淀粉酶性質(zhì)應用

關于淀粉酶性質(zhì)應用第1頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五2直鏈淀粉結構第2頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五3支鏈淀粉結構第3頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五4直鏈淀粉與I2形成蘭色絡合物第4頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五5淀粉是自然界分布極廣的碳水化合物，高等植物的根、莖、葉、花、果、種子等組織器官中都有淀粉的存在。谷物種子、薯類塊莖、各種水果和堅果等，是儲存淀粉最多的器官。一般淀粉谷物中，都是由直鏈和支鏈淀粉共同構成的。薯類和谷物淀粉中，支鏈淀粉占10-20%，直鏈淀粉占80-90%。第5頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五6淀粉的特性糯米淀粉中，支鏈淀粉99%。豆類（如豌豆、綠豆等）淀粉，直鏈淀粉含量較高。淀粉是白色或類白色，不溶于乙醚、乙醇、丙酮等有機溶劑，也不溶于冷水。淀粉是以顆粒狀態(tài)存在于胚乳細胞中，其內(nèi)部呈復雜的結晶組織，隨原料品種不同，淀粉具有不同的形狀和大小，淀粉顆?？煞譃閳A形、橢圓形和多角形三種。一般水分高，蛋白質(zhì)含量少的植物淀粉顆粒較大，形狀也比較整齊，多呈圓形或橢圓形，如馬鈴薯淀粉；反之顆粒較小，呈多角形，如米淀粉。第6頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五7玉米淀粉1500倍稻米淀粉5000倍馬鈴薯淀粉1500倍小麥淀粉5000第7頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五8不同淀粉粒不僅顆粒形狀不一樣，其大小也不相同，不同淀粉粒平均顆粒大小為：馬鈴薯淀粉粒65μm，小麥淀粉粒20μm，甘薯淀粉粒15μm，玉米淀粉粒16μm，稻米淀粉粒5μm。就同一種淀粉而言，淀粉粒的大小也不均勻，如玉米淀粉粒中最大的為26μm，最小的為5μm。在常見的淀粉中馬鈴薯淀粉的顆粒最大，稻米淀粉的顆粒最小。第8頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五9淀粉的糊化：又稱“α—化”，是指淀粉顆粒在水中被加熱，水分迅速滲透到淀粉顆粒內(nèi)部，使淀粉顆粒吸水膨脹，晶體結構消失，淀粉顆粒外膜完全破裂而解體，變成粘稠狀的液體。在這一過程中，淀粉顆粒吸水，體積增加50-100倍；α-淀粉酶水解顆粒淀粉（天然淀粉）和水解糊化淀粉的速度比為1：20000。淀粉的糊化第9頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五10淀粉的老化淀粉的老化（凝沉）：糊化淀粉緩慢冷卻，會變渾濁，甚至產(chǎn)生凝結沉淀，這種現(xiàn)象稱為“老化”或“回生、凝沉”，是分子間氫鍵已斷裂的糊化淀粉又重新排列形成新氫鍵的過程，也就是一個復結晶過程，發(fā)生凝沉的淀粉不易溶解，淀粉酶很難進入老化淀粉的結晶區(qū)，淀粉很難液化，更談不上糖化。第10頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五11直鏈淀粉容易老化，支鏈淀粉難老化；在高溫（60℃）或低于-20℃條件下，淀粉不易老化；而在2-4℃條件下，極易老化?？焖偕郎丶翱焖俳禍兀矸鄄灰桌匣粗菀桌匣?。淀粉糊濃度越高，淀粉糊極易老化；DE值越小，越易老化；一般在堿性條件下，有抑制老化的作用。利用淀粉加熱糊化、冷卻又老化的原理，可制作粉絲、粉皮、龍蝦片等食品，選用含直鏈淀粉多的綠豆淀粉，糊化后使它在4℃左右冷卻，促使老化發(fā)生。第11頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五12淀粉的液化淀粉的液化：淀粉經(jīng)糊化后，晶體結構被破壞，淀粉分子就直接暴露在酶（α-淀粉酶）分子的作用之下，分子鏈迅速斷開、變短，最終形成含有少量葡萄糖的低分子糊精溶液，液體的粘度隨之降低，這就是淀粉的液化過程。第12頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五135.1淀粉水解酶類

凡是能催化淀粉（或糖元）分子及其分子片段中的α-葡萄糖苷鍵水解的酶，統(tǒng)稱為淀粉酶，包括α-淀粉酶，糖化酶，β-淀粉酶，異淀粉酶，普魯藍酶，環(huán)狀糊精生成酶，麥芽寡糖生成酶等。第13頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五145.1.2、α-淀粉酶α-淀粉酶：是一種內(nèi)切酶，作用于淀粉時，它能水解淀粉分子內(nèi)α-1，4葡萄糖苷鍵（但該酶不能切開α-1，6鍵），將淀粉分子任意切斷成長短不一的短鏈糊精和少量低聚糖，使淀粉糊粘度迅速下降，即為液化作用，故α-淀粉酶又稱為液化酶。因水解產(chǎn)物還原性末端葡萄糖的第一位C1的光學性質(zhì)呈α-構型，故稱α-淀粉酶。第14頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五15α-淀粉酶的用量與液化終點的判斷α-淀粉酶用量：中溫α-淀粉酶，6-8U/g淀粉；高溫α-淀粉酶，10U/g淀粉左右。液化終點的判斷：取2-3稀碘液于小試管內(nèi)，滴入液化后的料液2-3滴，顯示淺黃色或淺棕紅色為液化良好，紫色為一般，蘭色為較差。第15頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五16DE值：葡萄糖值，表示淀粉水解程度及糖化程度，指的是還原糖占干物質(zhì)的百分率。DE=還原糖（%）/干物質(zhì)（%）×100%還原糖用斐林氏法或碘量法測定；干物質(zhì)（可溶固形物）用阿貝折光儀測定。純凈的葡萄糖DE值為100%，DE值越高，水解越徹底，反之亦然。酶活力定義：1毫升酶液于60℃，pH6.0條件下，1小時液化可溶性淀粉1克即為一個酶活力單位，以u/mL來表示。第16頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五17α-極限糊精：α-淀粉酶作用于支鏈淀粉時，它可以任意水解α-1，4鍵，但不能切開分支點的α-1，6鍵，也不能水解α-1，6鍵附近（1，2個）的α-1，4鍵，可以越過α-1，6鍵而切開α-1，4鍵，因此水解產(chǎn)物除麥芽糖、葡萄糖外，還有一系列α-極限糊精，如下所示：○—○

