1病組織材料

小麥根腐病黑胚粒5粒。

玉米大斑病病葉1片。

白菜軟腐病病幫3塊(相鄰兩組共用)；

梨褐腐病病果1個(gè)(相鄰兩組共用)。

2用品準(zhǔn)備

0.1%升汞溶液(廣口瓶盛裝)；

95%酒精(廣口瓶盛裝)；

1000ppm鏈霉素；

瓶裝牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；

瓶裝馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基；

此外，還有以下備品，無菌水1瓶，滅菌培養(yǎng)皿6付，滅菌1毫升吸管2支，解剖剪、解剖刀和鑷子各1把，移植環(huán)，移植鉤、酒精燈、琺瑯盤和試管架各1個(gè)，毛巾1條，玻璃鉛筆1支及火柴等。四、思考題

1分離植物病原菌常用的方法有幾種?這些方法適用于分離哪類病原菌?怎樣分離?

2分離植物病原物時(shí)，為什么要選擇新鮮病材料，并且在病健交界處取樣?沒有新鮮病材料怎么辦?

3試分析分離工作成敗的原因。2－4真菌孢子的萌發(fā)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

欲了解病菌生活力的強(qiáng)弱，生存期的長短，有效傳播距離，抗藥性的大小，生活史，環(huán)境與發(fā)病的關(guān)系以及有些病菌的種類鑒定等，都必須進(jìn)行孢子萌發(fā)試驗(yàn)。孢子能否萌發(fā)，萌發(fā)率的高低，萌發(fā)勢(shì)的強(qiáng)弱以及萌發(fā)的方式等既受病菌自身內(nèi)在的因素影響，也受外界環(huán)境條件制約，因此要達(dá)到萌發(fā)試驗(yàn)的目的，必須充分掌握萌發(fā)所需的各種條件，本次實(shí)驗(yàn)主要學(xué)習(xí)孢子萌發(fā)常用的方法，同時(shí)通過實(shí)驗(yàn)理解各種孢子萌發(fā)所需條件不同。二、內(nèi)容、材料和方法

孢子萌發(fā)的方法很多，有些真菌的孢子須用特殊的方法才能萌發(fā)，以下僅實(shí)驗(yàn)常用的方法。

(一)懸滴法

1材料：玉米大斑病菌斜面菌種。

2方法：在潔凈的蓋玻片中央滴玉米大斑病菌孢子懸浮液一滴，注意滴成圓形，大小適當(dāng)，菌懸液濃度以顯微鏡低倍鏡頭每個(gè)視野約20個(gè)孢子為宜。然后翻轉(zhuǎn)蓋片制成懸滴，并封閉在特制的玻環(huán)內(nèi)，再將玻環(huán)放在底部盛少許水的培養(yǎng)皿中，蓋好皿蓋，放置在26—28℃溫箱中培養(yǎng)，4—5小時(shí)后檢查萌發(fā)結(jié)果。

此法也可改用直接用培養(yǎng)皿蓋的里面作懸滴進(jìn)行，即用玻璃筆在皿蓋里面劃方格，在方格中央滴孢子懸液，然后慢慢轉(zhuǎn)皿蓋。蓋在盛有少量蒸餾水的皿底上，保溫保濕培養(yǎng)，此法的優(yōu)點(diǎn)是簡便，而且適用于大量孢子萌發(fā)測(cè)定。

(二)液滴法

1.材料：小麥根腐病菌斜面菌種。

2.方法：在培養(yǎng)皿內(nèi)放一“井”字或“U”形玻璃棒，皿底加蒸餾水少許或襯上吸水紙或加幾個(gè)脫脂棉球吸水保濕，玻璃棒上放載玻片，其上分別滴2或3滴小麥根腐病菌孢子懸浮液〔濃度同(一)〕，蓋好皿蓋，置于26—28℃溫箱中培養(yǎng)，4—5小時(shí)后，鏡檢萌發(fā)結(jié)果。

(三)瓊脂培養(yǎng)基法

對(duì)于某些不適于直接在水滴中萌發(fā)的真菌可采用此法。

1.材料：新采集的帶有夏孢子堆的小麥稈銹病病葉或小麥白粉病病葉。

2.方法：取潔凈的載玻片，在熔化并冷至50℃左右的2%水瓊脂培養(yǎng)基中沾一下，待凝成薄層后，去掉一面瓊脂培養(yǎng)基，將有瓊脂培養(yǎng)基的一面朝上，平放在培養(yǎng)皿的“U”形玻棒上，再將稈銹菌夏孢子或白粉菌的分生孢子輕輕彈落或涂抹在瓊脂平面上。保溫培養(yǎng)，麥稈銹菌夏孢子培養(yǎng)在20℃溫度下，麥白粉病分生孢子培養(yǎng)在10—12℃下，24小時(shí)后鏡檢萌發(fā)結(jié)果。

(四)載片引濕法

此法用于不適于直接在水滴中萌發(fā)的某些真菌。

1.材料：玉米瘤黑粉病菌的黑粉孢子。

2.方法：在培養(yǎng)皿中放一“V”或“U”形玻璃棒，其上放一載玻片，再取寬1厘米，長4厘米的濾紙條一個(gè)放在皿內(nèi)。滅菌后皿底加少許滅菌水，將濾紙條橫放在載玻片上，崩緊，兩端拖入水中，吸滴水，再在紙上滴一滴玉米瘤黑粉病菌黑粉孢子懸浮液，蓋上皿蓋，在25℃三、孢子萌發(fā)的記載方法孢子萌發(fā)是先吸水膨脹，然后長出芽管，通常以芽管長度超過孢子直徑一半(不是正圓形的孢子以短徑為準(zhǔn))作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，記載萌發(fā)的方法有以下幾種。

