分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的溶液和緩沖液

PAGEPAGE118附錄一分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的溶液和緩沖液酸、堿和鹽溶液的配制鹽酸（HCl，分子量36.5，重量百分比36%），1mol/L按以下順序混合：912.5mLH2O；87.5mL濃鹽酸。鹽酸（HCl，分子量36.5，重量百分比36%），0.25N/L按以下順序混合：978.4mLH2O；21.6mL濃鹽酸。硫酸（H2SO4，分子量98.07，重量百分比96%），1mol/L按以下順序混合：944.8mLH2O；55.6mL濃硫酸。硝酸（HNO3，分子量63.02，重量百分比71%），1mol/L按以下順序混合：937.5mLH2O；62.5mL硝酸冰醋酸（CH3COOH，分子量60.05，重量百分比99.5%），1mol/L按以下順序混合：942.5mLH2O；57.5mL冰醋酸。乙酸（CH3COOH，分子量60.5，重量百分比36%），1mol/L按以下順序混合：840.5mLH2O；159.5mL乙酸。甲酸（HCOOH，分子量46.02，重量百分比90%），1mol/L按以下順序混合：957.3mLH2O；42.7mL甲酸。高氯酸（HClO4，分子量100.5，重量百分比70%），1mol/L按以下順序混合：914.5mLH2O；85.5mL高氯酸。氫氧化鉀（KOH，分子量56.1），1mol/L56.0gKOH溶解于1LH2O中。氫氧化鈉（NaOH，分子量40.0），1mol/L將40.0gNaOH溶解于450mLH2O中，補(bǔ)加H2O至1L。氫氧化鈉(NaOH，分子量40.0)，10mol/L將400gNaOH溶于450mL水中，補(bǔ)加H2O至1L。氨水（NH4OH，分子量35.0，重量百分比25%），1mol/L按以下順序混合：924.9mLH2O；75.1mL氨水。尿素（CH4N2O，分子量60.06），8mol/L分批將480.5g尿素溶解在600mL蒸餾水中，加H2O定容只至1L，過(guò)濾滅菌。氯化鈉（NaCl，分子量58.5），5mol/L將292.5gNaCl溶于450mLH2O中，補(bǔ)加H2O至1L。氯化鉀（KCl，分子量74.5），1mol/L將74.5gKCl溶于450mLH2O中，補(bǔ)加H2O定容至1L。氯化鎂（MgCl2，分子量203.3），1mol/L將203.3gMgCl2·6H2O溶于450mLH2O中，加H2O至1L，高壓滅菌。硫酸鎂（MgSO4，分子量246.5），1mol/L將246.5gMgSO4·7H2O溶于450mLH2O中，加H2O至1L。氯化鈣（CaCl2，分子量147.0或219.1），1mol/L將147.0gCaCl2·2H2O溶于450mLH2O中，加H2O至1L，或?qū)?19.1gCaCl2·6H2O溶于450mLH2O中，加H2O至1L。二、各種常見(jiàn)緩沖液和平衡鹽的配制10%SDS（十二烷基硫酸鈉鹽）：稱取100gSDS溶解在800mL水中，置68℃水浴中溶解，加數(shù)滴濃鹽酸調(diào)pH到7.2，定容到1000mL禽血DNA提取裂解液：2mol/L尿素100mmol/LTris·HCl（pH8.0）1%SDS100mmol/LEDTA現(xiàn)配現(xiàn)用，無(wú)需滅菌。配制方法：600mL蒸餾水中，順序加入120.12g尿素，待溶解后加入100mL1mol/LTris（pH8.0），溶解后加入37.2gNa2EDTA·2H2O，溶解后緩緩加入20%SDS50m細(xì)菌DNA提取裂解液Ⅰ：25mmol/LTris·HCl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0），50mmol/L葡萄糖，使用前加溶菌酶（2mg/mL）。細(xì)菌DNA提取裂解液Ⅱ（堿-1%SDS）：1%（W/V）SDS溶解在0.2mol/LNaOH中。酚(phenol)：（1）現(xiàn)在有商品酚可直接購(gòu)買，但是要注意酚的pH值。（2）酚的純化和配制（提取核酸用的酚溶液）：如果購(gòu)的酚不純，例如市售酚含有雜質(zhì)，常呈粉色或淡黃色，需要重蒸二次：用前從冰箱中取出，在68℃水浴鍋中溶解結(jié)晶酚，160℃左右蒸餾后，冷卻至0℃，加入8-羥基喹啉（100g酚加0.1g8-羥基喹啉），酚變?yōu)辄S色，8-羥基喹啉是抗氧化劑，并能部分抑制核糖核酸酶，含8-羥基喹啉的酚用等體積0.5mol/LTris-Cl（pH8.0）磁力攪拌器攪拌20min，約半小時(shí)后兩相完全分開，用真空抽液器盡可能吸去上層水相，再加入等體積的0.1mol/LTris（pH8.0）至酚中，攪拌20min，再吸去上層水相，反復(fù)數(shù)次，至酚相pH值大于7.8，加入0.2%β酚—氯仿—異戊醇：酚、氯仿和異戊醇按25∶24∶1（V/V）混合而成，加終濃度為0.1%的8-羥基喹啉，上面覆蓋一層1cm厚的0.1mol/LTris（pH8.0），分成幾份儲(chǔ)存于-20℃，超過(guò)6個(gè)月則廢棄。