○—○—○

○—○

○—○↓

↓

↓

↓○—○—⊙

○—○—⊙

○—○—○—⊙

○—○—○—⊙62-麥芽糖基麥芽三糖○：表示葡萄糖殘基⊙：為還原性末端—：表示α-1，4鍵；↓：表示α-1，6鍵。第17頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五18低溫α-淀粉酶：最適溫度20-70℃，中溫α-淀粉酶：最適溫度60-70℃，工作溫度可達70-90℃由枯草桿菌BF7658、解淀粉芽孢桿菌BAA產(chǎn)生。高溫α-淀粉酶：85-115℃，由地衣芽孢桿菌產(chǎn)生。（最適pH范圍pH5.5-7.0，有效pH范圍5.0-8.0,最適溫度范圍90℃-95℃，有效溫度范圍90℃-100℃。在噴射液化工藝中瞬間溫度達105℃-110℃，仍能有效水解淀粉。）α-淀粉酶的種類第18頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五19霉菌（真菌）α-淀粉酶：50-55℃，由米曲霉或黑曲酶產(chǎn)生，它能從淀粉分子內(nèi)部切開α-1，4鍵生成各種寡糖，在長時間作用下，還可切開這些寡糖α-1，4鍵而生成麥芽糖，麥芽糖含量可達50%，故又稱麥芽糖生成酶，歐美用它制造高麥芽糖。酸性α-淀粉酶，耐pH2-4，正在開發(fā)中（主要在酒精、焙烤、飼料中應用。）除酸性α-淀粉酶外，其余α-淀粉酶最適pH在6左右。第19頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五20生淀粉酶生淀粉酶：是一種包括α-淀粉酶和糖化酶的復合酶，能將未經(jīng)蒸煮糊化的生淀粉直接水解轉化成葡萄糖等可發(fā)酵性糖供微生物生長與代謝，它比傳統(tǒng)的高溫蒸煮糖化節(jié)約25%～30%的能耗。能產(chǎn)生生淀粉酶的有黑曲霉、米曲霉、宇佐美曲霉、少根根霉、爪哇根霉、泡盛曲霉、青霉等。第20頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五21杰能科公司新近推出了STARGENTM001是一種生淀粉水解酶，適用于無蒸煮的低能耗工藝。該酶含有Aspergilluskawachii(白曲霉)alpha-amylaseexpressedinTrichodermareeseiandaglucoamylasefromAspergillusnigerthatfunctionsynergisticallytohydrolyzestarchintoglucose.第21頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五22耐高溫α-淀粉酶菌種：地衣芽胞桿菌抗紅霉素，菌落為乳白色發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉20%，豆粕5%，玉米漿2%，硫酸銨0.5%，磷酸二氫鉀0.5%，磷酸氫二鉀1.7%，檸檬酸鈉0.2%；加高溫淀粉酶液化，pH6.2～6.4。發(fā)酵工藝：35t發(fā)酵罐發(fā)酵條件溫度(42±1)℃，風量6.67-16.67m3／min，pH值6.4～6.8，培養(yǎng)時間80～100h。分批發(fā)酵酶活為8000-9000U/mL，補料發(fā)酵酶活為14000-15000U/mL。第22頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五23耐高溫α-淀粉酶

耐高溫α-淀粉酶能隨機水解淀粉、糖原及其降解物內(nèi)部的α-1，4葡萄糖苷鍵使淀粉溶液的粘度迅速下降，產(chǎn)生可溶性糊精和寡聚糖，過度的水解可產(chǎn)生少量葡萄糖和麥芽糖。用途：耐高溫α-淀粉酶具有極好的耐熱性，能廣泛應用于淀粉、酒精、啤酒、味精、釀造、紡織退漿等工業(yè)上。物理特性外觀：棕褐色液體溶解性：易溶于水比重：1.15-1.25g/mL第23頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五24[化學物性]鈣離子對酶活穩(wěn)定性的影響:較低濃度的鈣離子存在，對于淀粉的水解，推薦加入50-100ppm鈣離子。pH范圍：5.5-7.0最適6.0溫度范圍：90-95℃在噴射液化工藝中瞬間溫度達105-110℃，仍能有效水解淀粉。產(chǎn)品規(guī)格：1、耐高溫α-淀粉酶為液體酶制劑。酶活力：20000U/mL（相當于丹麥Novo公司Termanyl-120L）2、酶活力定義：1ml酶液在70℃，pH6.0條件下，1分鐘液化可溶性淀粉的毫克數(shù)。第24頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五25中溫α-淀粉酶目前國內(nèi)中溫α-淀粉酶生產(chǎn)菌種主要采用枯草芽孢桿菌BF7658和解淀粉芽孢桿菌BAA。解淀粉芽孢桿菌BAA發(fā)酵酶活相對較高，34℃培養(yǎng)60-70h，酶活可達600-900U/mL；BF7658菌株，37℃培養(yǎng)36-48h，酶活300-400U/mL，而且液體酶有臭味，限制了中溫α-淀粉酶在食品行業(yè)中的應用，因此工業(yè)上使用BAA菌株較多。第25頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五26中溫α-淀粉酶中溫α-液化型淀粉酶系用枯草芽孢桿菌（BacillusSubtilis)經(jīng)發(fā)酵提煉精制而成。用途：適用于酒精、啤酒、味精、發(fā)酵工業(yè)的液化以及紡織退漿等。產(chǎn)品特性：[物理特性]外觀：棕褐色液體溶解性：易溶于水比重：1.15-1.25g/mL第26頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五27[化學物性]熱穩(wěn)定性：需Ca2+150ppm，最適作用溫度60-70℃，在70-90℃之間，隨著溫度升高，其反應速度加快，但失活也加快，適用于最高達90℃的液化過程。pH6.0-7.0較為穩(wěn)定；最適作用pH6.0，pH5.0以下失活嚴重。產(chǎn)品規(guī)格：1、中溫α-淀粉酶分為固體和液體兩種劑型。固體分為2000、4000u/g,6000u/g三種。液體為2000u/mL。2、酶活力定義；1ml酶液(1g酶粉)在60℃，pH6.0條件下，1小時液化可溶性淀粉的克數(shù)。第27頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五282、β-淀粉酶是一種外切型的淀粉酶，它從淀粉或低聚糖的非還原性末端，以麥芽糖為單位，順次水解α-1，4糖苷鍵，并使切下的麥芽糖還原性末端葡萄糖殘基構型轉變?yōu)棣?型，故稱為β-淀粉酶。β-淀粉酶廣泛存在于大麥、小麥、玉米、大豆、甘薯等植物和一些微生物中，其中麥芽粉含量最高，大麥、小麥、大豆、麩皮也存在大量的β-淀粉酶，甘薯含量稍低。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的β-淀粉酶活力低，成本高。第28頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五29β-極限糊精β-淀粉酶不能水解支鏈淀粉的α-1，6鍵，也不能跨過分支點的α-1，6鍵而切開內(nèi)部的α-1，4鍵，故水解支鏈淀粉是不完全的，水解在達到分支點α-1，6鍵前2-3個葡萄糖殘基時，它便停止不前，由于在生成50-65%麥芽糖時，就不再水解殘留下來的大分子，稱為β-極限糊精。第29頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五30β-淀粉酶的提取從植物中提取β-淀粉酶，添加一定量的還原劑可提高酶的提取率。因β-淀粉是一種巰基酶，易與蛋白質(zhì)形成二硫鍵而被屏蔽，此外，即使是游離的β-淀粉酶，巰基也很容易與重金屬鹽(如Pb2+、Ag+、Zn2+、Cu2+)作用生成難溶性硫化物沉淀，導致失活。為此，提取時常加EDTA等螯合劑以防重金屬與巰基結合，添加NaHSO3、Na2S03、L-胱氨酸、巰基乙醇等還原劑以防巰基氧化造成的酶失活。β-淀粉酶可從麩皮、小麥、大麥中提取，也可從大豆提取蛋白質(zhì)后的廢水中，或甘薯制取淀粉的廢水中提取。大麥發(fā)芽第三天后β-淀粉酶活力最大；β-淀粉酶提取工藝：料液比1：17，溫度44℃，pH6.4、提取時間2.3h，還原劑用量1.64g/L；得到β-淀粉酶活為1230.22U/g絕干麥芽。黃豆粉中提取β-淀粉酶工藝：料水比1:10,添加0.1mol/LNaCl，0.2%(w/v)烷基醇酰胺，0.5%(w/v)Na2SO3，50℃和pH6.5下提取0.5h,β-淀粉酶的產(chǎn)量為34.78U/mL。第30頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五31來源大豆小麥大麥甘薯最適pH5.35.25.0-6.05.5-6.0穩(wěn)定pH范圍3.5-104.5-9.24.8-8.0—最適溫度(℃)60-65—50-5550-55等電點(pI)5.256.06.04.8淀粉水解率(%)65656565不同來源β-淀粉酶的性質(zhì)第31頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五323、糖化酶