(一)萌發(fā)率即萌發(fā)一定時(shí)間后，隨機(jī)取一定數(shù)目(至少500個(gè))的孢子，檢查萌發(fā)的孢子數(shù)，求出萌發(fā)百分率，如果用該法記錄兩種或幾種不同處理時(shí)，要注意嚴(yán)格掌握檢查時(shí)間。

(二)萌發(fā)時(shí)間

即測(cè)定孢子萌發(fā)達(dá)到一定萌發(fā)率所需時(shí)間。(三)芽管平均長度

即測(cè)定一定數(shù)目已萌發(fā)孢子的芽管長度，求其平均值。

此外，有些萌發(fā)試驗(yàn)，如藥效測(cè)定等，還需注意記錄芽管的寬度形狀變化以及是否有分枝等。

四、思考題

1孢子萌發(fā)在植病研究工作中有什么重要意義?在作萌發(fā)試驗(yàn)時(shí)，特別要注意哪些問題?

2幾種孢子萌發(fā)方法各自適用于哪些真菌?記載孢子萌發(fā)的方法有幾種?各種什么優(yōu)缺點(diǎn)。2－5植物病原物的接種一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

人工使病原物與寄主植物感病部位接觸，創(chuàng)造條件使病原物侵入并誘致寄主發(fā)病叫接種，接種是證病過程的重要步驟，在研究寄生現(xiàn)象發(fā)病規(guī)律，測(cè)定品種抗病性，藥劑防病效果時(shí)都需要接種。因此，接種是植病工作者必須掌握的基本技術(shù)環(huán)節(jié)。

植物病害人工接種方法，是根據(jù)病害的傳染方式和侵染途徑設(shè)計(jì)的，植物病害的種類很多、其傳染方式和侵染途徑各異。因此接種方法也不相同。本次實(shí)驗(yàn)以玉米大斑病，小麥根腐病，小麥稈銹病，梨褐腐病等為內(nèi)容學(xué)習(xí)常用的接種方法。二、內(nèi)容、材料和方法

(一)拌土法(小麥根腐病)

拌土法適于土壤傳染的病害，方法是將消毒的土壤分別裝入兩個(gè)小花盆中，其中一盆表層覆以一厘米厚的菌土，菌土是用玉米砂培養(yǎng)菌1份加消毒土5份混合而成，另一盆不接種(不覆菌土)作為對(duì)照。將經(jīng)0.1%升汞表面消毒3分鐘并用無菌水洗3次的小麥種子，分別播種在兩個(gè)花盆內(nèi)，插上標(biāo)牌，注明接種日期，方法病害名稱及接種人姓名，花盆放在室溫下，澆水保濕，遮陰管理，待幼苗出土展開葉子后(大約一周)，觀察并記載根腐病發(fā)生情況。(二)噴霧法(玉米大斑病)氣流及雨水傳播的病害常用此法接種，將培養(yǎng)好的玉米大斑病的斜面菌種一支，用移植鉤刮于裝有100毫升無菌水的三角瓶中，用力振蕩，待孢子洗下后，以紗布過濾，并于濾液中加入0.1克中性肥皂，即成孢子菌絲懸液，用衛(wèi)生噴霧器均勻噴布在麥苗上。同時(shí)設(shè)一不噴菌液而噴無菌水的作對(duì)照，用塑料罩保濕48小時(shí)，揭布后正常管理，7天后作發(fā)病調(diào)查。(三)涂抹法(小麥稈銹病)

這也是氣流傳播的病害常用的接種方法，用于禾本科銹病接種。方法是用姆指沾銹菌夏孢子懸液自下向上輕輕涂欲接種的小麥葉片，也可先用手指沾水摩擦葉片，使葉表有一層水膜，然后將夏孢子粉抹在上面，以不涂抹孢子懸液或孢子粉的作為對(duì)照。塑料罩保濕48小時(shí)后揭布，正常管理，7天后作發(fā)病調(diào)查。(四)創(chuàng)傷接種法(白菜軟腐病及梨褐腐病)

創(chuàng)傷接種法是傷口侵入的弱寄生菌常用的接種方法。

1.白菜軟腐?。喝∏谐蛇m當(dāng)大小的白菜幫兩塊、經(jīng)水洗，待水稍干后，以10%漂白粉溶液作表面消毒，分放在兩個(gè)滅過菌的上下鋪有吸水紙的培養(yǎng)皿中，用酒精擦過的玻璃棒順著白菜幫打三排不穿透的孔穴。將培養(yǎng)好的白菜軟腐病菌斜面菌種的菌苔以無菌水洗下作成菌懸液。然后，先以滅過菌的獸用注射器吸取無菌水滴于菜幫的第一排內(nèi)孔作為對(duì)照，再用該注射器吸菌液滴于第二、三排孔內(nèi)。注意無論無菌水、還是菌液都不要滴的過多。以免流出孔穴，另一培養(yǎng)皿的菜幫以同法處理作為重復(fù)。蓋好皿蓋，置于26—28℃的溫箱中，24小時(shí)后檢查發(fā)病情況。