它用來(lái)除去核酸中的蛋白質(zhì)，異戊醇能消泡沫，有利于水相和有機(jī)相分開，氯仿—Tris-Cl[Tris（三羥甲基氨基甲烷）]，1mol/L在800mL水中溶解121.1gTris，常溫下用濃鹽酸調(diào)至所需的pH值，常用pH7.4，或pH8.0，混勻后加水定容至1L，高壓滅菌。要獲得所需的某一特定pH的0.1mol/LTris·HCl緩沖液的配制，可通過(guò)將一定數(shù)量的0.1mol/LHCl和100mL0.1mol/LTris溶液混合，如下表附－1所示：表附－1特定pH的0.1mol/LTris·HCl緩沖液的配制所需的0.1mol/LHCl的毫升數(shù)pH(25℃mol/LHCl（mL）pH(25℃0.1mol/LHCl（mL）pH(25℃0.1mol/LHCl（mL）7.289.47.869.08.434.47.386.87.964.08.529.47.484.08.058.48.624.87.580.68.152.48.720.67.677.08.245.88.817.07.773.28.339.88.914.0注意：Tris緩沖液的pH值隨溫度變化較大，每1℃Tris·HCl，pH6.8,4×：在40mLH2O中溶解6.05gTris(0.5mol/L)，用1mol/LHCl調(diào)至pH6.8，補(bǔ)加H2O至整體積100mL，用0.45μm濾膜過(guò)濾溶液后于Tris?HCl，pH8.8,8×：在300mLH2O中溶解182gTris(3mol/L)，用1mol/LHCl調(diào)至pH8.8，補(bǔ)加H2O至整體積500mL，用0.45μm濾膜過(guò)濾溶液后于Tris?HCl/SDS，pH8.8,4×：在300mLH2O中溶解91gTris(1.5mol/L)，用1mol/LHCl調(diào)至pH8.8，補(bǔ)加H2O至總體積500mL，用0.45μm濾膜過(guò)濾溶液，再加入2gSDS[0.4%(W/V)]Tris?HCl/SDS，pH6.8,8×：在40mLH2O中溶解6.05gTris(0.5mol/L)，用1mol/LHCl調(diào)至pH6.8，補(bǔ)加H2O至總體積100mL，用0.45μm濾膜過(guò)濾溶液，再加入0.4gSDS[0.4%(W/V)Tris?HCl/SDS，pH8.45：在300mLH2O中溶解182gTris（3.0mol/L），用1mol/LHCl調(diào)至pH8.45，補(bǔ)加H2O至總體積500mL。用0.45μm濾膜過(guò)濾溶液，再加入1.5gSDS[0.3%(W/VMOPS（3-嗎啉代丙磺酸，分子量209.3）電泳緩沖液，10×：0.4mol/LMOPS，pH7.00.5mol/LNaAc0.01mol/LEDTAHEPES（4-（2-羥乙基）哌嗪-1-乙磺酸），分子量238.3）緩沖鹽水（HeBS）：137mmol/LNaCl5mmol/LKCl0.7mmol/LNa2HPO46mmol/L葡萄糖21mmol/LHEPES調(diào)至pH7.05；因?yàn)檫@是一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，因此應(yīng)仔細(xì)檢測(cè)。HEPES緩沖鹽水（ＨeBS），２×：16.4gNaCl(0.283mol/L)，0.2gNa2HPO411.9gHEPES酸（0.023mol/L）加H2用5mol/LNaOH調(diào)至pH7.05(精確的pH值對(duì)有效的轉(zhuǎn)染特別重要)，過(guò)濾除菌。許多研究者常配制大量的2×HeBS，對(duì)溶液的轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行檢測(cè)后將其等量分裝成50mL一份凍存。從兩批2×HeBS溶液獲得的轉(zhuǎn)染效率可能有較大的差異。每一批新鮮配制的溶液都要檢查其轉(zhuǎn)染效率。通過(guò)將0.5mL2×HeBS與0.5mL250mmol/LCaCl2溶液混合并旋渦振蕩可快速檢測(cè)2×HeBS溶液的轉(zhuǎn)染效率。在顯微鏡下即可很快觀測(cè)到微小的沉淀形成。溶液的轉(zhuǎn)染效率必須一直檢查，但如果在檢查時(shí)溶液中不形成沉淀，這可能發(fā)生了某種錯(cuò)誤。Hanks平衡鹽溶液(HBss)：5.4mmol/LKCl0.3mmol/LNa2HPO40.4mmol/LKH2PO44.2mmol/LNaHCO31.3mmol/LCaCl20.5mmol/LMgCl20.6mmol/LMgSO4137mmol/LNaCl5.6mmol/LD-葡萄糖0.02%(W/V)酚紅(可選)加H2O至1L并調(diào)pH至7.4HBss可從Biofluids或Whittaker公司購(gòu)買。不含CaCl2和MgCl2的HBss可配制或購(gòu)買。