（葡萄糖淀粉酶，Glucoamylase）葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3），俗稱糖化酶。是一種外切型淀粉酶，能從淀粉分子非還原性端，依次水解α-1，4糖苷鍵，切下葡萄糖單位，也能水解支鏈淀粉分支點的α-1，6鍵，但水解速度慢，僅及水解α-1，4的1/10。糖化酶可由黑曲霉(Aspergillusniger)優(yōu)良菌種經(jīng)液態(tài)發(fā)酵提取而成。該酶的最適溫度：60℃，最適pH4.0-4.5。糖化酶加量:生產(chǎn)上多采用30%淀粉乳，用量為100-200U/g淀粉左右。第32頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五33糖化酶發(fā)酵工藝1級罐5M3;2級罐10M3;發(fā)酵罐徑高比為1:2.5，3檔6彎葉機械攪拌，轉速187r/min,發(fā)酵罐容積30M3。一級種子培養(yǎng)基：玉米淀粉16%,豆餅粉4.4%,玉米漿2%,營養(yǎng)膏0.1%,定容2M3。二級種子培養(yǎng)基：玉米淀粉25%,豆餅粉3.6%,玉米漿1.5%,營養(yǎng)膏0.1%,定容5M3。發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉33%，豆餅粉4%，玉米漿1.5%，硫酸銨0.5%，定容17M3。補料方法：中后期一次性補入?？刂茥l件：培養(yǎng)溫度：34～35℃；風量控制(v/v)：前期1：0.4，中期1:0.6～0.8，后期1:0.4；pH范圍:4.3～4.7，通液氨維持pH4.7。發(fā)酵時間135h發(fā)酵產(chǎn)酶活力3.5～4.0萬U/mL。第33頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五34高轉化率糖化酶由糖化酶與普魯蘭酶復配組成，可提高葡萄糖濃度，加快糖化水解速度。用途：廣泛用于生產(chǎn)白酒、黃酒、酒精、啤酒、乳酸鈣作糖化劑；用于以葡萄糖作發(fā)酵培養(yǎng)基的各種抗生素，有機酸、氨基酸、維生素的發(fā)酵，還大量用于生產(chǎn)各種規(guī)格的葡萄糖。第34頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五35產(chǎn)品特性:——[物理特性]外觀：淺褐色液體溶解性：易溶于水比重：1.08g/ml[化學物性]最適作用溫度：58-60℃最適作用pH：4.0-5.0產(chǎn)品規(guī)格：糖化酶為液體酶制劑。酶活力：100000U/mL;110000U/mL,120000U/mL（AMG400）酶活力定義；1mL酶液在40℃，pH4.6條件下，1小時內(nèi)分解可溶性淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖的酶量為1個酶活力單位（U）第35頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五36糖化終點的判斷糖化終點判斷：由于只有葡萄糖溶于無水酒精，麥芽糖微溶，其它糖（如寡糖、糊精）不溶，所以糖化終點通常以無水酒精檢測無白色反應，即為糖化終點。糖化酶含少量葡萄糖苷轉移酶（將游離的葡萄糖轉移到其它葡萄糖殘基的α-1，6和α-1，3位，而生成各種寡糖，如非發(fā)酵性的潘糖、異麥芽糖等），對淀粉的糖化有重要影響，會降低淀粉糖轉化率，應設法去除。第36頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五374、脫枝酶(Debranchingenzyme)：是一類切開支鏈淀粉或糖原等大分子化合物中的α-1，6鍵的酶，是一種內(nèi)切型酶。脫枝酶作用于淀粉時，隨著解枝作用的進行，淀粉對碘的呈色反應由紅色變藍，還原力增加，在丁醇中發(fā)生沉淀，淀粉容易老化（發(fā)生渾濁），表現(xiàn)出直鏈淀粉的特性。第37頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五38脫枝酶可分為2種即普魯藍酶和異淀粉酶。（1）普魯藍酶（Pullulanase）：能水解普魯藍多糖的α-1，6鍵，可水解支鏈淀粉、α-極限糊精，β-極限糊精的α-1，6鍵，但幾乎不作用分支密集的糖原α-1，6鍵。該酶可由酸性解普魯藍芽孢桿菌生產(chǎn)。普魯藍多糖:微生物產(chǎn)生的由麥芽三糖通過α-1，6結合成的線性結構多糖○—○—○

↓普魯藍酶

(○—○—○)n——→(○—○—⊙)n↓○—○—⊙（2）異淀粉酶（Isoamylase）：它只對支鏈淀粉和糖原的α-1，6鍵有專一性，而對普魯藍多糖的α-1，6鍵無作用。該酶可由產(chǎn)氣桿菌生產(chǎn)。第38頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五39（1）作用的底物有差別普魯藍酶可水解普魯藍多糖、支鏈淀粉、α-和β-極限糊精，最好的底物是小分子的寡糖，幾乎不能作用糖原。異淀粉酶對分之密集的糖原或支鏈淀粉容易水解，也可水解某些分支的麥芽糊精個寡糖的α-1，6鍵，但不能水解普魯藍多糖的α-1，6鍵，β-極限糊精，最好的底物是高分子的多糖。（2）兩種酶所作用的最小底物不同普魯藍酶水解的最小底物是62-α-麥芽糖基麥芽糖（O—O↓O—O）異淀粉酶所能水解的最小底物是63-麥芽糖基麥芽四糖普魯藍酶與異淀粉酶的區(qū)別第39頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五401983年NOVO公司生產(chǎn)，由酸性解普魯藍芽孢桿菌（Bacillusacidopullulyticus）生產(chǎn)的具有耐熱、耐酸特點的普魯蘭酶。Promozyme400L（普魯蘭酶）標示活性：400PUN/ml最適溫度：50-65℃最適pH：4.0-5.5用量：1-2.5L/噸原料（麥芽和輔料），或0.1-0.15L/噸冷麥汁。添加地點：糖化鍋，投料五分鐘后加入，或發(fā)酵開始時與冷麥汁一起加入發(fā)酵罐中。主要作用：切斷支鏈淀粉和糊表的分支點，增加可發(fā)酵性糖含量，提高啤酒的發(fā)酵度。第40頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五41商品普魯藍酶的要求普魯蘭酶必須具有有以下三種特性的脫枝酶:耐酸性(工作pH4.5)；熱穩(wěn)定性工作溫度60℃；適合于食品生產(chǎn)。第41頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五42普魯蘭酶生產(chǎn)1983年NOVO公司生產(chǎn)，由酸性解普魯藍芽孢桿菌（Bacillusacidopullulyticus）生產(chǎn)的具有耐熱、耐酸特點的普魯蘭酶。Promozyme400L（普魯蘭酶）標示活性：400PUN/ml最適溫度：50-65℃最適pH：4.0-5.5第42頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五43普魯蘭酶發(fā)酵生產(chǎn)

