基因轉(zhuǎn)化方法與轉(zhuǎn)基因植株鑒定

基因轉(zhuǎn)化方法與轉(zhuǎn)基因

植株鑒定當(dāng)前1頁，總共55頁。目的(外源)基因的導(dǎo)入

(1)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化(2)DNA理化轉(zhuǎn)移方法電融合法(電激法)

基因槍法微注射超聲波處理法(3)種質(zhì)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化法主要包括花粉管通道法、胚囊及子房注射法和生殖細(xì)胞浸泡法。當(dāng)前2頁，總共55頁。一、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因?qū)?植物細(xì)胞)TransferringgenesintoplantcellsbycointegrationusingT-DNA，Tiplasmids，andagrobacterium基因?qū)敕椒?當(dāng)前3頁，總共55頁。1農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備（1）挑取農(nóng)桿菌（EHA105）單菌落接種于2.0mlYEB培養(yǎng)液中，28℃培養(yǎng)過夜。（2）取400μl菌液置于50mlYEB液體培養(yǎng)基中，28℃，220rpm，培養(yǎng)5-6hr，培養(yǎng)置OD600達(dá)到0.3~0.5。（3）菌液倒入5.0ml的離心管中，4℃，4000~5000rpm離心3min。（4）菌體懸浮于2ml0.15MNaCl，10000rpm離心3min。（5）用1ml預(yù)冷的20mMCaCl2輕輕懸浮，置于4℃，24hr內(nèi)現(xiàn)用。當(dāng)前4頁，總共55頁。2表達(dá)載體向農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化（1）取200μl農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，加入10~20μl質(zhì)粒DNA，冰浴30min。（2）液氮中速凍3~5min，37℃水浴5min。（3）加入1mlYEB培養(yǎng)液，28℃，150rpm，培養(yǎng)4hr。（4）10,000rpm離心30sec，去上清。（5）再加入200μlYEB培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，涂布于YEB平板（含適量抗生素），28℃培養(yǎng)2d。當(dāng)前5頁，總共55頁。3陽性克隆的鑒定挑取平板上長出的單菌落，接種于YEB液體培養(yǎng)液（含有100μg/mlKan和125μg/mlRif）中，28°C振蕩培養(yǎng)過夜；小量提取質(zhì)粒DNA，以質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。當(dāng)前6頁，總共55頁。4、遺傳轉(zhuǎn)化(葉盤法)（1）無菌苗的獲得（試驗(yàn)材料）

當(dāng)前7頁，總共55頁。（2）預(yù)培養(yǎng)取預(yù)出真葉的無菌子葉，剪去葉尖及葉柄部，置于無抗生素的MS固體培養(yǎng)基上，28℃預(yù)培養(yǎng)2d。

當(dāng)前8頁，總共55頁。（3）用于轉(zhuǎn)化番茄的農(nóng)桿菌菌液的準(zhǔn)備挑取農(nóng)桿菌單菌落接種于YEB液體培養(yǎng)基（100mg/LKan和25mg/LRif）中，28℃振蕩培養(yǎng)至OD600約0.6~0.8，5000rpm離心集菌5min，用MS重新懸浮菌體，并將菌液稀釋10倍。

當(dāng)前9頁，總共55頁。（4）侵染、共培養(yǎng)將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的葉片放置于稀釋10倍的菌液中，侵染5min，期間不斷搖動。取出外植體，用濾紙吸干多余菌液，置于無抗生素的培養(yǎng)基上共培養(yǎng)（28℃暗培養(yǎng)2d）。當(dāng)前10頁，總共55頁。（5）抗性芽篩選經(jīng)共培養(yǎng)2d的葉片轉(zhuǎn)入含抗生素的培養(yǎng)基上，三周左右長出不定芽和愈傷組織，每2~3周繼代培養(yǎng)一次。

當(dāng)前11頁，總共55頁。

轉(zhuǎn)化1天轉(zhuǎn)化2周煙草抗性愈傷的篩選篩選培養(yǎng)基：MS+3mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+200mg/LKan+250mg/LCef當(dāng)前12頁，總共55頁。轉(zhuǎn)化6周轉(zhuǎn)化煙草抗性芽篩選篩選培養(yǎng)基：MS+3mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+200mg/LKan+250mg/LCef當(dāng)前13頁，總共55頁。（6）生根培養(yǎng)待抗性芽長到3cm，移入生根培養(yǎng)基，2~3周后可觀察到幼根長出。當(dāng)前14頁，總共55頁。轉(zhuǎn)化植株生根篩選生根培養(yǎng)基：MS基本培養(yǎng)基+200mg/LKan+250mg/LCef當(dāng)前15頁，總共55頁。（7）移栽將生根良好的植株從三角瓶中小心取出，避免損害根莖，用水沖去多余的瓊脂，移入用水浸透的滅菌土中（蛭石：營養(yǎng)土=1：3）。當(dāng)前16頁，總共55頁。激素適宜濃度的篩選葉盤法轉(zhuǎn)化番茄體系的優(yōu)化當(dāng)前17頁，總共55頁。葉盤法轉(zhuǎn)化番茄體系的優(yōu)化農(nóng)桿菌適宜稀釋濃度的篩選