其中可選用的成分通常對(duì)實(shí)驗(yàn)并無(wú)影響，但它們的出現(xiàn)可能對(duì)某一過(guò)程有損害。針對(duì)單個(gè)的方案，決定是否使用這些成分并在“材料”欄中進(jìn)行了推薦。TE緩沖液，pH7.4，7.5，或8.0：10mmol/LTris·HCl，pH7.4，7.5，或8.01mmol/LEDTA，pH8.0TAE（Tris-乙酸）電泳緩沖液：50×貯存液，pH約8.5：242gTris堿57.1mL冰醋酸37.2gNa2EDTA·2H2O加H2O至1L1×工作液：40mmol/LTris·Ac2mmol/LEDTA1mg/mLBSA（可選）TBE（Tris-硼酸）電泳緩沖液：10×貯存液：108g55g硼酸40mL0.5mol/LEDTA，pH8.0加H2O至1L1×工作液：89mmol/LTris89mmol/L硼酸2mmol/LEDTATPE（Tris-磷酸）電泳緩沖液：10×貯存液：108gTris堿15.5mL85%（1.679g/mL）磷酸40mL0.5mol/LEDTA，pH8.0TM緩沖液，10×：100mmol/LTris·HCl，pH8.0100mmol/LMgCl2在150mLH2O中溶解385.4gNH4AcTES緩沖液：10mmol/LTris·HCl，pH8.010mmol/LNaCl1mmol/LEDTA堿性電泳加樣緩沖液（Loadingbuffer），10×：18%（W/V）Ficoll4006mmol/LNa2EDTA，pH8.030mmol/LNaOH0.25%(W/V)溴甲酚藍(lán)0.25%(W/V)二甲苯青FF（可選；遷移速度只有溴酚藍(lán)的約50%，而且可能干擾中等量分裝子量蛋白帶的顯色，但它可對(duì)長(zhǎng)時(shí)間的電泳提供有益的指示）。于4℃電泳加樣緩沖液Ⅰ，6×：0.25%(W/V)溴酚藍(lán)，0.25%(W/V)二甲苯青FF，30%甘油水溶液，于4℃電泳加樣緩沖液Ⅱ,6×：0.25%(W/V)溴酚藍(lán)，0.25%(W/V)二甲苯青FF，40%蔗糖水溶液，于4℃電泳加樣緩沖液Ⅲ，6×0.25%(w/v)溴酚藍(lán)，0.25%(W/V)二甲苯青FF，15%聚蔗糖（Ficoll400）水溶液，于4℃溴化乙錠，10mg/mL：在20mLH2O中溶解0.2g溴化乙錠，磁力攪拌數(shù)小時(shí)以確保其完全溶解，混勻后于4℃EDTA鈉鹽（乙二胺四乙酸二鈉），0.5mol/L：在700mLH2O中溶解186.1gNa2EDTA·2H2O，用10mol/LNaOH調(diào)至pH8.0（約50mL），補(bǔ)加H2O定容至1L，高壓滅菌。二硫蘇糖醇（DTT），1mol/L：在100mLH2O中溶解15.45gDTT，于－20℃SSC，20×：3mol/LNaCl（175.5g）0.3mol/L檸檬酸三鈉·2H2O（88.2g/L）用1mol/LHCl或10mol/LNaOH溶液調(diào)校至pH7.0加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。SSPE，20×：174gNaCl，27.6gNaH2PO4·2H2O，7.4gNa2EDTA·2H2O溶解在800mL水中，用10mol/LNaOH調(diào)pH到7.4，再加水到1L，高壓滅菌。乙酸氨（NH4Ac），10mol/L將770.8gNH4Ac溶解在800mL蒸餾水中，加H2O定容至1L乙酸鈉（NaAc，pH5.2，pH8.0），3mol/L：將408.1gNaAc·3H2O溶于水，用3mol/L冰乙酸調(diào)校至pH5.2，或稀釋過(guò)的冰乙酸調(diào)pH值至7.0，補(bǔ)加水定容至1L。乙酸鈉緩沖液，0.1mol/L：溶液A：11.55mL冰醋酸/L（0.2mol/L）溶液B：27.2gNaAc·3H2O/L（0.2mol/L）參照表2找到所需的pH值，按表中給出的溶液體積分別將溶液A和溶液B混合，然后用H2O稀釋至200mL（詳情請(qǐng)見(jiàn)乙酸鉀緩沖液配方）。乙酸鉀溶液，pH4.8，5mol/L：29.5mL冰乙酸KOH顆粒調(diào)校至pH4.8（幾粒）H2O加至100mL室溫保存（不可高壓滅菌）乙酸鉀溶液，pH5.5，3mol/L：294gKAc50mL90%甲酸（1.18mol/L）加水至1L乙酸鉀鹽緩沖液，0.1mol/L：溶液A：11.55mL冰醋酸（0.2mol/L）溶于1000mL水中溶液B：19.6gKAc（0.2mol/L）溶于1000mL水中參照表附1－2找到所需的pH值，混合一定體積的溶液A和溶液B，然后用H2O稀釋至200mL。在一定體積內(nèi)通過(guò)擴(kuò)大乙酸鉀的量可以把濃度提高5～10倍。乙酸緩沖液具有濃度依賴性的pH變化，所以把一份的量稀釋至最終濃度后再檢測(cè)濃縮液的pH值。如制備緩沖液的pH值在表2所列值之間，則先制備最接近的高pH值，再用溶液A調(diào)pH。