將Bacillusnaganoensis(ATCC53909)克隆得到的普魯蘭酶基因片段與表達載體pPIC9K連接，構建表達載體pPIC9K—Pullulanase,經(jīng)SacI線性化后電穿孔法電擊轉化重組酵母表達載體pPIC9K--Pullulanase轉化到表達宿主酵母SMDll68，用G418平板篩選陽性轉化子，在含有4mg／mL的G418平板上，出現(xiàn)了若干個轉化予，隨機取其中102個轉化子進行發(fā)酵，測定酶活，酶活最高的一轉化有重組酵母表達載體pPIC9K株,發(fā)酵單位可達350.8U/mL，命名為SMD-PullulanaseP8，是原始出發(fā)菌株(2.7U/mL)的129.9倍，通過對重組畢赤酵母P8發(fā)酵工藝優(yōu)化，在30℃，甘油培養(yǎng)基培養(yǎng)48h后，補料添加甲醇和甘油誘導培養(yǎng)48h，5批次的誘導表達實驗，普魯蘭酶活平均值為507.3±2.8U/mL。第43頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五44普魯蘭酶在啤酒中的使用添加地點：糖化鍋，投料五分鐘后加入，或發(fā)酵開始時與冷麥汁一起加入發(fā)酵罐中。主要作用：切斷支鏈淀粉和糊表的分支點，增加可發(fā)酵性糖含量，提高啤酒的發(fā)酵度。第44頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五45普魯藍酶的應用（1）高葡萄糖漿：由于糖化酶對α-1，6鍵水解速率很低以及糖化酶中α-轉苷酶催化葡萄糖生成異麥芽糖的聚合反應，因此在糖化過程中加入普魯藍酶，普魯藍酶與糖化酶協(xié)同作用，可有效地提高淀粉的水解率；可降低糖化酶的用量、縮短反應時間；可提高淀粉乳的濃度。（2）高麥芽糖漿：大豆β-淀粉酶不能水解淀粉中的分枝鏈，有許多β-極限糊精不能分解，淀粉的最大轉化率不超過30%。如果添加普魯藍酶，可作用于DE5的30%淀粉乳液化液，可得到80%以上的超高麥芽糖漿。（3）干啤:普魯藍酶能降低麥汁中β-極限糊精的含量，增加可發(fā)酵性糖的含量，從而大幅度提高發(fā)酵度，制造干爽啤酒，一般在糖化階段添加普魯藍酶。（4）生產(chǎn)抗消化淀粉(resisantstarch，enzyme-resistantstarch，RS)，又稱抗酶解淀粉，指不能在人體小腸中消化吸收，但在結腸內(nèi)可被微生物發(fā)酵利用的淀粉。（5）其他：直鏈淀粉，環(huán)糊精等生產(chǎn)。第45頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五465、環(huán)狀糊精葡萄糖苷轉移酶（環(huán)狀糊精生成,Cyclodextringlycosyltransferase，CGTase）催化淀粉通過分子內(nèi)葡萄糖基轉移反應（環(huán)化反應）而生成由6～12個D-吡喃葡萄糖基以α-1,4-葡萄糖苷鍵連接而成的環(huán)狀低聚糖環(huán)糊精(Cyclodextrin,CD），在有適當受體（如蔗糖或葡萄糖）存在下，它可以通過分子間葡萄糖基轉移反應將葡萄糖從一個α-1，4葡聚糖或CD轉移到受體分子上（偶聯(lián)反應或歧化反應），還可以水解α-1，4-葡聚糖或CD。第46頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五475、環(huán)狀糊精葡萄糖苷轉移酶（環(huán)狀糊精生成酶，CGTase）（1）分子內(nèi)葡萄糖基轉移反應當CGTase作用于淀粉時，非還原性末端一側的某些α-1，4鍵上發(fā)生分子內(nèi)葡萄糖基轉移反應而生成聚合度為6-8的環(huán)狀糊精（同時淀粉溶液粘度下降，碘反應減弱，呈內(nèi)切型淀粉酶反應）。淀粉→α、β、γ-CD。α-CD6個葡萄糖構成的環(huán)己直鏈淀粉。β-CD7個葡萄糖構成的環(huán)庚直鏈淀粉。γ-CD8個葡萄糖構成的環(huán)辛直鏈淀粉。第47頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五48（2）分子間葡萄糖基轉移反應（偶聯(lián)反應）當有淀粉以外的適當受體糖類存在時，可發(fā)生分子間的葡萄糖基轉移反應（偶聯(lián)或歧化反應），將形成的環(huán)糊精裂開而轉移到受體糖分子C4的OH上，形成新的α-1，4鍵（可作為受體的糖類有葡萄糖、D-木糖、山梨糖、蔗糖、葡萄糖的C1衍生物）

CGTaseβ-CD+○-○-┉⊙

○-○-○-○-○-○-○-○-○-┉⊙打開環(huán)糊精，將其偶聯(lián)到其它糖上（偶聯(lián)作用）歧化作用，在低聚糖分子間進行轉移

CGTaseCGTaseGn+2Gn

G2n-2+Gn+2或Gn+Gn——→Gn+1+Gn-1第48頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五49（3）水解作用CGTase可水解淀粉和CD生成麥芽糊精，但水解能力很小，只占總催化能力的2-8%。

H2O如α-CD○-○-○-○-○-⊙CGTase嗜堿芽孢桿菌的CGTase，由淀粉主要生成β-CD，最高得率可達80%，軟化芽孢桿菌的CGTase，主要生成α-CD，第49頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五50環(huán)糊精性質(zhì)環(huán)糊精由6-12個葡萄糖單位通過α-1，4鍵連接而成的環(huán)狀化合物，無還原性末端，能抗外切型淀粉酶（糖化酶）的水解作用。環(huán)糊精只能被α-淀粉酶水解而不能被β-淀粉酶水解。第50頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五51不同種類環(huán)糊精的性質(zhì)種類葡萄糖單元數(shù)分子量室溫下水中溶解度(g/100ml)[α]Ｄ２５空腔直徑(?)外圓周直徑(?)α-環(huán)糊精697214.5150±0.54.70～5.3014.6±0.4β-環(huán)糊精711351.85162.5±0.56.00～6.5015.4±0.4γ-環(huán)糊精8129723.2177.4±0.57.50～8.3017.5±0.４β-CD在水中的溶解度最小，γ-CD在水中的溶解度最大。第51頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五52不同微生物來源的CGTase的性質(zhì)第52頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五53酶法生產(chǎn)環(huán)糊精常用于工業(yè)化生產(chǎn)的菌種一般有嗜熱脂肪芽胞桿菌、嗜堿脂肪芽胞桿菌、軟化芽胞桿菌等。環(huán)糊精的生產(chǎn)過程通常包括以下幾個主要階段：菌種的篩選、培養(yǎng)，CGTase的制備(分離、純化、濃縮、粉體化)；將淀粉水解為環(huán)狀；環(huán)糊精的分離、純化與結晶。制備環(huán)糊精的底物原料包括玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉等，不同的原料環(huán)糊精的收率不等。第53頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五54制備CGTase制備CGTase的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件因菌種而異。軟腐芽孢桿菌產(chǎn)酶培養(yǎng)基：玉米漿1%、可溶性淀粉1%、(NH4)2SO40.1%、CaCO30.3%，用豆油為消泡劑，pH5.0～6.0、37℃培養(yǎng)70h，主要產(chǎn)物是α-環(huán)糊精；巨大芽孢桿菌：麩皮1%、蛋白胨1%、玉米漿1%、可溶性淀粉4%、干酵母0.5%，37℃振蕩培養(yǎng)70h，主要產(chǎn)物為β-環(huán)糊精；Klebsiellaoxytoca19-1：可溶性淀粉1.0%、蛋白胨1.0%、K2SO40.1%、MgSO4·7H2O0.02%，pH7.0、37℃培養(yǎng)90h；BacillusstearothermophilusR2：復合胨0.5%、酵母膏0.5%、K2SO40.1%、MgSO4·7H2O0.02%、葡萄糖0.5%、谷氨酸0.1%，pH9、60℃培養(yǎng)72h；Bacilluscirculans：牛肉膏0.5%、蛋白胨1.0%、NaCl0.2%、酵母膏0.2%、可溶性淀粉1.0%，pH7.2；含有質(zhì)粒pCGT3的BacillussubtilisNH-1產(chǎn)α-CGTase的培養(yǎng)基：可溶性淀粉1.0%、蛋白胨5.0%、酵母膏5.0%、K2SO41.0%、MgSO4·7H2O0.2%。第54頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五55環(huán)糊精的生產(chǎn)工藝流程

