人教湖南省安仁一中生物必修三基因工程基本操作程序

人教湖南省安仁一中生物必修三基因工程基本操作程序第1頁/共43頁目的基因的獲取基因表達載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細胞目的基因的表達和檢測基因工程的基本操作程序第2頁/共43頁基因工程的目的基因－－

主要是指編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。與生物抗逆性相關(guān)的基因與優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因與生物藥物和保健品相關(guān)的基因與毒物降解相關(guān)的基因與工業(yè)所需酶相關(guān)的基因具有調(diào)控作用的因子……第3頁/共43頁2、從基因文庫中獲取(基因序列未知)基因文庫基因組文庫部分基因文庫－－如：cDNA文庫目的基因的獲取第4頁/共43頁限制酶基因組DNA基因重組轉(zhuǎn)化細菌體外包裝1)基因組文庫(Genomiclibrary)是指將某種生物體的全部基因組DNA用限制性內(nèi)切酶或機械力量切割成一定長度范圍的DNA片段，再與合適的載體在體外重組后，導入受體菌的群體中儲存，這個群體就稱為該生物基因組文庫。其目的是分離有用的目的基因和保存某種生物的全部基因。第5頁/共43頁cDNA(互補DNA)：是由生物的某一特定器官或特定發(fā)育時期細胞內(nèi)的mRNA經(jīng)體外反轉(zhuǎn)錄后形成的互補DNA片段，與載體連接后儲存在一個受體菌群中，這個受體菌群就叫做這種生物的cDNA文庫2)cDNA文庫(cDNAlibrary)反轉(zhuǎn)錄酶mRNA基因重組cDNA第6頁/共43頁圖書館國家圖書館市圖書館基因文庫基因組文庫部分基因文庫第7頁/共43頁依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA

基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性從基因文庫中得到目的基因的方法第8頁/共43頁2、利用PCR技術(shù)擴增目的基因聚合酶鏈式反應(yīng)目的基因的獲取第9頁/共43頁5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/5/3/第10頁/共43頁5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/引物ⅡG—G高溫變性低溫復性中溫延伸5/3/A—G引物Ⅰ5/3/5/3/90℃-95℃55℃-65℃70℃-75℃第11頁/共43頁過程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、復性（55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈PCR擴增儀第12頁/共43頁①概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復制___________的核酸合成技術(shù)③條件：_______________________、

_______________、___________、___________.等②原理：__________④方式：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）⑤結(jié)果：聚合酶鏈式反應(yīng)體外特定DNA片段DNA復制四種脫氧核苷酸引物DNA聚合酶指數(shù)2n使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增要有一段已知核苷酸序列的目的基因PCR技術(shù)第13頁/共43頁3、人工合成(基因比較小，序列已知)目的基因的獲取DNA合成儀第14頁/共43頁1）反轉(zhuǎn)錄法：cDNA(互補DNA)第15頁/共43頁蛋白質(zhì)mRNADNA推測推測DNADNA合成儀合成儀合成2）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：第16頁/共43頁獲取目的基因的常用方法有哪些?（2）從基因文庫中獲取—目的基因序列未知（3）利用PCR技術(shù)擴增—目的基因序列已知（1）人工合成---目的基因不是很大且已知序列目的基因的獲取第17頁/共43頁科學家在培育抗蟲棉時，經(jīng)歷了多次失敗，才獲得成功。起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中，然后導入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲基因在棉花體內(nèi)沒有表達。然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入啟動子(抗蟲基因首端)，導入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力。科學家又在有啟動子、抗蟲基因的質(zhì)粒中插入終止子(抗蟲基因末端)，導入棉花受精卵，結(jié)果成長的植株，有了抗蟲能力。資料:基因表達載體的構(gòu)建作為基因表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？第18頁/共43頁基因表達載體的構(gòu)建基因表達載體的構(gòu)建是基因工程的核心，其目的是使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。第19頁/共43頁基因表達載體的構(gòu)建基因表達載體的模式圖抗生素抗性基因基因表達除含有目的基因外，還需要哪些元件：啟動子終止子標記基因第20頁/共43頁細胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點RNA聚合酶是一種蛋白質(zhì)，能識別并與調(diào)控序列中的結(jié)合位點結(jié)合，能催化DNA轉(zhuǎn)錄為RNA啟動子終止子啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止DNA的轉(zhuǎn)錄起始密碼子？終止密碼子？第21頁/共43頁細胞的基因結(jié)構(gòu)與RNA聚合酶結(jié)合位點RNA聚合酶AGGTCACGTCGTCCAGTGCAGCAGGUCACGUCGRNA聚合酶啟動子終止子第22頁/共43頁成熟mRNA反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄法合成目的基因cDNAcDNA不含非編碼區(qū)的啟動子、終止子不含編碼區(qū)的內(nèi)含子第23頁/共43頁基因表達載體的組成：目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。基因表達載體的構(gòu)建a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標記基因e、復制原點基因的運載體、目的基因、啟動子、終止子和標記基因等都是DNA片斷，如何將它們連接起來？第24頁/共43頁質(zhì)粒目的基因限制酶DNA連接酶重組DNA第25頁/共43頁質(zhì)粒DNA分子一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種限制酶