表附1－2制備0.1mol/L乙酸鈉和乙酸鉀緩沖液pH值溶液A（mL）溶液B（mL）3.646.33.73.844.06.04.041.09.04.236.813.24.430.519.54.625.524.54.820.030.05.014.835.25.210.539.55.48.841.25.64.845.2a得到惠許選自CRC，1975。磷酸緩沖鹽溶液（PBS），10×和1×：10×貯存液，1000mL：1×工作液，pH約為7.3：80gNaCl137mmol/LNaCl2gKCl2.7mmol/LKCl11.5gNa2HPO4·7H2O4.3mmol/LNa2HPO4·7H2O2gKH2PO41.4mmol/LKH2PO4磷酸鉀緩沖液，1mol/L，pH8.0：A：1mol/LK2HPO4B：1mol/LKH2PO4將A液加到B液中至pH8.0磷酸鈉緩沖液，0.1mol/L：溶液A：27.8gNaH2PO4·2H2O（0.2mol/L）溶于100mL水中。溶液B：53.65gNa2HPO4·7H2O或71.7g（0.2mol/L）Na2HPO4·12H2O溶于1000mL水中。參照表3找到所需的pH值，按所給出的溶液A和溶液B體積混合，然后補(bǔ)加H2O至200mL（詳情見(jiàn)磷酸鉀緩沖液配方）。磷酸鉀緩沖液，0.1mol/L：溶液A：27.2gKH2PO4（0.2mol/L）溶于1000mL水中溶液B：45.6gK2HPO4（0.2mol/L）溶于1000mL水中參照表附－3所列pH值，混合一定體積的溶液A和溶液B，然后用H2O稀釋至200mL。可擴(kuò)大磷酸鉀的量制備5～10倍的濃縮液。磷酸鹽緩沖液具有濃度依賴性的pH變化，稀釋至最終濃度后再檢測(cè)濃縮液的pH值。表附－3制備0.1mol/L磷酸鈉和磷酸鉀緩沖液apH值溶液A（mL）溶液B（mL）pH值溶液A（mL）溶液B（mL）5.793.56.56.945.055.05.892.08.07.039.061.05.990.010.07.133.067.06.087.712.37.228.072.06.185.015.07.323.077.06.281.018.57.419.081.06.377.522.57.516.084.06.473.526.57.613.087.06.568.531.57.710.590.06.662.537.57.88.591.56.756.543.57.97.093.06.851.049.08.05.394.7得到惠許選自CRC，1975。溴化乙錠檢測(cè)液：將10mL10×TNE緩沖液加入89.5mLH2O中，用0.45之所以要過(guò)濾后補(bǔ)加染料，是因?yàn)檫^(guò)濾時(shí)溴化乙錠可與絕大多數(shù)濾膜結(jié)合。小心：溴化乙錠具有毒性，在進(jìn)行操作、貯存和處理時(shí)應(yīng)戴手套并十分小心。葡萄糖/Tris/EDTA（GTE）溶液：50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris·HCl，pH8.010mmol/LEDTA，pH8.0NaOH/SDS溶液：0.2mol/LNaOH1%（W/V）SDS用10mol/LNaOH和10%SDS新鮮配制CaCl2溶液：60mmol/LCaCl215%（V/V）甘油10mmol/LPIPES，pH7.0使用一次性過(guò)濾除菌，或高壓滅菌。β-巰基乙醇（BME）：一般得到的是14.4mol/L溶液，應(yīng)裝在棕色瓶中保存4℃Ｘ-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）溶液：Ｘ-gal用二甲基甲酰胺溶解配制成20mg/mL的儲(chǔ)存液。用PBS制備：5～35mmol/LK3Fe(CN)6(鐵氰化鉀)5～35mmol/LK3Fe(CN)6?3H2O(亞鐵氰化鉀)1～2mmol/LMgCl2或MgSO4臨用前，加入溶于二甲基甲酰胺中的40×X-gal至終濃度1mg/mL小心：應(yīng)避免接觸和吸入氰化物，按實(shí)驗(yàn)室操作指南丟棄廢物。使用的鐵和亞鐵氰化物的量對(duì)獲得最佳結(jié)果十分關(guān)鍵。量越多引起吲哚的沉淀越快，這樣可減少擴(kuò)散。然而，盡管至細(xì)胞系中不經(jīng)常出現(xiàn)，但在某些組織中延長(zhǎng)溫育時(shí)間（過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間）可能會(huì)產(chǎn)生綠色背景。前三個(gè)成分（包括X-gal）在室溫至少可保存幾個(gè)月，40×X-gal可在玻璃容器或聚丙烯管中用錫箔紙包裹好于—20℃碘化鈉（NaI）溶液，6mol/L：將0.75gNa2SO3溶于40mL水中，加入45gNaI（Sigma）并攪拌直至完全溶解（約30min）。用Whatman濾紙或硝酸纖維素膜過(guò)濾，在暗處可貯存3~4個(gè)月（用錫箔紙嚴(yán)密包裹）。如果出現(xiàn)可見(jiàn)的沉淀應(yīng)該丟棄。