2.梨褐腐?。喝“桌嬉跃凭鹧姹砻嫦竞螅脽霟岬慕馄实?，在其上切成小手指粗的孔穴3—5個(gè)。取經(jīng)分離純化的梨褐腐病菌菌落填抹在已切好的孔穴中，再復(fù)以飽含無菌水的脫脂棉或紗布，放在密封的干燥器或標(biāo)本瓶中，干燥器或標(biāo)本瓶底部裝些水，再將干燥器或標(biāo)本瓶放于25三、接種試驗(yàn)的觀察和記載

認(rèn)真觀察和記錄是做好接種試驗(yàn)的重要環(huán)節(jié)，為了及時(shí)正確地分析總結(jié)試驗(yàn)結(jié)果，必須認(rèn)真觀察并做詳盡的記錄，如記錄接種時(shí)間，接種植物、品種、接種方法、部位、接種用的病菌名稱(包括菌系和生理小種)、來源、繁殖和培養(yǎng)方法(培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間)、接種體濃度、接種的方法和步驟及接種后的管理等。四、思考題

植物接種常用的方法有哪些?舉例說明如何根據(jù)病害特點(diǎn)選擇接種方法?2－6植物病原生物繪圖技術(shù)一、實(shí)訓(xùn)目標(biāo)

提高生物繪圖技術(shù)水平，為今后開展病理學(xué)有關(guān)工作奠定較好的基礎(chǔ)。

二、繪圖內(nèi)容、材料和方法

(一)病原菌形態(tài)圖的繪制

以點(diǎn)線法繪制黑白圖的步驟和方法

1.初稿的描繪

用普通白紙、鉛筆(1H)起稿，先確定圖幅大小，一般要比制版尺寸大一些，但不能超過一倍，制版時(shí)再縮小，有提高原圖質(zhì)量的效果，當(dāng)然如能精良繪制，亦可原圖制版，如在一張圖上繪出幾個(gè)內(nèi)容，如分生孢子梗和分生孢子子囊殼，子囊和子囊孢子，則應(yīng)按圖幅大小求出初稿上各部比例尺寸，其比例大小需按顯微測(cè)微尺度量算出。有的目測(cè)描繪，有的用顯微繪圖儀描繪(見附錄阿培式繪圖儀的用法)輪廓、形成初稿。

2.原稿的形成

將硫酸紙蒙于初稿上描繪，在用鉛筆時(shí)，筆頭必須削尖，輕描以便修改和保持圖面清晰，橡皮要軟而不帶顏色，以免沾污畫面。

3.原圖的完成

用繪圖筆蘸碳素黑水照原稿線條描出全部線條輪廓，然后根據(jù)病原菌各部有無顏色，顏色深淺等特點(diǎn)，用黑點(diǎn)的有無及疏密程度點(diǎn)出，使之具有色調(diào)，質(zhì)地及立體之感。

圖上要有比例尺，以表示各部的大小，圖下要寫名稱和標(biāo)圖注。

繪玉米大斑病菌的分生孢子梗和孢子及桃縮葉病菌的子囊和子囊孢子。

(二)病害癥狀圖的繪制

病害癥狀是植物根、莖、葉、花、果實(shí)等部位的變形、變色或穿孔等特征，這類標(biāo)本多不規(guī)則，繪制時(shí)只求表示出特征就行了，不象病原物形態(tài)圖那樣嚴(yán)格，也不必繪出原稿，再根據(jù)原稿描繪原圖，有的純以線條，有的線點(diǎn)結(jié)合，可根據(jù)自己得心應(yīng)手者繪之，雖然這樣說，但對(duì)初學(xué)者，先構(gòu)劃草圖，再反復(fù)修改推敲是必要的。繪圖時(shí)照顧各部分比例是必不可少的，同樣，圖繪完后要注明病害名稱和標(biāo)注圖注。

(三)曲線表的繪制

曲線表以粗細(xì)，虛實(shí)不同的線條繪制，粗線用鴨嘴筆，細(xì)線用繪圖筆，一般座標(biāo)線直粗，曲線宜細(xì)，以使圖表重點(diǎn)分明，構(gòu)圖美觀，原圖大小應(yīng)比制版要求的大1/2左右。

三、幾點(diǎn)技巧與注意

1.布點(diǎn)：布點(diǎn)是一項(xiàng)細(xì)致而費(fèi)工的技巧。點(diǎn)要點(diǎn)得圓，點(diǎn)得勻，點(diǎn)子的排列，要保持整齊、均勻，均勻中求變化，在變化中間要統(tǒng)一，所以應(yīng)有計(jì)劃(心中有數(shù))地從明處點(diǎn)起，小心而慢慢的點(diǎn)，一行行交互著點(diǎn)，不要等到畫好看得太疏而再加點(diǎn)子，再加的點(diǎn)子反而會(huì)變得不均勻，明的部分，色淡的部分點(diǎn)子小些稀些，暗的部分，色深的部分點(diǎn)子要大些密些。