1、菌液原液：侵染后不久外植體失綠，變灰暗，并且逐漸萎蔫。2、稀釋10倍：外植體有較多的愈傷及不定芽的分化。3、稀釋20倍：外植體有愈傷及不定芽的分化，但不如10好。農(nóng)桿菌適宜侵染時(shí)間的篩選

侵染時(shí)間分別為5min、10min和20min：隨著農(nóng)桿菌侵染時(shí)間的延長，番茄子葉外植體受到的傷害也逐漸加大，以至不能正常分化出不定芽。根據(jù)結(jié)果認(rèn)為5min是較適宜的侵染時(shí)間。當(dāng)前18頁，總共55頁。葉盤法轉(zhuǎn)化番茄體系的優(yōu)化乙酰丁香酮對轉(zhuǎn)化率的影響

在侵染的菌液和篩選培養(yǎng)基中均加入了200μM的乙酰丁香酮，根據(jù)觀察結(jié)果，加入乙酰丁香酮的外植體與對照相比其分化情況沒有明顯差異，表明加入乙酰丁香酮與否不能有效提高番茄突變體Chloronerva的轉(zhuǎn)化率。

適宜Kan濃度的篩選

以Kan濃度(mg/L)50、75、100為篩選梯度Kan濃度為75和100mg/L的培養(yǎng)基上，多數(shù)外植體開始變白，而在Kan濃度為50mg/L的培養(yǎng)基上，大部分外植體還保持綠色，不定芽的分化較好。

當(dāng)前19頁，總共55頁。葉盤法轉(zhuǎn)化番茄體系的優(yōu)化適合于番茄突變體Chloronerva的遺傳轉(zhuǎn)化體系

（1）預(yù)培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基為MS+ZT2.0mg/L+IAA0.2mg/L，培養(yǎng)時(shí)間2d。（2）共培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基為MS+ZT2.0mg/L+IAA0.2mg/L，28℃黑暗培養(yǎng)2d。（3）篩選培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基MS+ZT2.0mg/L+IAA0.2mg/L+Kan50mg/L+Cef250mg/L。（4）生根培養(yǎng)條件：生根培養(yǎng)基采用：1/2MS+Kan25mg/L+Cef250mg/L。當(dāng)前20頁，總共55頁。轉(zhuǎn)化番茄抗性芽篩選

當(dāng)前21頁，總共55頁?？剐匝坑善矫筠D(zhuǎn)入瓶中培養(yǎng)篩選培養(yǎng)基：MS+ZT2.0mg/L+IAA0.2mg/L+Kan50mg/L+Cef250mg/L當(dāng)前22頁，總共55頁。AChloronervaB35S::MxNas1篩選植株生根培養(yǎng)生根培養(yǎng)基：1/2MS+Kan25mg/L+Cef250mg/LA突變體ChloronervaB轉(zhuǎn)化植株當(dāng)前23頁，總共55頁。轉(zhuǎn)化植株生根后轉(zhuǎn)入土培轉(zhuǎn)基因番茄互補(bǔ)突變體Chloronerva表型當(dāng)前24頁，總共55頁。轉(zhuǎn)化小金海棠

當(dāng)前25頁，總共55頁。

轉(zhuǎn)基因煙草表型分析當(dāng)前26頁，總共55頁。轉(zhuǎn)基因煙草表型分析當(dāng)前27頁，總共55頁。MxIRT1轉(zhuǎn)化擬南芥當(dāng)前28頁，總共55頁?；?qū)敕椒?二、基因槍法(Biolistic-bombardment)(植物細(xì)胞)當(dāng)前29頁，總共55頁。基因槍（particlegun）又稱微彈轟擊法（microprojectilebombardment,particlebombardment,biolistic)。最早是由Cornell大學(xué)研制的火藥基因槍。1990年，美國杜邦公司推出了商品基因槍PDS-1000系統(tǒng)?；驑尩慕M成部分有：點(diǎn)火裝置、發(fā)射裝置、擋板、樣品室、真空系統(tǒng)組成?；驑屴D(zhuǎn)化的基本步驟如下：

DNA微彈的制備

DNA-微彈載體的制備

靶外植體準(zhǔn)備

DNA微彈轟擊

轟擊后外植體的培養(yǎng)