消化緩沖液：100mmol/LNaCl10mmol/LTris·HCl，pH8.025mmol/LEDTA，pH8.00.5%（W/V）SDS0.1mg/mL蛋白酶K蛋白酶K不穩(wěn)定，應(yīng)在每次臨用前加入。高鹽TE緩沖液：10mmol/LTris·HCl，pH8.00.1mmol/LEDTA，pH8.01mol/LNaCl于室溫保存（可以在幾年內(nèi)保持穩(wěn)定）CTAB抽提液：2%（W/V）CTAB（十六烷基三乙酸溴化銨）100mmol/LTris·HCl，pH8.020mmol/LEDTA，pH8.01.4mol/LNaCl于室溫保存（可以在幾年內(nèi)保持穩(wěn)定）CTAB/NaCl溶液（10%CTAB/0.7mol/LNaCl）：在80mL水中溶解4.1gNaCl，緩慢加入10gCTAB（十六烷基三乙酸溴化銨），同時(shí)加熱并攪拌。如果需要，可以加熱至65℃CTAB沉淀液：1%（W/V）CTAB50mmol/LTris·HCl，pH8.010mmol/LEDTA，pH8.0于室溫保存（可以在幾年內(nèi)保持穩(wěn)定）抽提緩沖液：100mmol/LTris·HCl，pH8.0100mmol/LEDTA250mmol/LNaCl100g/mL蛋白酶K瓊脂糖凝膠：典型情況下是在1×TAE或TBE中配制成含有1%的瓊脂糖凝膠。將電泳級(jí)瓊脂糖粉加入1×凝膠緩沖液并煮沸熔化瓊脂糖幾分鐘。要確保所有瓊脂糖顆粒均完全熔化。在進(jìn)行電泳時(shí)為了方便地看到DNA片段，在凝膠中加入終濃度為0.5在進(jìn)行噬菌斑分析時(shí)SeaKem瓊脂糖被認(rèn)為要比SeaKem瓊脂糖好，因?yàn)檫@種瓊脂糖只在較低濃度時(shí)可用，而在高濃度時(shí)會(huì)使噬菌斑難于辨認(rèn)。丙烯酰胺/亞甲雙丙烯酰胺溶液：表附－4不同濃度丙烯酰胺/亞甲雙丙烯酰胺溶液的配制比例（w/w）丙烯酰胺亞甲雙丙烯酰胺H2O29%/1%29g1g100mL30%/0.8%300g8g1000mL30%/1.8%30g1.8g100mL40%/2%100g2g250mL在裝有丙烯酰胺的容器中加入約終體積一半的水（可用丙烯酰胺的原裝容器配制和保存配制好的溶液）；加入N′N′-甲叉雙丙烯酰胺（Bio-Rad）并混勻直至溶解。如果需要，加入安伯利特（一種離子交換樹脂的商品名）MB-1至約2%，攪拌混勻。有一帶刻度的量筒定容至終體積。變性丙烯酰胺凝膠溶液：表附－5不同濃度變性丙烯酰胺凝膠溶液的配制試劑丙烯酰胺濃度（％）４６８尿素（超純，g）25.225.225.238%g丙烯酰胺/2%雙丙烯酰胺（mL）6.09.012.010×TBE電泳緩沖液(mL)6.06.06.0H2O(mL)272421總體積（mL）606060溶液用Whatman1號(hào)濾紙過(guò)濾，表中的量是針對(duì)單塊測(cè)序凝膠的。如果每天制膠，要注意配制凝膠的量如通過(guò)以上給出的量乘以16.7。配制1升凝膠溶液。于4℃擴(kuò)增緩沖液，10×，無(wú)MgCl2：500mmol/LKCl100mmol/LTris·HCl，pH9.0（25℃0.1%（V/V）TrtionX-100于-20℃對(duì)用于這種反應(yīng)中的引物必須加入最佳濃度的MgCl2，見(jiàn)下一個(gè)配方。這種緩沖液可從Promega獲得，它隨TaqDNA聚合酶一起供應(yīng)。4dNTP混合物：2mmol/L4dNTP混合物：用TE緩沖液，pH7.5配制，每種dNTP各為2mmol/L。等量分裝成每份1mL，于-20℃25mmol/L4dNTP混合物：用TE緩沖液，pH7.5配制，每種dNTP各為2mmol/L。等量分裝成每份1mL，于-20℃25mmol/L4dNTP混合物：將100mmol/L的4種dNTP（Promega）等量混合配制而成，等量分裝成每份1mL，于-20℃擴(kuò)增緩沖液，10×：500mmol/LKCl100mmol/LTris·HCl，pH8.4高壓滅菌（對(duì)某些擴(kuò)增并不需要）1mg/mL明膠于-20℃MgCl2的濃度（×）依據(jù)目的引物和序列而定。首先，采用10×無(wú)MgCl2的PCR擴(kuò)增緩沖液依據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定最佳的濃度?；谶@些結(jié)果，就可配制含最佳MgCl2濃度的10×擴(kuò)增緩沖液。退火緩沖液，5×：200mmol/LTris·HCl，pH7.5100mmol/LMgCl2250mmol/LNaCl蛋白酶消化緩沖液：20mmol/LTris·HCl，pH7.4（用高壓滅菌的1mol/L貯存液配制）20mmol/LEDTA，pH8.0（用高壓滅菌的0.5mol/L貯存液配制）0.5%（W/V）SDS室溫保存DMS終止緩沖液1.5mol/LNaAc，pH7.01.0mol/L2-ME過(guò)濾除菌，然后加入tRNA至終濃度100g于-20℃擴(kuò)增和雜交的寡核苷酸引物：用于擴(kuò)增的一對(duì)引物和用于檢測(cè)每一靶序列的單個(gè)引物。