2.劃線：劃線是繪圖的又一基本功，一般以肘貼桌面，掌側(cè)和小指抵圖紙，緊握筆桿，從左下向右上的方向運(yùn)筆，同時(shí)應(yīng)閉氣用力，可使線條均勻、光滑、流暢，一般說，不應(yīng)露出筆尖起落的痕跡。筆尖含黑的多少，壓筆力的大小，常引起線點(diǎn)的粗細(xì)變化，要多加體會(huì)運(yùn)用。

3.繪圖時(shí)必須發(fā)靜有耐心，特別是換用繪圖儀描繪時(shí)，坐位的高低必須合適，以免易疲勞，草圖應(yīng)一氣繪成，不要中途停頓。

四、思考題

1每人提交合乎要求的病原物形態(tài)圖一張。

2病原物形態(tài)圖的繪制，一般經(jīng)過哪幾個(gè)步驟?如何很好完成這些繪圖步驟?每一步都應(yīng)注哪些問題?第三部分微生物病理技能訓(xùn)練實(shí)訓(xùn)一植物病原細(xì)菌觀察一、實(shí)訓(xùn)目標(biāo)植物病原細(xì)菌形態(tài)觀察和種類鑒定二、內(nèi)容、材料和方法

(一)植物細(xì)菌病害的簡易診斷

取水稻白葉枯病新病葉，在病斑病健交界處剪取2×2mm的小塊病組織，放在載玻片上，滴加一滴蒸餾水，蓋好蓋玻片后，立即在顯微鏡下觀察，注意葉組織維管束剪斷處是否有大量的細(xì)菌，呈云霧狀溢出，如將視野調(diào)暗觀察更易見到，按同樣方法用健康組織作鏡檢反證。

(二)植物病原細(xì)菌形態(tài)觀察和種類鑒定

1、培養(yǎng)性狀觀察

取培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的馬鈴薯環(huán)腐病菌(C.sepedonicum)，茄青枯病菌(Burkholderiasolanacearum)和白菜軟腐病菌(E.carotovora)等，注意觀察菌落顏色、大小、質(zhì)地，是否產(chǎn)生熒光色素等，和植物病原真菌培養(yǎng)菌落有什么根本性的不同?

2、染色反應(yīng)觀察

(1)革蘭氏染色反應(yīng)

供試菌種：馬鈴薯環(huán)腐病菌(C.sepedonicum)和白菜軟腐病菌(E.carotovora)。

操作步驟：

A涂片方法

a取潔凈的載波片，加一滴無菌水；用移菌環(huán)按無菌操作要求取一環(huán)菌苔，在水滴中制成菌懸液；

b另取一潔凈載玻片，在中央加滴無菌水，取一環(huán)上述配制的菌懸液至水滴中，均勻涂布成薄層后，自然晾干；

c將涂片在燈焰上緩慢通過2—3次進(jìn)行固定。

B染色步驟(染色劑配法見附3)

a滴草酸銨結(jié)晶紫液于涂片上，染色1分鐘；

b傾去染液，水洗(亦可不用水洗)；

c加碘液處理1分鐘；

d傾去碘液、水洗、吸水紙吸干；

e用95%酒精洗脫染液，時(shí)間約30秒鐘；

f吸干后，滴加復(fù)染劑藏紅〇復(fù)染10—30秒鐘；

g水洗、吸干鏡檢。

陽性反應(yīng)的細(xì)菌染成紫色，陰性反應(yīng)的染成紅色，注意涂片菌液不能太濃，其次褪色要徹底。否則是紅是紫不易區(qū)分。

(2)鞭毛染色

細(xì)菌鞭毛很細(xì)(只有0.02—0.03微米)。不做特殊處理，一般光學(xué)顯微鏡是看不見的，鞭毛上沉積了染劑或銀鹽后才能看到，這是所有鞭毛染色的根據(jù)。但是染劑也可以在載玻片上沉積，如果載玻上沉積染劑太多，就會(huì)影響鞭毛染色效果。為此所用載玻片一定要用特殊方法嚴(yán)格洗滌(方法這里從略)，此外染劑處理時(shí)間一定要嚴(yán)格掌握處理時(shí)間，處理時(shí)間太短，鞭毛上沒有足夠的沉積物看不清楚；處理時(shí)間太長，玻片上沉積物太多，也看不清楚。第三，菌齡十分重要，培養(yǎng)時(shí)間不足，或培養(yǎng)時(shí)間太長都不易染色成功，不同種類的細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間差異較大，白菜軟腐病菌以在26—28℃恒溫箱中培養(yǎng)16—18小時(shí)為宜，總之，鞭毛染色比較困難，必須嚴(yán)格掌握每個(gè)操作環(huán)節(jié)。

供試菌株：白菜軟腐病菌(E.carotovora)

操作步驟：

A載玻片準(zhǔn)備

用新的載玻片，經(jīng)過系列清潔處理(方法從略)后，進(jìn)行檢驗(yàn)，合格者用于實(shí)驗(yàn)。

B細(xì)菌懸液的配制

供染色用的菌種，用前每隔1—2天轉(zhuǎn)移一次，連續(xù)轉(zhuǎn)移幾次進(jìn)行活化，增強(qiáng)細(xì)菌的活性。在已活化并在16—28℃恒溫箱中培養(yǎng)16—18小時(shí)的白菜軟腐病菌斜面上加3—5毫升先在恒溫箱中經(jīng)予熱的無菌水，靜置10—20分鐘，使細(xì)菌游出配成稀薄的菌懸液，注意靜置的時(shí)間不能太長，因?yàn)闀r(shí)間長了鞭毛可能脫落、染色固定前可在鏡下觀察其游動(dòng)性。