將CGTase加入15%的淀粉懸浮液(含10mmo1/LCaCl2、pH8.5)中，于85～90℃液化30min，冷至60～65℃后，在糊化淀粉溶液中加入Ca(OH)2，再次調(diào)節(jié)pH至8.5，再加入適量的CGTase，繼續(xù)于60℃進行環(huán)化反應30～45h，升溫至100℃使酶失活，再冷卻至80℃，調(diào)pH至6，用糖化酶將未轉化的淀粉水解為麥芽糖和葡萄糖，水解液經(jīng)活性炭和離子交換樹脂處理后，減壓濃縮至45%～60%(w/V)，低溫放置，收得純度大于98%的β-環(huán)糊精結晶，分離出β-環(huán)糊精后的母液經(jīng)離子交換柱分級分離和凝膠過濾，分離出其中的γ-環(huán)糊精和α-環(huán)糊精，再通過一個精制系統(tǒng)，可直接得到γ-環(huán)糊精結晶和α-環(huán)糊精結晶。第55頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五56現(xiàn)已報道的絕大多數(shù)CGTase作用淀粉后的產(chǎn)物為α、β和γ-環(huán)糊精的混合物，絕大多數(shù)以β-環(huán)糊精為主，極少有產(chǎn)生單一環(huán)糊精的。根據(jù)物理性質(zhì)的差異來分離的，其中β-環(huán)糊精在水中的溶解度最小，只要對發(fā)酵后的淀粉懸浮液進行濃縮，β-環(huán)糊精就會以結晶態(tài)沉淀出來。另一種方法是用有機溶劑絡合，由于α、β、γ-環(huán)糊精所含的葡萄糖殘基數(shù)不同，內(nèi)部孔徑不同，可以與不同分子大小的有機絡合劑相結合，生成不溶的絡合物而從反應體系中分離出來。應用甲苯和三氯乙烯可分離β-環(huán)糊精，應用乙醇可增加β-環(huán)糊精的產(chǎn)量，應用葵醇可分離α-環(huán)糊精。隨著先進設備的應用及生產(chǎn)工藝的改進，環(huán)糊精的分離方法會越來越成熟。第56頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五57環(huán)糊精在酸、堿中穩(wěn)定，能在水或有機溶劑中結晶析出，它的立體結構呈中空圓筒狀，中間空隙半徑約6?-10?

，內(nèi)側具疏水性，從而改變被包接物的性質(zhì)，如溶解度、揮發(fā)性、化學反應性等，有以下用途：（1）穩(wěn)定香料、防止揮發(fā)（2）作為抗氧化劑、抗光熱分解劑（3）作為藥物或生理活性物質(zhì)的緩釋劑（4）用作除臭劑（掩蓋劑）、乳化劑、色譜柱載體（5）食品、藥物上脫苦以及用于增加化合物的溶解度。第57頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五58環(huán)狀糊精的結構特點環(huán)狀糊精，是白色結晶性粉末，溶于水，難溶于乙醇和丙酮，是一類由6個以上（常為6、7、8個）葡萄糖分子首尾相連而形成的環(huán)狀低聚糖，具有十分奇特的空間結構——圓筒形的空心結構，由于其空腔內(nèi)外“壁”上還“掛”有許多葡萄糖分子上的不同基團，故使環(huán)狀糊精空腔的內(nèi)外具有完全不同的性質(zhì)：外表具有親水性，內(nèi)表具有具疏水性、親油性。這樣，通過其“兩面性”，為難以共溶的油和水之間架設了一座“橋梁”，從而表現(xiàn)出神奇的妙用。第58頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五59在環(huán)糊精的分子結構中，由于葡萄糖的2位和3位仲醇羥基位于截錐體的下面開口和外部，6位的伯醇羥基位于截錐體的上面開口，使環(huán)糊精分子外部親水；同時6位的-CH2-和葡萄糖甙結合的氧原子排列在空隙的內(nèi)部，呈疏水性。這種性質(zhì)與表面活性劑相似，故可起乳化劑的作用.第59頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五60環(huán)狀糊精的應用（1）清涼劑：將具有清涼解渴、消暑解乏、煥發(fā)精神等特殊功效的薄荷油與環(huán)狀糊精混合并進入到其空腔里去，可解決因薄荷油難溶于水而無法配制薄荷飲料的難題，從而成功地為薄荷在冷飲及其它食品中的應用展現(xiàn)了可喜的前景。（2）留香劑：將香料預先包絡在環(huán)狀糊精的空腔內(nèi)后，可使散發(fā)花香的時間比天然花香長好幾倍到幾十倍，從而可以非常理想地作為塑料花朵的涂料以及化妝品、日用品以至食品的滲和留香劑。第60頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五61環(huán)狀糊精的應用（3）除臭劑：環(huán)狀糊精還可以把某些有臭氣的物質(zhì)包絡起來，起到除臭作用。如有一種名叫“5—氟脲嘧啶”的抗腫瘤口服藥，氣味難聞，但在經(jīng)與環(huán)狀糊精摻和后，難聞的氣味就被掩蓋了。（4）緩釋劑：“擬除蟲菊酯”是近年發(fā)展起來的一種藥性高、對人畜毒性低、使用安全的農(nóng)藥，但它在農(nóng)田中容易受紫外線的作用迅速分解而失去藥效，在經(jīng)與環(huán)狀糊精摻和后，就可使藥性緩慢釋放，藥效大大延長。（5）保護劑：用無色、無味、可食的環(huán)狀糊精噴灑于某些易氧化而引起變質(zhì)的蔬菜、食品等表面可抵擋住光線對它們的氧化、分解作用而達到保鮮、保色、保味、延長存放時間的目的。第61頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五62

