大腸桿菌中雞SP-A蛋白的表達及其生物學(xué)活性(2),分子生物學(xué)論文

大腸桿菌中雞SP-A蛋白的表達及其生物學(xué)活性(2),分子生物學(xué)論文

通過RT-PCR成功地從雞肺組織mRNA中擴增出預(yù)期大小的目的條帶。將該PCR產(chǎn)物連接入pMD19-T載體中，陽性克隆被命名為pMDT-cSPA.測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基由于cSP-A,與GenBank中登錄的序列〔登錄號：AF411083〕的同源性為100%.為便于在大腸桿菌中表示出，剪去其信號肽部分，以pMDT-cSPA質(zhì)粒為模板，以cSPA-55F和cSPA-R為上、下游引物擴增出cSP-A成熟肽基因，雙酶切PCR產(chǎn)物，再克隆入原核表達載體pCold-TF中。經(jīng)PCR鑒定和測序，結(jié)果成功構(gòu)建了表示出cSP-A成熟肽基因片段的原核表示出載體，遂將其命名為pCold-cSPA〔見圖1〕。

2.2重組蛋白的表示出和純化

在16℃培養(yǎng)條件下，分別經(jīng)終濃度為0.1、0.2、0.5和1mmol/LIPTG誘導(dǎo)pCold-cSPA24h,SDS鑒定發(fā)現(xiàn)：用終濃度為1mmol/LIPTG誘導(dǎo)菌，pCold-cSPA的表示出量相對較大，表示出產(chǎn)物大小約為80ku〔見圖2A〕。隨后，利用1mmol/LIPTG大量誘導(dǎo)陽性克隆菌200mL,經(jīng)超聲波裂解后，融合蛋白主要以上清形式存在〔見圖2B〕。取表示出上清參加到平衡好的HisTag樹脂中，表示出上清與樹脂懸液的比例約為5∶1;最后分段收集洗脫液，取少量進行SDS檢測，結(jié)果成功獲得純化的cSP-A融合蛋白〔見圖3〕。

2.3Western-blot分析

用抗cSPA-CRD小鼠多克隆抗體血清對純化后的cSP-A蛋白進行Western-blot檢測。結(jié)果顯示，在80ku處出現(xiàn)單一的特異性條帶〔見圖4〕，表示清楚誘導(dǎo)表示出的cSP-A重組蛋白能被抗其多克隆抗體特異性辨別。

2.4抑菌活性檢測

采用單層瓊脂平板擴散法檢測原核表達的cSP-A蛋白對各個指示菌的抑菌情況，結(jié)果〔見圖5〕顯示，陽性對照〔即天然cSP-A蛋白和卡那霉素〕對巴氏桿菌、大腸桿菌〔CMCC44102〕、甲型副傷寒沙門菌〔ATCC9150〕、金黃色葡萄球菌〔ATCC25923〕、糞腸球菌〔CMCC29212〕均有一定的抑菌活性，但原核表示出的cSP-A蛋白沒有明顯的抑菌活性。

3討論

與哺乳動物源SP-A比擬，發(fā)現(xiàn)cSP-A有以下4點不同。第一，CLR區(qū)不完好，僅包括一個膠原樣G-X-Y三聯(lián)體重復(fù)序列，有趣的是，同樣定位于雞6號染色體上的雞肺凝集素〔chickenlunglectin,cLL〕在基因構(gòu)造上無CLR區(qū)[8],但重組cLL蛋白能抑制人H3N2和H1N1亞型流感病毒的血凝活第11期黃琪等：雞肺外表活性蛋白A的可溶性表示出及活性檢測性[9],提示CLR區(qū)完好性對其凝集活性的影響不大。第二，通過軟件模擬cSP-A空間構(gòu)造發(fā)現(xiàn)，盡管cSP-A的莖區(qū)較短，但其與豬、人源的SP-A的單體構(gòu)造極其類似，似乎并不影響空間構(gòu)造的構(gòu)成。第三，多出了一個未知區(qū)，由54aa組成，這一區(qū)域的功能有待確定。第四，CRD區(qū)不僅有2個糖基化位點，2個鈣離子結(jié)合位點，還有1個結(jié)合甘露糖的基序〔215EPN217〕，這一基序可能會使CRD結(jié)合病原微生物糖蛋白的作用更為顯著[10].基于這四點不同，有必要對cSP-A的全基因進行表示出并進而獲得大量可溶性cSP-A蛋白純品，以研究其基因構(gòu)造與生物學(xué)功能的關(guān)系，并期望將來用于臨床研究。

原核表示出系統(tǒng)是獲取大量蛋白質(zhì)的最直接途徑，但是cSP-A全基因中有多個大腸桿菌的稀有密碼子。為此，筆者曾嘗試多種原核表示出載體進行表示出，但均未獲得成功，只要在表示出cSP-A基因的部分片段〔例如N端區(qū)和C端CRD區(qū)〕，且突變了大腸桿菌的稀有密碼子后才獲得了高效表示出，但表示出產(chǎn)物均為包容體，不宜進行生物活性的研究。為此，本研究選擇pCold-TF原核表示出載體，該表示出載體帶有冷休克蛋白A〔cspA〕啟動子，融合觸發(fā)因子〔TF〕、蛋白質(zhì)水解位點和His標簽分子，在低溫環(huán)境中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表示出，不僅可加強目的蛋白的穩(wěn)定性，而且有效促進融合蛋白的可溶性表示出，便于蛋白質(zhì)純化，保證目的蛋白的天然活性[11].最終研究結(jié)果顯示，cSP-A成熟肽在該載體中獲得了高效可溶性表達；Western-blot結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)可被cSPA-CRD多克隆抗體特異性辨別，表示清楚cSP-A重組蛋白具有良好的反響原性〔見圖4〕。

cSP-A與哺乳動物源SP-A序列的同源性不高，本研究通過抑菌試驗證明：cSP-A蛋白原核表示出產(chǎn)物無明顯抑菌功能，而天然雞肺灌洗液SP-A蛋白可高效抑制部分常見革蘭陰性菌〔巴氏桿菌、甲型副傷寒沙門菌、大腸桿菌〕和革蘭陽性菌〔糞腸球菌、金黃色葡萄球菌〕〔見圖5〕。這可能與原核表示出產(chǎn)物沒有天然蛋白的翻譯后修飾，也不能構(gòu)成三聚體，進而不能發(fā)揮天然蛋白的類似活性所致。下一步將通過cSP-A全長真核分泌性表示出、桿狀病毒載體真核表示出系統(tǒng)等途徑解決其生物學(xué)活性問題。

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