C涂片

用移置環(huán)取配好的菌懸液2—3環(huán)于潔凈的載玻片上，立即將玻片直立，使菌液流下展開，在玻片上遺留并形成菌懸液膜，在空氣中自然干燥固定，勿用火焰固定。

D染色

鞭毛染色的方法很多，大致可分為兩類，第一類是堿性品紅染色法；第二類是銀鹽沉積法，本次實(shí)驗(yàn)用銀鹽沉積法或堿性品紅染色法。

銀鹽沉積法：滴甲液3—5分鐘，用蒸餾水輕輕沖洗甲液，再加乙液，處理30—60秒鐘，立即用蒸餾水輕輕沖洗乙液，空氣中自然干燥后，鏡檢(有人在加乙液后，在燈焰上微加熱，再用水洗)菌體染成深褐色，鞭毛染成褐色，注意鞭毛數(shù)目及著生方式。

堿性品紅染色法（Leifson賴夫生染色法）：在潔凈載玻片上用尖蠟筆劃4個(gè)1.3×2.0cm的長方形小格，將載玻片斜放，用移植環(huán)在每小格頂端加一滴菌懸液，流下的菌懸液用紙吸去，干燥后，在第一個(gè)小格加5滴染劑，經(jīng)過5s，10s，15s后，分別在第二、三、四3個(gè)格中加滴染劑，仔細(xì)觀察染劑中有很細(xì)的沉淀物（鐵銹色云霧狀物）產(chǎn)生，當(dāng)?shù)谝?、第二小格已產(chǎn)生沉淀時(shí)，立即用水洗去染劑，室溫下使載玻片干燥，然后直接在油鏡下鏡檢。

三、思考題

1．植物細(xì)菌病害的在癥狀鑒定方法和防治方面與植物真菌病害有什么不同?為什么?

2．細(xì)菌鞭毛染色理論根據(jù)是什么?

1．使用油鏡必須按先用低倍鏡和高倍鏡觀察，再用油鏡觀察2．下降鏡頭時(shí)，一定要從側(cè)面注視，切忌用眼睛對(duì)著目鏡，邊觀察邊下降鏡頭的錯(cuò)誤操作，以免壓碎玻片而損壞鏡頭。3．使用二甲苯擦鏡頭時(shí)，注意二甲苯不能過多，以防溶解固定透鏡的樹脂。4．注意保持顯微鏡的潔凈，對(duì)金屬部分要用軟布擦拭，擦鏡頭必須用擦鏡紙，切勿用手或用普通布、紙等，以免損壞鏡頭。實(shí)訓(xùn)二鞭毛菌亞門真菌及其所致病害癥狀觀察一、實(shí)訓(xùn)目標(biāo)1.通過本實(shí)驗(yàn)了解鞭毛菌亞門中根腫菌綱、壺菌綱和卵菌綱真菌的主要形態(tài)特征，掌握與植物病害有關(guān)的重要屬的基本形態(tài)特征、分類依據(jù)及其所致病害的癥狀特點(diǎn)。2.學(xué)習(xí)使用檢索表來鑒定病菌，為分類鑒定打下初步基礎(chǔ)。學(xué)會(huì)病原物標(biāo)本臨時(shí)玻片的制作方法。

二、內(nèi)容、材料和方法

(一)根腫菌綱(Plasmodiophoromycetes)

1根腫菌屬(Plasmodiophora)

觀察白菜根腫病(P.brassicae)的液浸標(biāo)本，注意根腫的特點(diǎn)，然后鏡檢白菜根腫病菌制備片(001)，注意在寄主細(xì)胞內(nèi)能否見到成堆的休眠孢子?受病細(xì)胞的大小與正常細(xì)胞有無區(qū)別?是薄壁細(xì)胞受害，還是輸導(dǎo)組織受害?

2粉痂屬(Spongospora)

觀察馬鈴薯粉痂病(S.subterranea)標(biāo)本，鏡檢該病的制備片(002)，注意馬鈴薯塊莖皮層上形成的瘡痂狀小瘤及寄主細(xì)胞內(nèi)由休眠孢子聚集成多孔的海綿狀圓球。

(二)壺菌綱(Chytridiomycetes)

壺菌營養(yǎng)體形態(tài)變化較大，較高等的開始有原始的絲狀體，無性繁殖產(chǎn)生后端具有單根尾鞭的游動(dòng)孢子；有性繁殖最主要的方式是兩個(gè)同型的游動(dòng)配子交配形成合子，重要的只有節(jié)壺菌屬(Physoderma)中的玉蜀黍節(jié)壺菌(P.maydis)引起玉米褐斑病。

觀察玉米褐斑病標(biāo)本，注意發(fā)病部位，病斑大小，顏色，是否隆起，用解剖針挑破病斑可見到大量黃褐色的粉末，即病菌的休眠孢子，制片鏡檢休眠孢子的形態(tài)，或鏡檢玉米褐斑病菌制備片(003)注意休眠孢子胞壁厚薄、顏色，是否有蓋。

(三)卵菌綱(Oomycetes)