麥芽低聚糖是以淀粉為原料而制成的由2-10個葡萄糖分子聚合而成的糖，以α-1，4鍵結合的直鏈麥芽低聚糖有麥芽三糖（G2）、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G8、G10。近年來由微生物來源只生成麥芽低聚糖的特異性酶相繼被發(fā)現(xiàn)，如：灰色鏈霉菌NA468可分泌麥芽三糖酶施氏假單胞菌NRRLB3389可分泌麥芽四糖酶地衣芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌可產(chǎn)生麥芽五糖酶高溫根霉G3-G7麥芽低聚糖的功能性：是一種能延長供能、強化機體耐力和作功能力、易消化吸收、低甜度、低滲透壓的性糖原。麥芽寡糖生成酶第62頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五63麥芽三糖麥芽三糖的甜度約是蔗糖的30%。其最大特征是非結晶狀態(tài)和強大的保濕性能，具有防止淀粉老化的作用。因此，經(jīng)常用于制作需要保留水分的糕點中。形成麥芽三糖的淀粉酶AMT1.2L是一種由微小桿菌（Microbacteriumimperiale）菌株，通過發(fā)酵培養(yǎng)并精制而得的酶制劑。是一種能優(yōu)先生產(chǎn)麥芽三糖的內(nèi)切型maltotriohydrolase(EC3.2.1.116)。水解直鏈淀粉糖、支鏈淀粉糖、糖原、淀粉主要生成麥芽三糖。對普魯蘭不起作用。

最適pH為pH6.5,最適溫度為45℃。淀粉糊精化活力AMT法pH6.01200u/ml以上避免日光直射、10℃以下冷藏密閉保存。第63頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五64Maltotetraohydrolase麥芽四糖MALTOPENTAOSE麥芽五糖第64頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五65α-葡萄糖轉苷酶（α-glucosidase,EC3.2.1.20)又名葡萄糖苷轉移酶，簡稱α-糖苷酶，具有水解和轉糖苷雙重作用，它能切開麥芽糖、麥芽三糖或麥芽低聚糖分子結構中的α-1，4糖苷鍵，并能將游離出來的一個葡萄糖殘基轉移到另一個葡萄糖分子或麥芽糖、麥芽三糖等分子中α-1，6位上，形成異麥芽糖（IG2）、異麥芽三糖（IG3）、異麥芽四糖（IG4）、五糖（IG5）和潘糖（P）等?！稹稹?⊙

→

○—○—○

↓

⊙

α-葡萄糖轉苷酶第65頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五66α-糖苷酶是以淀粉為原料生產(chǎn)低聚異麥芽糖（雙歧桿菌增殖因子）的關鍵酶，1982年由日本林原生化科研所開發(fā)出α-糖苷酶，1985年開始生產(chǎn)異麥芽低聚糖，年產(chǎn)1萬噸。第66頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五67轉葡萄糖苷酶LTransglucosidaseL(TGL)的性質(zhì)轉葡萄糖苷酶LTransglucosidaseL(TGL)由黑曲霉（Aspergillusniger）生產(chǎn)最適溫度：55-60℃（pH5.0）最適pH5.0-5.5pH5.0時，產(chǎn)品酶活為300,000u/ml一種特殊的具有良好貨架壽命的液體,用于生產(chǎn)低聚異麥芽糖漿,該酶作用于麥芽糖、麥芽三糖等含有α-1,4鍵的低聚糖，通過轉糖苷作用生成含有α-1,6鍵的異麥芽糖、潘糖和其它帶分枝的低聚糖第67頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五68轉葡萄糖苷酶反應所生成的產(chǎn)物第68頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五69日本天野制藥株式會社所生產(chǎn)的轉苷酶（Transglucosidase,GTase）由黑曲霉產(chǎn)生,酶活為3×105U/ml，使用量1L/噸淀粉。該酶的最適pH5.5，溫度55℃，反應時間：12-20h第69頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五70以淀粉為原料，用α-淀粉酶液化，再用β-淀粉酶糖化，同時用葡萄糖苷轉移酶轉化麥芽糖成為低聚異麥芽糖（IMO），再經(jīng)脫色、脫鹽濃縮而成，制造工藝如下：

耐高溫α-淀粉酶β-淀粉酶(2-4g/Kg淀粉)30%淀粉乳———→噴射液化液————→pH6.0（105℃DE=12-17）或真菌淀粉酶

糖化轉苷（pH5-6，50-60℃）糖化（麥芽糖≥75%）——→

粗制品——→藻土過濾（反應20h，葡萄糖苷轉移酶，1L/噸淀粉)—→活性碳脫色—→陰陽離子樹脂混合床離交—→脫鹽——→糖漿—→真空濃縮（75%成品）—→IMO50糖↓漿—→噴霧干燥—→IMO50糖粉分離葡萄糖麥芽糖—→IMO90第70頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五71IMO-90產(chǎn)品可采用“微生物分離法”、“色譜分離法”和“納濾分離法”三種高效分離技術生產(chǎn)。第71頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五72

IMO的應用IMO具有促進人體腸道有益菌群增殖,防齲齒,利于維生素和礦物元素吸收,增強機體免疫力等良好生理功能；同時還具有低甜度、耐熱、耐酸、良好的保濕性及低水分活度等優(yōu)良物化特性。IMO作為一種健康糖源和一般食品添加劑廣泛應用于食品工業(yè)中:(1)飲料:果蔬汁飲料、茶飲料、豆奶、含酒精飲料、乳酸菌飲料、粉末速溶飲料等;(2)乳制品:嬰兒奶粉、鮮乳、調(diào)味乳、發(fā)酵乳等;(3)糖果、糕點:高級奶糖、口香糖、泡泡糖、各種中西式糕點等;(4)冷飲、果酒、葡萄糖、果醬、蜂蜜加工品、焙烤食品等。IMO-50和IMO-90產(chǎn)品經(jīng)生理功能試驗，都具有顯著的改善腸功能和潤腸通便作用。IMO-90的功效更好，而且適合糖尿病人食用。在“腦白金”“樂百氏”“娃哈哈AD鈣奶”“昂立”“鹽水瓶口服液”等保健品和眾多高檔食品中得到廣泛應用。第72頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五73海藻糖

為一種天然二糖：在許多生物中均有發(fā)現(xiàn)（但含量極微），海藻糖是2分子葡萄糖以1，1結合的非還原性二糖。α，α-型，即為海藻糖；α，β-型，為新海藻糖；β，β-型為異海藻糖。

α，α-1,1-糖苷鍵非常穩(wěn)定，耐高溫、耐酸堿，非特異性地保護生物大分子。海藻糖的甜度是蔗糖的—半左右，但與蔗糖不同的是，它的甜味爽口，不留后味（口感變酸）。海藻糖在凍結、干燥脫水、高滲透壓等這類嚴酷的環(huán)境下，對生物體膜、膜蛋白、DNA等具有保護功效，在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、化妝品工業(yè)等有廣泛用途。被稱為“生命之糖”。第73頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五74海藻糖的結構第74頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五75海藻糖：目前的主要生產(chǎn)方法目前能夠進行規(guī)模生產(chǎn)的方法有：干酵母提取法微生物發(fā)酵法酶轉化第75頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五76干酵母提取法活性干酵母熱乙醇水溶液提取冷卻、離心上清液活性碳趁熱脫色濃縮串聯(lián)陰陽離子交換加熱真空濃縮結晶脫水、干燥海藻糖成品原料問題、有機溶劑、產(chǎn)率較低（5％－10％）、成本較高（海藻糖酶）第76頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五77微生物發(fā)酵法：培養(yǎng)高海藻糖酵母，從酵母中提?。?/p>

腹孢膜酵母（Saccharomycopsisfibuligera)30oC發(fā)酵48～50小時海藻糖在微生物細胞內(nèi)積累達到細胞干重的16%~18%產(chǎn)量較低：約為每噸發(fā)酵液產(chǎn)海藻糖20千克左右例如：第77頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五78酶轉化法

1990年首先被意大利那不勒斯第二大學的M.