用無(wú)菌蒸餾水制備濃度為50pmol/L的引物。逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液：每個(gè)樣品：2.5L400mmol/LTris·HCl，pH5L100mmol/LDTT2.5L4005L5mmol/L4dNTP混合物1L300mmol/LMgCl22L可選：10URNasin（Promega；相應(yīng)減少水的體積）裂解緩沖液Ⅰ：300mmol/LNaCl50mmol/LTris·HCll，pH8.0，室溫25mmol/LEDTA，pH8.00.2%（V/V）SDS（新鮮配制，臨用前加入）0.2mg/mL蛋白酶K（新鮮配制，臨用前加入）無(wú)SDS和蛋白酶K的裂解溶液可于室溫?zé)o限期保存。臨用前，在每mL裂解溶液中加入10L20%SDS和10裂解緩沖液Ⅱ：140mmol/LNaCl10mmol/LTris·HCl，pH8.015mmol/LMgCl20.5%（V/V）NP-40DEPC溶液用100%乙醇按1∶10稀釋DEPC。臨用前按1∶100將DEPC進(jìn)一步稀釋，在裂解液最終比例為1∶1000。末端標(biāo)記混合物，51.0L5×2.3L1pmol/L末端標(biāo)記引物30.4L25mmol/L4dNTP混合物，0.8LH20.5L2U/ΜlThermococcuslitoralisDNA聚合酶（Vent；NewEnglandBiolabs臨用前制備，先將前4種成分混合并置冰上冷卻，然后加入聚合酶。第一鏈緩沖液，5×：200mmol/LNaCl50mmol/LTris·HCl，pH8.925mmol/LMgSO40.05%（W/V）明膠（Sigma）于-20℃第一鏈合成混合物，256.0L5×0.3L1pmol/L0.24L25mmol/L4dNTP混合物，pH18.21LH20.25L2U/ΜlThermococcuslitoralisDNA聚合酶（Vent；NewEnglandBiolabs臨用前配制，先將除VentDNA聚合酶之外的所有成分混合并置冰上冷卻，然后加入聚合酶，保持冰浴狀態(tài)。引物1應(yīng)以大于10pmol/L濃度保存硅化的試管中，然后在臨用前用TE緩沖液（pH7.5）稀釋，這樣可減少因引物沾在試管壁上而造成的損失。G+A終止液：360mmol/LNaAc，pH7.50.14mmol/LEDTA，pH8.0臨用前配制并置冰浴冷卻連接酶稀釋液：每個(gè)反應(yīng)（202.2L1mol/LTris·HCl，pH7.5（110mmol/L0.35L1mol/LMgCl2（17.5mmol/L1.0L1mol/LDTT（50mmol/L0.25L10mg/mLBSA（無(wú)DNase；PharmaciaLKB；12516.2LH2臨用前配制并置冰上冷卻連接酶混合物：每個(gè)反應(yīng)，（25.00.25L1mol/LMgCl2（10mmol/L0.50L1mol/LDTT（20mmol/L0.75L100mmol/LATP，pH7.0（PharmaciaLKB；3mmol/L0.125L10mg/mlBSA（無(wú)DNase；PharmaciaLKB；5017.375LH5.0L50mol/L單向連接頭混合物（4mol/L連接頭和50mmol/LTris·H1.0L3“Weiss”U/LT4DNA連接酶臨用前配制。首先，混合MgCl2、DTT、ATP、BSA和H2O，并置冰上冷卻；接著，加入冰冷的單向連接頭混合物和T4DNA連接酶。Tris·HCl與連接頭混合物一起加入后，終濃度為50mmol/L，pH7.7。沉淀用鹽混合液：每次沉淀反應(yīng)加入（9.48.4L3mol/LNaAc，pH7.0（2.7mol/L1.0L10mg/mL酵母tRNA（約1mg/mL制備后立即使用。擴(kuò)增緩沖液，5×：200mmol/LNaCl100mmol/LTris·HCl，pH8.925mmol/LMgSO40.05%（W/V）明膠（Singma#1393）0.5%（V/V）TritonX-100于-20℃擴(kuò)增混合物：每個(gè)反應(yīng)體系（3020.0L51.0L10pmol/L寡聚核苷酸LMPCR1.0L10pmol/L0.8L25mmol/L4dNTP混合物，pH7.2LH2臨用前配制，冰浴冷卻。