卵菌的特征是營養(yǎng)體為真正的菌絲體；無性繁殖產(chǎn)生具有一根尾鞭和一根茸鞭的游動(dòng)孢子，有性繁殖通過異型的雄器和藏卵器交配產(chǎn)生卵孢子，根據(jù)藏卵器內(nèi)卵孢子數(shù)目的多少及其他特性，卵菌綱分為水霉目和霜霉目兩個(gè)目。

1水霉目(Saprolegniales)

水霉目真菌的主要特征是藏卵器中形成一個(gè)以上的卵孢子；游動(dòng)孢子有兩游現(xiàn)象，游動(dòng)孢子囊(菌絲頂端原生質(zhì)高度濃縮，基部有分隔與菌絲分開)不脫落，與菌絲無顯著差異，該目與植物病害關(guān)系較大的有以下兩屬。

1)水霉屬(Saprolegnia)

鏡檢培養(yǎng)皿中用線麻籽或大米粒誘發(fā)培養(yǎng)的水霉菌，注意菌絲和游動(dòng)孢子囊的形態(tài)，菌絲和游動(dòng)孢子囊區(qū)別是否明顯?次生游動(dòng)孢子囊是否從初生游動(dòng)孢子囊的空殼內(nèi)生出(層生)?藏卵器內(nèi)卵孢子數(shù)是一個(gè)，還是多個(gè)；能否看到藏卵器和雄器交配?能否看到游動(dòng)孢子釋放的現(xiàn)象。

(2)綿霉屬(Achlya)

鏡檢培養(yǎng)皿中用線麻籽或大米粒誘發(fā)培養(yǎng)的綿霉菌，注意和水霉屬真菌的區(qū)別，能否看到單個(gè)或成串產(chǎn)生的厚壁孢子的情況以及游動(dòng)孢子釋放后聚集在孢子囊附近的情形。

2霜霉目(Peronosporales)

霜霉目真菌與水霉目真菌的主要區(qū)別是藏卵器中只形成一個(gè)卵孢子；游動(dòng)孢子沒有兩游現(xiàn)象，孢子囊一般是產(chǎn)生在特殊分化的孢囊梗上：孢子囊較易從孢囊梗上脫落。

根據(jù)孢囊梗的形態(tài)特點(diǎn)，霜霉目分為腐霉菌科(Pythiaceae)、白銹菌科(Albuginaceae)和霜霉菌科(Peronosporaceae)(見附錄)，該目與植病關(guān)系密切的有以下幾個(gè)屬。

1)腐霉屬(Pythium)

觀察蔬菜幼苗猝倒病標(biāo)本，注意受害部位和癥狀特點(diǎn)。將瓜果腐霉(P.aphanidermatum)斜面菌種的菌落少許移置在清水中，在18—20℃下培養(yǎng)24—36小時(shí)，然后用解剖針從水中挑取少量菌絲制片鏡檢。觀察菌絲有沒有隔膜?游動(dòng)孢子囊形狀?與菌絲差別是否明顯?能否看到孢子囊萌發(fā)的情景?泄管和泡囊的形態(tài)如何?

2)疫霉屬(Phytophthora)

取馬鈴薯晚疫病(P.infestans)標(biāo)本，觀察受害部位。注意癥狀特點(diǎn)，特別要注意葉片上病斑的位置，大小、狀態(tài)、顏色，邊緣是否清楚，是否產(chǎn)生灰白色的霉層(特別是葉背面)?挑取馬鈴薯晚疫病菌斜面培養(yǎng)菌制片(或取制備片008)鏡檢游動(dòng)孢囊梗、游動(dòng)孢子囊和游動(dòng)孢子，注意孢囊梗分枝的特點(diǎn)及游動(dòng)孢子囊的形態(tài)。

(3)單軸霉屬(Plasmopara)

觀察葡萄霜霉病(P.viticola)標(biāo)本，注意為害部位及癥狀特點(diǎn)，挑取葡萄霉病病葉病斑上的霉層制片(或取制備片015)鏡檢孢子囊梗的形態(tài)，注意分枝特點(diǎn)及分枝末端的特征。

(4)霜霉屬(Peronospora)

觀察十字花科霜霉病(P.paraditica)和大豆霜霉病(P.manschurica)標(biāo)本，注意為害部位的癥狀和特點(diǎn)，然后挑取少許霉層制片(或取制備片027或018)鏡檢孢囊梗和孢子囊，注意孢子囊的梗分枝特點(diǎn)。

(5)假霜霉屬(Pseudoperonospora)

觀察黃瓜霜霉病(P.cupensis)標(biāo)本，注意為害部位和病狀特點(diǎn)，挑取霉層制片或取制備片013)鏡檢孢囊梗和孢子囊，注意孢囊梗的分枝特點(diǎn)，與霜霉屬形態(tài)有何異同。

(6)盤梗霉屬(Bremia)

觀察萵苣霜霜霉病(B.lacrucae)標(biāo)本，注意癥狀特點(diǎn)，挑取病葉上的霉層制片(或取制備片016)，鏡檢孢子囊梗的形態(tài)，注意分枝末端是否膨大呈盤狀?邊緣是否有小梗?孢子囊的形態(tài)及著生位置如何?