當(dāng)前30頁，總共55頁?；?qū)敕椒?三、電擊法(Genetransferbyelectroporation)當(dāng)前31頁，總共55頁。四、花粉管通道法花粉管通道法是利用植物授粉后所形成的天然的花粉管通道（又叫花粉管引導(dǎo)組織），經(jīng)珠心通道，將外源DNA攜帶入胚囊，轉(zhuǎn)化受精卵或其前后的生殖細(xì)胞（精子、卵子），由于它們?nèi)蕴幱谖葱纬杉?xì)胞壁的類似“原生質(zhì)體”狀態(tài)，并且正在進(jìn)行活躍的DNA復(fù)制、分離和重組，所以很容易將外源DNA片段整合到受體基因組中，以達(dá)到遺傳轉(zhuǎn)化之目的。當(dāng)前32頁，總共55頁。該方法可用于任何開花植物，將供體總DNA的片斷，在受體自花授粉后一定時(shí)期涂抹于柱頭上，使能沿著花粉管通道進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化受精卵或其前后的細(xì)胞。實(shí)際應(yīng)用時(shí)一般切除柱頭進(jìn)行涂抹，這樣可減少DNA進(jìn)入胚囊的距離，提高轉(zhuǎn)化率，但會影響結(jié)實(shí)率。當(dāng)前33頁，總共55頁。轉(zhuǎn)基因植物的鑒定當(dāng)前34頁，總共55頁。轉(zhuǎn)基因植物的鑒定遺傳鑒定表達(dá)鑒定表型分析鑒定利用報(bào)告基因Northern雜交Western雜交

直接鑒定DNA分子是否整合到基因組上。1）擴(kuò)增目的片段；2）雜交信號鑒定。（Southern雜交）當(dāng)前35頁，總共55頁。檢測拷貝數(shù)一、Southernblot檢測當(dāng)前36頁，總共55頁。Southernblot制作探針：----- 根據(jù)試劑盒的要求確定DNA用量，一般不超過100ng.------ 反應(yīng)結(jié)束后對探針最好用層析柱進(jìn)行純化當(dāng)前37頁，總共55頁。-----不同的植物用于Southern雜交的DNA量不同，一般每泳道的擬南芥DNA的用量為10-25ug.-----一般用高于酶切需要量DNA的10倍酶量，DNA的濃度不要過高。注意不同的酶要求的反應(yīng)溫度不一樣。-----酶切后取少量樣品檢測酶切是否完全，如果不完全，可加酶后繼續(xù)酶切。DNA酶切當(dāng)前38頁，總共55頁。根據(jù)酶切后的目的片斷大小，一般采用0.7或0.8%的agarose。但當(dāng)酶切后目的片斷較小時(shí)，要適當(dāng)提高膠的濃度。記住電泳時(shí)兩邊的泳道要加標(biāo)準(zhǔn)分子標(biāo)記。電泳是電壓不要過高，一般為1v/cm。最好電泳完畢后進(jìn)行染色。電泳完畢要用比例尺對膠進(jìn)行照相。DNA凝膠電泳當(dāng)前39頁，總共55頁。對膠的后處理：如果片斷較大（〉15kb)，凝膠需在0.2MHCl中處理10分鐘用水漂洗凝膠，加入1.5MNaCl,0.5MNaOH,處理45分鐘，并輕輕搖動。用水漂洗凝膠，與1MTis-HCl,(pH7.4),1.5MNaCl,輕輕搖動，中和15分鐘，當(dāng)前40頁，總共55頁。一般用尼龍莫一般實(shí)驗(yàn)室多采用毛細(xì)管法轉(zhuǎn)膜緩沖液一般為10X的SSC或SSPE,轉(zhuǎn)膜時(shí)間一般為48hr。用UV確認(rèn)轉(zhuǎn)膜是否完全。固定：UV0.4MNaOH,80oC烘烤1.5-2小時(shí)轉(zhuǎn)膜當(dāng)前41頁，總共55頁。Upwardcapillarytransfer5-8cm400g當(dāng)前42頁，總共55頁。二、Northernblot從植物中提取RNA方法1.熱酚法試劑： 提取緩沖液： 100mMLiCl 1%SDS 100mMTris-HCl(p8.0) 10mMEDTA TE緩沖液飽和酚 氯仿

4MLiCl

乙醇

75%乙醇

300mM醋酸鈉（pH5.2)當(dāng)前43頁，總共55頁。0.05%DEPCH2O(1LH2O中加入0.5mlDEPC,搖動混合4小時(shí)以上，120oC,滅菌30分鐘）20XMOPS: 0.4MMOPS 0.1MCH3COONa 0.02MEDTA pH7.0---500ml20XMOPS中，加大約 5.5克KOH后，慢慢調(diào)至pH7.0. 120oC,滅菌45分鐘.37%甲醛甲酰胺（-20oC保存）30%過氧化氫試劑當(dāng)前44頁，總共55頁。10mg/mlEtBr10XDye: 50%Glycerol,1mMEDTA,0.4%溴酚蘭， 0.4%二甲苯青FF,用DEPC處理水調(diào)制20XSSPEor20XSSC,

當(dāng)前45頁，總共55頁。-----電泳槽用5%過氧化氫處理2個小時(shí)以上，DEPC處理水清洗2次。-----滅菌、RNA專用瓶中加入80mlDEPC處理水及1.2克瓊脂糖，微波爐加熱溶解，60oC水浴上放置15分鐘，加入5ml20xMOPS及15ml甲醛溶液，灌膠。與通風(fēng)櫥中進(jìn)行。變性凝膠制備當(dāng)前46頁，總共55頁。----RNA加樣緩沖液：

35ul37%甲醛

100ul甲酰胺

5ul20XMOPS 20ul