DeRosa小組發(fā)現(xiàn)；改變了有史以來科學家論斷：（1）不可能從淀粉轉化成海藻糖；（2）自然界不可能存在不需要消耗ATP的海藻糖合成途徑。即“微生物的提取物能將淀粉水解物轉化為海藻糖”這一現(xiàn)象是意大利人發(fā)現(xiàn)的，并于1990和1991年發(fā)表了論文（他們沒有申請專利?。。┑?8頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五79酶轉化法分為兩種：雙酶法和單酶法

Two-enzymessystem（雙酶法）:以淀粉為原料麥芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)and麥芽寡糖基海藻糖基海藻糖水解酶(MTHase)；Single-enzymesystem（單酶法）：以麥芽糖為原料（可由淀粉水解產(chǎn)生），海藻糖合成酶(Tres)；這兩種酶系在自然界的微生物中廣泛存在：目前至少有15各菌屬含有上述酶。第79頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五80雙酶法SchemeoftrehaloseproductionbyMTSaseandMTHase.FromT.Higashiyama,Novelfunctionsandapplicationsoftrehalose,PureAppl.Chem.,Vol.74,No.7,pp.1263–1269,2002.

DiscoveredbyL.Lamaetal.Biotechnol.Lett.12:431–432,1990GenecloningbyHayashibara&Kirin,in1995~1996第80頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五81…..○-○-○-○-○-⊙

麥芽低聚糖↓MTSase…..○-○-○-○-○﹋○

低聚麥芽糖基海藻糖↓MTHase…..○-○-○-⊙+○﹋○（海藻糖）

○葡萄糖殘基，⊙：含還原端的葡萄糖殘基，

﹋

α，α-1,1葡萄糖苷鍵第81頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五82從土壤中分離得到能從淀粉的部分水解物生成海藻糖的微生物，這種微生物能產(chǎn)生兩種酶，一種是低聚麥芽糖基海藻糖生成酶（MaltooligosylTrahaloseSynthase簡稱MTSase），能作用于淀粉的部分分解物，在其末端生成具有海藻糖結構的非還原性糖質(zhì)。另一種是低聚麥芽糖基海藻糖水解酶（MaltooligosylTrahaloseHydrolase簡稱MTHase）。能從上述的非還原性糖質(zhì)特異性地水解出游離海藻糖。通過這兩種酶的協(xié)同作用，就能從淀粉的部分水解物連續(xù)地生成海藻糖。第82頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五83淀粉酶法（雙酶法）生產(chǎn)海藻糖工藝流程：淀粉↓耐熱性α-淀粉酶液化液↓異淀粉酶、MTSase、MTHase糖化`↓40℃,20h精制↓脫色（活性碳）↓過濾↓脫鹽↓過濾↓濃縮、結晶海藻糖漿、無水結晶海藻糖、含水結晶海藻糖第83頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五84

酶對底物的轉化率Two-enzymessystemStarchLiquefiedStarchIsoamylaseDe-brachedLiquefiedStarchMTSase~80%conversionrateMTHase~80%conversionrate終產(chǎn)品：海藻糖Thermostablea-amylase雙酶法：兩步的轉化率都是70～80％第84頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五85單酶法

麥芽糖

海藻糖TrehaloseSynthaseke可由褐色喜熱裂孢菌T.fusca產(chǎn)生(NishimotoT,etal.Biosc.Biotechnol.Biochem.1995,59:2189-2190)第85頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五86海藻糖不同的生產(chǎn)方法比較

方法技術成熟年份成本干酵母提取法~1990高其他微生物發(fā)酵法1~2005高雙酶法(MTSase&MTHase)2~1997低

單酶法(Tres)3~2000低

海藻糖磷酸化酶法4~2008低

1.ChiZM,LiuJ,ZhangW,2001,EnzymeMicro.Technol.28:240-245（山東大學池振明小組）2.NakadaT,etal.Biosc.Biotech.Biochem.60(1996):2633.NishimotoT,etal.Biosc.Biotechnol.Biochem.1995,59:2189-21904.KlimacekM,etal,1999,Biotechnol.Techniques,13:243

第86頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五87酶轉化法：國外情況

日本林原研究所：年產(chǎn)3.0萬噸美國Cargill公司：預計年產(chǎn)5.0萬噸生產(chǎn)線近期建成第87頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五88酶法轉化：國內(nèi)情況廣西南寧中諾生物工程有限公司：已建好年產(chǎn)500噸生產(chǎn)線。2006年9月前建成3000噸生產(chǎn)線；在2008年建成2萬噸生產(chǎn)線。第88頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五89酶轉化法：可降低成本的一些環(huán)節(jié)一、酶制備天然酶：產(chǎn)酶量較低，提取也較困難。如果用固定化細胞的方法則酶的密度過低。提高酶產(chǎn)量的方法有：常規(guī)誘變育種、基因組改組（genomeshuffling）。基因工程酶：產(chǎn)酶量通常是天然菌的數(shù)千乃至數(shù)萬倍。

第89頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五90

酶的費用可占海藻糖生產(chǎn)總成本的1/20到1/10。解決辦法：固定化酶。實驗表明可重復使用達60次以上第90頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五91

二、酶反應時間通常是48－72小時。太長。解決辦法：（1）、提高反應溫度：從30oC提高到45oC，反應達到平衡時所需時間可以從48小時縮短到24－28小時，但提高溫度會導致逆反應的增強：

30oC:麥芽糖

海藻糖45oC：麥芽糖海藻糖（22％）（78％）（30％）（70％）第91頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五92

三、酶的轉化率目前國內(nèi)外的酶法生產(chǎn)海藻糖其轉化率只有70－80％左右底物浪費增加分離單元成本增加顯然，提高轉化率可以大幅度降低成本。解決辦法：蛋白質(zhì)工程－－>

酶分子改性

第92頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五93

四、降低能耗

糖液濃縮過程結晶過程干燥過程耗能的成本可以占海藻糖生產(chǎn)總成本的10－15％第93頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五94Single-enzymesystem

Maltose

TrehaloseTrehaloseSynthase

(NishimotoT,etal.Biosc.Biotechnol.Biochem.1995,59:2189-2190)

(~20%)(~80%trehalose)EnzymeTrescannotshiftthereactionequilibrium,anditcanonlyspeedupthereaction.Sowhenenzymaticreactionreachestheequilibriumpoint,therearealways~20%maltoseand~80%trehalose.反應達到平衡時的各組分比例第94頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五95OptimaltemperatureOptimalpHConversionrateGlucosehasstronginhibition褐色喜熱裂孢菌T.fusca海藻糖合成酶的性質(zhì)第95頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五96