7)白銹菌屬(Albugo)

取十字花科白銹病(A.candida)，注意受害部位，癥狀特點(diǎn)，切取白銹病病葉制片鏡檢(或鏡檢制備片009—無性，010—有性)，注意孢子囊梗著生的位置，形態(tài)和排列特點(diǎn)，孢子囊的形態(tài)，注意觀察藏卵器內(nèi)卵孢子的數(shù)目，藏卵器壁與卵孢子壁是否愈合，另取該菌無性世代制備片009，觀察孢子囊梗的形態(tài)，特別要注意分枝特點(diǎn)。三、作業(yè)

1．繪馬鈴薯晚疫病菌(P.infestans)和十字花科白銹病菌(A.candida)孢囊梗和孢子囊形態(tài)圖。

2．繪葡萄霜霉病菌(Plasmoparaviticola)和黃瓜霜霉病菌(Ps.cubensis)形態(tài)圖。

3．鏡檢鑒定大蔥霜霉病、向日葵霜霉病，波菜霜霉病的病原菌，鑒定到屬。

四、思考題

1．試比較說明水霉、腐霉、疫霉和霜霉，從低級(jí)向高級(jí)演化的情況。

2．霜霉為害植物時(shí)，為什么多發(fā)生在葉部?為什么多在病斑背面形成霉層?為什么常在低溫多濕的條件下受害嚴(yán)重.實(shí)訓(xùn)三接合菌亞門真菌及其所致病害癥狀觀察一、實(shí)訓(xùn)目標(biāo)

熟悉與植病關(guān)系密切的接合菌的形態(tài)及其所致病害的癥狀特點(diǎn)，同時(shí)觀察真菌的異宗配合現(xiàn)象。

二、內(nèi)容、材料和方法

毛霉目(Mucorales)真菌大多是腐生菌，引起植物花、果實(shí)、塊根和塊莖的腐爛。

1根足霉屬(Rhizopus)

1、根霉屬(Rhizopus)

菌絲發(fā)達(dá)，有分枝，分布在基物表面或其內(nèi)，有匍匐絲和假根。孢囊梗2-3根叢生，在假根相反方向從菌絲上產(chǎn)生，一般不分枝，頂生孢子囊，產(chǎn)生大量孢囊孢子，有囊軸，鑼錘形，孢囊孢子單胞，表面有飾紋，接合孢子色深，表面有瘤狀突起。

取甘薯軟腐病(R.nigricans)標(biāo)本，觀察癥狀特點(diǎn)，注意受害甘薯表面是否有白色毛狀物生出?在白色毛狀物中是否有黑點(diǎn)?挑取培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的根足霉(帶少許培養(yǎng)基)制片(或取制備片022)，鏡檢小黑點(diǎn)是什么器官?注意匍匐枝和假根的形態(tài)，孢囊梗著生的位置，能否見到囊軸?什么形狀?

2、毛霉屬(Mucor)

無匍匐絲與假根，孢囊梗單生，直立，其它形態(tài)同根霉，挑取培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的毛霉制片(或取制備片020)，鏡檢孢囊梗，孢子囊和孢囊孢子，注意和根霉的區(qū)別。

3、笄霉屬(Choanephora)

形成的大小兩種類型的孢子囊，條件不適時(shí)，產(chǎn)生大型孢子囊，大型孢子囊產(chǎn)生在頂端彎曲的孢囊梗上，其內(nèi)產(chǎn)生多數(shù)孢囊孢子，孢子頂端有數(shù)根細(xì)毛。通常形成小型孢子囊，小型孢子囊聚生在孢子囊梗頂端膨大的頭狀體的小梗上，其中形成一個(gè)孢子，故也稱這種小型孢子囊為分生孢子。該菌為害花和果實(shí)，引起花腐和果腐，取制備片024，鏡檢笄霉的孢囊梗和孢子囊形態(tài)，注意觀察該屬與根霉、毛霉的區(qū)別。

4、犁頭霉屬(Absidia)

產(chǎn)生匍匐絲和假根，孢囊梗自假根間的弓形匍匐絲上長出，配囊柄上長出附屬絲包圍接合孢子。取制備片023鏡檢犁頭霉的假根，匍匐絲及配囊柄上長出附屬絲包圍接合孢子的形態(tài)，注意孢囊梗著生的位置和根霉有何不同。

三、作業(yè)繪根足霉形態(tài)圖

四、思考題

1．接合菌和鞭毛菌在形態(tài)上有哪些異同點(diǎn)?

2．毛霉和根霉有什么不同?

3．試談異宗配合的概念。實(shí)訓(xùn)四子囊菌亞門真菌及其所致病害癥狀觀

一、實(shí)訓(xùn)目標(biāo)

通過本次實(shí)驗(yàn)了解子囊菌的形態(tài)特征及分類概況，熟悉該菌所致病害的癥狀特點(diǎn)，以便為子囊菌的分類和病害鑒定打下基礎(chǔ)。

二、內(nèi)容、材料和方法(一)半子囊菌綱(Hemiascomycetes)

半子囊菌綱包括許多低等的子囊菌，比較原始，營養(yǎng)體是單細(xì)胞或不發(fā)達(dá)的菌絲體：子囊散生，不形成子囊果：也不產(chǎn)生真正的分生孢子，與植病關(guān)系較大的只有外囊菌目(Taphrinales)中的外囊菌屬(Taphrina)，該屬真菌都是專性寄生菌，引起葉片、枝梢和果實(shí)畸形。