目的基因與運載體的結(jié)合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程?；虮磉_載體的構(gòu)建質(zhì)粒中插入啟動子、終止子和標記基因等DNA片斷，也是同樣的重組方法第26頁/共43頁將目的基因?qū)胧荏w細胞

轉(zhuǎn)化目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程。第27頁/共43頁將目的基因?qū)胧荏w細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射技術(shù)感受態(tài)法受體細胞植物細胞動物細胞原核細胞第28頁/共43頁農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法適用于雙子葉植物裸子植物第29頁/共43頁適用于單子葉植物基因槍法第30頁/共43頁胚珠花藥花絲柱頭花柱子房壁子房雄蕊雌蕊第31頁/共43頁花粉管通道法適用于被子植物第32頁/共43頁將目的基因?qū)雱游锛毎俜椒ǎ猴@微注射法②程序：目的基因表達載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫╋@微注射受精卵新性狀動物第33頁/共43頁將目的基因?qū)胛⑸锛毎僭松锾攸c：繁殖快、單細胞、遺傳物質(zhì)少②方法：

用Ca2+處理細胞感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA分子第34頁/共43頁

1、基因工程中科學家常采用細菌、酵母菌等微生物作為受體細胞，原因是()A．結(jié)構(gòu)簡單，操作方便B．繁殖速度快C．遺傳物質(zhì)含量少、簡單D．性狀穩(wěn)定,變異少B第35頁/共43頁目的基因的表達和檢測接種實驗抗原－抗體雜交法DNA-RNA分子雜交法DNA分子雜交法受體是否具有轉(zhuǎn)基因特征個體水平目的基因是否翻譯目的基因是否轉(zhuǎn)錄目的基因是否導入分子水平方法檢測對象第36頁/共43頁DNA分子雜交采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。第37頁/共43頁A-A-32PT-T-C-G-T--G32P-T-T-A-A-C-AX1C-C-A-G-T-T-A-X2-G-G-T-C-A-A-TY1A-A-T-T-C-G-T-Y1-T-T-A-A-G-C-A探針待測DNAX待測DNAY待測DNAY與探針DNA相同檢測目的基因是否導入受體細胞目的DNA片段檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA第38頁/共43頁目的基因蛋白質(zhì)小鼠體內(nèi)抗體目的基因受體細胞蛋白質(zhì)抗原抗原雜交分子檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)----抗原抗體雜交第39頁/共43頁

具體做法是：

第一步，將目的基因在大腸桿菌中表達出蛋白質(zhì)；

第二步，將表達出的蛋白質(zhì)注射動物進行免疫，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，并提取出抗體（一抗）；

第三步，從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，走凝膠電泳；

第四步，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；

第五步，將抗體（一抗）與硝酸纖維素膜上的蛋白雜交，這時抗體（一抗）與目的基因表達的蛋白（抗原）會特異結(jié)合。

由于這種抗原—抗體的結(jié)合顯示不出條帶，所以加入一種稱為二抗的抗體，它可以與一抗結(jié)合，二抗抗體上帶有特殊的標記。如果目的基因表達出了蛋白質(zhì)，則結(jié)果為陽性。檢測目