4dNTP混合物，25mmol/L，pH7.0可從PharmaciaLKB購(gòu)買每種dNTP濃度為100mmol/L貯存液，然后將dATP、dCTP、dGTP和dTTP貯存液等量混合，從而獲得25mmol/LdNTP混合物，于-20℃VentDNA聚合酶混合物，3L：將0.6L5×擴(kuò)增緩沖液與1.9LH2O混合，冰浴冷卻幾分鐘，加入0.5VentDNA聚合酶終止液，295L25L3mol/L乙酸鈉，pH7.0（260mmol/L266LTE緩沖液，pH7.5（10mmol/LTris·HCl，pH7.5）2L0.5mol/LEDTA，pH8.0（約4mmol/L）2L10mg/mL酵母菌tRNA（68g/mL臨用前配制單向連接頭混合物，20mol/L：20mol/L寡聚核苷酸LMPCR.120mol/L寡聚核苷酸LMPCR.2250mmol/LTris·HCl，pH7.7在制備這些混合物之前，應(yīng)按完成工作：①在變性聚丙烯酰胺凝膠上純化寡聚核苷酸，②將兩種寡聚核苷酸與Tris·Cl混合后加熱到95℃5min，③轉(zhuǎn)移至70℃并逐漸冷卻約1h至室溫，④置室溫約1h，然后逐漸冷卻至4℃約1h，⑤置4℃約12C+T/C終止液：400mmol/LNaAc，pH7.50.14mmol/LEDTA，pH8.0臨用前新鮮制備并冰浴冷卻PCR緩沖液，10×：500mmol/LKCl30mmol/LDTT100mmol/LTris·HCl，pH8.81mg/mLBSA15mmol/LMgCl2于-20℃末端雙脫氧轉(zhuǎn)移酶（TdT）緩沖液，5×：1mol/L卡可酸鉀125mmol/LTris·HCll，pH7.41.25于-20℃MoMuLV反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液，5×：250mmol/LTris·HCl，pH8.3375mmol/LKCl50mmol/LDTT15mmol/LMgCl2于-20℃三、酶緩沖液蛋白酶K貯存液：1mL雙蒸水中溶解50mg蛋白酶K，－20℃溶菌酶儲(chǔ)存液：取50mg溶菌酶溶解在1mL雙蒸餾水中，－20℃RNaseA，熱滅活：將RNaseA按10mg/mL溶解在10mmol/LTris·HCl(pH7.5)/15mmol/LNaCl溶液中，于80℃加熱10min，緩慢冷卻至室溫，等量分裝后于—20℃貯存。根據(jù)需要稀釋至1mg/mL或10μL無(wú)RNA酶的DNA酶溶液：40mmol/LTris·HCl，pH7.46mmol/LMgCl22mmol/LCaCl21U/μL無(wú)RNA酶的DNA酶（如，ROI，Promega）新鮮配制用于RNA酶特別豐富的細(xì)胞時(shí)，在以上溶液中加入1000U/mL胎盤核酸酶抑制劑（如RNasin，Promega）和1mmol/LDTT。DNA轉(zhuǎn)移變性液：1.5mol/LNaCl，0.5mol/LNaOHDNA轉(zhuǎn)移中和液：1.5mol/LNaCl，0.5mol/LTris（pH7.4）牛血清白蛋白（BSA），0.5mg/mL：BSA的濃度可通過(guò)在１cm內(nèi)徑的樣品池中測(cè)定的值與已知濃度的1mg/mLBSA的A280=6.6比較后獲得（如0.5mg/mLBSA溶液的A280的值是3.3無(wú)RNA酶的DNA酶Ⅰ：商品化制備的酶如Worthington級(jí)DPRF的效果十分令人滿意，如果供應(yīng)的是干粉，應(yīng)用含50%（V/V）甘油的TE緩沖液重溶，并于－20℃甲基化酶緩沖液，10×：NaClTris·HCl，pH7.5EDTA2-ME或DTT（二硫蘇糖醇）S-腺苷甲硫氨酸（SAM）緩沖液中各成分的濃度依據(jù)甲基化酶而定。限制性內(nèi)切酶緩沖液：10×NaCl基本緩沖液100mmol/LTris·HCl，pH7.5100mmol/LMgCl210mmol/LDTT（二硫蘇糖醇）1mg/mLBSA（牛血清蛋白）0、0.5、1.0或1.5mol/LNaClNaCl濃度隨限制性內(nèi)切酶不同而不同。除在緩沖液中用KCl而非NaCl的限制性內(nèi)切酶外，以上所列的四種NaCl濃度足以滿足所有市售酶的需要。高壓滅菌的明膠（1mg/mL）可用來(lái)取代BSA。注意絕大多數(shù)限制性內(nèi)切酶均帶有制造商提供的適當(dāng)?shù)木彌_液。10×KCl基本緩沖液：60mmol/LTris·HCl，pH8.060mmol/LMgCl2200mmol/LKCl60mmol/L2-ME1mg/mLBSA2×谷氨酸鉀基本緩沖液：200mmol/L谷氨酸鉀50mmol/LTris·Ac，pH7.5100g/mLBSA1mmol/L2-ME10×KAc基本緩沖液：660mmol/LKAc330mmol/LTris·Ac，pH7.9100mmol/LMgAc25mmol/L（二硫蘇糖醇）DTT1mg/mLBSA（可選）T4噬菌體DNA連接酶緩沖液，10×：200mmol/LTris·HCl，pH7.650mmol/LMgCl250mmol/LDTT（二硫蘇糖醇）500g/mL牛血清白蛋白（可加可不加）這一緩沖液應(yīng)分裝成小份，儲(chǔ)藏于-20℃連接酶緩沖液，2×：100mmol/LTris·HCl，pH7.820mmol/LMgCl220mmol/LDTT（過(guò)濾滅菌）4mmol/LATP（過(guò)濾滅菌）將上述溶液獨(dú)立分裝在Eppendorf管中，儲(chǔ)藏于-20℃多核苷酸激酶緩沖液，10×：700mmol/LTris·HCl，pH7.5100mmol/LMgCl250mmol/LDTT1mmol/L氯化亞精胺1mmol/LEDTAKlenow酶緩沖液，10×：70mmol/LTris·HCl,pH7.570mmol/LMgCl2500mmol/LNaCl大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段也能使用多種其它緩沖液，如限制酶緩沖液、T4噬菌體DNA聚合酶緩沖液等等。