觀察桃縮葉病(T.deformans)、李囊果病(T.pruni)標(biāo)本，注意植物組織膨腫變形狀態(tài)，病部表面是否有灰白色霉層?為何物?取小塊病葉或病果皮切片鏡檢(或取挑縮葉病制備片101)，鏡檢裸生的子囊及其內(nèi)的子囊孢子。

(二)不整囊菌綱(Plectomycetes)

(三)核菌綱(Pyrenomycetes)

1白粉菌目Erysiphales

白粉菌都是專性寄生菌，菌絲、無性和有性繁殖體多表生，以吸器伸入寄主表皮細(xì)胞吸取養(yǎng)分，子囊果為閉囊殼，其上生有各種形狀的附屬絲，根據(jù)附屬絲的性狀和閉囊殼內(nèi)子囊的數(shù)目進(jìn)行分類，常見的有以下七屬。

(1)白粉屬(Erysiphe)

觀察瓜類白粉病(B.cichoracearum)標(biāo)本，注意病狀特點(diǎn)，病部是否有白色粉狀物和小黑點(diǎn)，挑取小黑點(diǎn)制片(或取制備片105)，鏡檢閉囊殼的形態(tài)，注意附屬絲的性狀和長短，然后用解剖針輕壓蓋片，擠壓閉囊殼使之慢慢破裂，注意觀察其內(nèi)子囊的數(shù)目及形態(tài)，能否看到子囊孢子。

(2)布氏白粉屬(Blumeria)

該屬是從白粉屬(Erysiphe)劃出來的一個(gè)新屬，主要特征是閉囊殼上的菌絲狀附屬絲很短，閉囊殼內(nèi)有多個(gè)子囊，分生孢子?；颗虼蟪式蛐巍Ｓ^察小麥白粉病(B.graminis)標(biāo)本，注意病狀特點(diǎn)，病部是否有白色粉狀物和小黑點(diǎn)，挑取小黑點(diǎn)制片(或取制備片106)，鏡檢閉囊殼的形態(tài)，注意附屬絲的長短，然后用解剖針輕壓蓋片，擠壓閉囊殼使之慢慢破裂，注意觀察其內(nèi)子囊的數(shù)目及形態(tài)，能否看到子囊孢子。

(3)單絲殼屬(Sphaerotheca)

觀察薔薇白粉病(S.pannosa)標(biāo)本，注意癥狀特點(diǎn)，制片(或取制備片139、111)鏡檢閉囊殼及附屬絲，注意附屬絲是否為菌絲狀，閉囊殼內(nèi)子囊的數(shù)目等特點(diǎn)。

(4)叉絲殼屬(Microsphaera)

取核桃白粉病(M.yamadai)和丁香白粉病(M.alni)標(biāo)本，觀察癥狀特點(diǎn)。自丁香白粉病葉上挑取小黑點(diǎn)制片(或取核桃白粉病菌制備片141或取丁香白粉病菌制備片109)鏡檢閉囊殼和附屬絲，注意附屬絲頂端有數(shù)回二叉狀分枝，閉囊殼內(nèi)子囊多數(shù)的特點(diǎn)。

(5)叉絲單囊殼屬(Podosphaera)

取蘋果白粉(P.leucotricha)和山楂白粉病(P.oxyacanthae)標(biāo)本，觀察病害的癥狀特點(diǎn)，自山楂白粉病葉上挑取小黑點(diǎn)制片鏡檢閉囊殼和附屬絲，注意附屬絲剛直，頂端一次或數(shù)次整齊的叉狀分枝，閉囊殼內(nèi)產(chǎn)生一個(gè)子囊特點(diǎn)。

(6)球針殼囊(Phyllactinia)

取桑里白粉病(P.corylea)和梨白粉病標(biāo)本觀察癥狀特點(diǎn)，并制片(或取制備片)鏡檢附屬絲的形態(tài)，注意附屬絲生在閉囊殼的赤道部位，剛直，基部膨大呈球形，閉囊殼內(nèi)子囊多個(gè)。

(7)鉤絲殼屬(Uncinula)

取榆樹白粉病(U.clandestina)和葡萄白粉病(U.necator)標(biāo)本觀察癥狀特點(diǎn)，并制片鏡檢閉囊殼及附屬絲，注意閉囊殼內(nèi)子囊多數(shù)，附屬絲頂端卷曲呈鉤狀或螺旋狀。

2球殼目(Sphaeriales)

球殼目真菌的子囊果為真正的子囊殼，有真正的孔口，孔口乳突狀或長筒狀，子囊有圓形、棍棒形、紡錘形，一般排列成子實(shí)層，子囊間大都有側(cè)絲，也有的早期消解或沒有，球殼菌一般都有很發(fā)達(dá)的分生孢子階段。

有些分類系統(tǒng)將形成子囊殼的真菌，分為許多目，但究竟分為幾個(gè)目意見很不一致?？紤]到有些分目的特征難于掌握，界線并不很清楚，還有屬于末定的中間類型，所以不如化繁為簡都?xì)w納入球殼目。球殼目真菌大多是腐生的，其中也有不少是寄生的，以下各屬都可引起重要的植物病害。

(1)長喙殼屬(Ceratocystis)

取甘薯黑疤病(C.fimbita)標(biāo)本，觀察癥狀特點(diǎn)，注意病斑是否凹陷?其上是否有毛刺狀物?毛刺狀物為