海藻糖生產(chǎn)車間一角

用木薯淀粉作為出發(fā)原料（已申請專利）第96頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五972千克包裝20千克包裝第97頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五98出口包裝第98頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五99TheleadcontentThearseniccontentTrehaloseSpecsbyHayashibara第99頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五100TrehaloseSpecsbySinozymeNanning廣西南寧中諾生物工程有限責任公司LeadArsenic第100頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五101Thetestresultsshowthatourproductcontains100~250timeslessheavymetalsthantheonebyHayashibara第101頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五102第102頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五103第103頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五1041994年日本林原生物化學研究所首先確立了以淀粉為原料，酶法糖化生產(chǎn)海藻糖的新方法，使得海藻糖能夠大量而較廉價地工業(yè)化生產(chǎn)。1995年11月，高純度98%以上的海藻糖含水結晶正式上市，售價從2-3萬日元/Kg，下降到350日元/Kg，使得海藻糖在醫(yī)藥、化妝品、食品工業(yè)能夠廣泛應用。第104頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五105海藻糖級別價格（元/公斤）食品級65醫(yī)藥級結晶400高純度無水680第105頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五106醫(yī)藥：可作為淋巴、激素、疫苗、抗生素、維生素、酶等各種生物制品的穩(wěn)定劑或品質(zhì)改良劑。作為活菌制劑（雙歧桿菌）的穩(wěn)定劑，可提高效價，延長其貨架周期。分子生物學：用海藻糖干燥抗體、血小板、酶、病毒等生物活性物質(zhì)，無需冷凍保存，復水后均能恢復活力。化妝品：海藻糖的硫酸衍生物可用于化妝品的潔膚劑、皮膚保濕劑、紫外吸收劑、口紅、唇膏的品質(zhì)改良劑。第106頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五107海藻糖在食品工業(yè)中具有廣闊的應用前景

海藻糖能很好地防止蛋白質(zhì)在冷凍、冷藏或干燥時變性。在含蛋白質(zhì)的各種食品中加入海藻糖，能非常有效地保護蛋白質(zhì)分子的天然結構，使食品的質(zhì)地和風味保持不變。

海藻糖具有優(yōu)異的防止淀粉老化作用。應用于面、餅、米飯、烤肉佐料醬、炸肉餅等含有淀粉的食品中會有效地提高這些食品的風味與口感水平。這種效果在低濕或冷凍條件下表現(xiàn)得更為突出。脂類物質(zhì)受氧化分解會產(chǎn)生過氧化物和揮發(fā)性醛等物質(zhì)，使食品風味劣變而失去食用價值。幾乎所有的食品都含有脂質(zhì)，海藻糖對油脂成分中的脂肪分解的抑制率高達70％以上，具有良好地抑制脂質(zhì)酸敗的效果。海藻糖可在動植物組織和細胞失水時，代替組織或細胞中水分的作用，有效地保護組織和細胞結構不受干燥和冷凍的破壞，從而維持它們的生命過程或生物特征。因此，對蔬菜、肉類、水果的保鮮非常有效。如水果、蔬菜濃漿、番茄漿等物質(zhì)中添加海藻糖，由于海藻糖可在干燥過程中很好地保護其細胞結構，因此其復水后其味道新鮮如初。

食品中的一些令人不快的異味主要是由揮發(fā)性醛類、乙基硫醇和三甲胺三大類物質(zhì)構成，加入海藻糖可有效地抑制異味的生成。如在魚類食品加工過程中，如在加熱前加入海藻糖就能抑制三甲胺（腥味的主要成分）的生成，降低腥味的產(chǎn)生。此外，在加工過程中添加適量海藻糖，就能很好地減輕雞、鴨、鵝肉等的怪味。第107頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五108葡萄糖異構酶（GlucoseIsomerase）又稱木糖異構酶（EC5.3.1.5），可將木糖、葡萄糖、核糖等醛糖轉化為相應的酮糖，由于葡萄糖異構化為果糖具有重大經(jīng)濟價值，故工業(yè)上習慣把木糖異構酶稱為葡萄糖異構酶。

果糖是棱柱狀晶體，熔點103～105℃，是所有的糖中最甜的一種，它比蔗糖甜一倍，以游離狀態(tài)大量存在于水果的漿汁和蜂蜜中，廣泛用于食品工業(yè)，如制糖果、糕點、飲料等。果葡糖漿的甜度與蔗糖相當。第108頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五109葡萄糖異構酶的性質(zhì)：用米蘇里游動放線菌AC－81－2、嗜熱鏈霉菌M1033等微生物發(fā)酵法生成的酶經(jīng)固定化制得，近白色或淺棕黃色顆粒，柱狀或條狀。（1）大多數(shù)微生物異構酶需Co2+、Mg2+，才表現(xiàn)活力。Mg2+是表現(xiàn)酶活所必需的；Co2+是酶熱穩(wěn)定性所必需的。最高活性在反應系統(tǒng)中需要有Mg2+及Co2+,其最適濃度分別為10-2mol/L和10-3mol/L。但Hg2+、Ag+、Pb2+、Zn2+、Ni2+、Cu2+、Al3+、Ca2+、Fe2+對酶活有不同程度的抑制；酶也受到一些糖醇的抑制，如山梨糖醇、甘露糖醇、阿拉伯糖醇、戊糖醇，木糖醇對異構酶的抑制最為強烈。（2）溫度、pH對酶反應的影響大多葡萄糖異構酶對熱很穩(wěn)定，最適作用溫度60℃，適用溫度30－75℃。最適作用pH7.0～7.5，適用pH6.0～8.0。其催化反應是吸熱反應，果糖的生成量隨溫度而增加，工業(yè)上采用60℃，底物葡萄糖濃度一般是35-45%,葡萄糖含量93%－97%，進口處pH8.2（25℃），溫度61℃，MgSO4·7H2O添加量0.1g/L糖漿。第109頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五110葡萄糖異構酶產(chǎn)生菌米蘇里游動放線菌（Actinoplanesmissouriensis）嗜熱鏈霉菌(Streptomycesthermoviolaceus)凝結芽孢桿菌（BacillusCoagulans）橄欖色鏈霉菌（StreptomycesOliuvaceous；StreptomycesOlivochromogenes)。銹霉鏈霉菌（Streptomycesrubiginosus)、紫黑鏈霉菌（StreptomycesViolaceoniger）等,制備成固定化葡萄糖異構酶第110頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五111果葡糖漿的生產(chǎn)及技術（1）糖液純度要高，不存在不溶性淀粉顆粒，DE值93%以上，除去糖液中的Cu2+、Fe2+等雜質(zhì)，Ca2+控制在1mg/Kg以下，異構化反應保持較好的穩(wěn)定性。（2）糖液濃度要高，異構化前，糖液濃度由30%濃縮到35-45%。（3）添加激活金屬離子MgSO4.7H200.1Kg/m3.（4）糖液pH控制在7.5，溫度60℃恒溫下進行。果糖含量達到42%，經(jīng)脫色、離交、色譜分離(模擬移動床)、真空濃縮制成不同果糖含量的糖漿。諾維信?葡萄糖異構酶IT（Sweetzyme?IT）在其使用壽命期間內(nèi)每公斤酶可生產(chǎn)至少15,000公斤（干物）的糖漿。第111頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五112葡萄糖異構酶的應用第112頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五113葡萄糖氧化酶（Glucose

oxidase，簡稱GOD，EC1.1.3.4）

在氧存在下，它催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，并生成過氧化氫，同時產(chǎn)生的過氧化氫酶分解H202為水和氧氣，解除H202對微生物的毒害作用。

葡萄糖氧化酶2葡萄糖+2O22葡萄糖酸+2H2O2

過氧化氫酶

2H2O22H2O+O2

每moL葡萄糖氧化酶蛋白含2moL黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）。發(fā)酵法生產(chǎn)的葡萄糖氧化酶，同時存在這兩種酶，對工業(yè)應用來說是，2種酶不需分離。第113頁，共143頁，2023年，2月20日，星期五114產(chǎn)酶菌種：曲霉屬（黑曲霉、米曲霉）、青霉屬（點青霉、灰綠青霉、尼崎青霉、紫青霉等）。酶的性質(zhì)：來源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶，最適pH5.5-5.8，穩(wěn)定pH3.5-6.5;pH＞8或pH＜2.0,酶迅速失活。最適溫度30-