S1核酸酶緩沖液，10×：2mol/LNaCl0.5mol/LNaAc（乙酸鈉），pH4.510mmlo/LZnSO45%甘油過(guò)濾除菌，并于4℃測(cè)序酶緩沖液，10×：400mmol/LTris·HCl，pH7.5200mmol/LMgCl2500mmol/LNaCl50mmol/LDTT測(cè)序酶稀釋緩沖液：10mmol/LTris·HCl，pH7.55mmol/LDTT0.5mg/mLBSA測(cè)序酶末端終止混合物：下面表附－6所列的是dNTP和ddNTP的濃度（μmol/L），所有混合物采用核苷酸貯存液稀釋到TE(10mmol/LTris·HCl(pH7.5)/0.1mmol/LEDTA)中配制而成。表附－6A、C、G、和T混合物中dNTP和ddNTP的濃度（ACGTdATP80808080dCTP80808080dGTP80808080dTTP80808080ddATP8ddCTP-8--ddGTP--8-ddTTP8NaCl(mmol/L)50505050為了用dITP替代dGTP，在每個(gè)反應(yīng)中用160μmol/LdITP取代dGTP，并在G終止混合物中使用1.6μmol/LddGTP。無(wú)機(jī)焦磷酸酶應(yīng)用在含dITP的反應(yīng)中。為了用7-脫氮-dGTP，在每個(gè)終止反應(yīng)中用80μmol/L7-脫氮-dGTP；在G混合物中不要改變ddGTP濃度。TaqSanger混合物：下表附－7列出了A、C、G、T混合液中dNTP和ddNTP的濃度，單位為μmol/L。配制所有混合物時(shí)均采用核苷酸貯存液用0.1mmol/LEDTA稀釋。表附－7A、C、G、T混合液中dNTP和ddNTP的濃度(μmol/L)ACGTdATP2222dCTP20202020dGTP20202020dTTP20202020ddATP150ddCTP-560--ddGTP--222-ddTTP520若要用7-脫氮-dGTP替代dGTP，應(yīng)在每個(gè)終止混合物中使用等摩爾濃度的7-脫氮-dGTP替代dGTP；切忌改變G混合物中ddGTP的濃度。Taq測(cè)序緩沖液，10×：500mmol/LTris·HCl，pH9.0150mmol/LMgCl2DNA測(cè)序反應(yīng)終止/加樣染料液：用去離子甲酰胺制備：95%甲酰胺10mmol/LNaOH0.1(W/V)溴酚藍(lán)0.1(W/V)二甲苯青高質(zhì)量的甲酰胺不需要作去離子處理，這種甲酰胺可從Fluka得到。10×VentR(exo-)測(cè)序緩沖液：100mmol/LKCl100mmol/L(NH4)2SO4200mmol/LTris·HCl，pH8.850mmol/LMgSO4VentR(exo-)測(cè)序混合物：下表附－8列出了A、C、G、T混合液中dNTP和ddNTP的濃度，單位為μmol/L。配制所有混合物時(shí)均采用核苷酸貯存液，并用1×VentR(exo-)測(cè)序緩沖液稀釋。表附－8A、C、G、T混合液中dNTP和ddNTP的濃度（μmol/L）ACGTdATP30303030dCTP10037100100dGTP10010037100dTTP10010010033ddATP900ddCTP-480--ddGTP--400-ddTTP720若要用7-脫氮-dGTP替代dGTP，應(yīng)在每個(gè)VentR(exo-)測(cè)序混合液中使用等摩爾濃度的7-脫氮-dGTP替代dGTP（Searsetal,1992）；切忌改變G混合物中ddGTP的濃度。使用VentR(exo-)DNA聚合酶時(shí)不推薦使用dITP。蔗糖／Ｔris/EDTA溶液：25%(W/V)蔗糖50mmol/LTris·HCl，pH8.040mmol/LEDTA，pH8.0四、其他溶液中途脫除液：200mmol/LTris?Cl，pH7.00.1×SSC0.1%（W/V）SDS溫和脫除液：5mmol/LTris·HCll，pH8.02mmol/LEDTA0.1×Denhardt溶液核苷酸混合物：2.5mmol/LATP2.5mmol/LGTP2.5mmol/LCTP20mmol/LTris·HCl，pH7.5于－20℃變性的鮭魚精DNA：在1mL水中溶解10mgSigmaⅢ型變性的鮭魚精DNA（鈉鹽），用17-G針頭快速抽吸20次以剪切DNA。然后置沸水浴中10min，迅速冷卻。立即使用或小量等量分裝后于－20℃保存。對(duì)于凍存的鮭魚精DNA，在臨用前應(yīng)將其加熱至100Denhardt溶液，100×（使用液為5×或10×）：10gFicoll400[2%（W/V）]10