酶標板法檢測TG凈含量的優(yōu)化方法,生物化學(xué)論文

酶標板法檢測TG凈含量的優(yōu)化方法,生物化學(xué)論文甘油三酯(triglyceride,TG)是人體內(nèi)含量最多的脂類,是體內(nèi)能量的主要來源.TG檢測是一項重要的臨床血脂常規(guī)測定指標.血清甘油酯測定方式方法可分為化學(xué)法、酶標板法和色譜法3大類.化學(xué)法因操作步驟繁多、技術(shù)要求高而不適于常規(guī)工作應(yīng)用.核素稀釋/氣相色譜/質(zhì)譜技術(shù)(ID/GC/MS)主要用作參考系統(tǒng)中決定性方式方法的建立及參考物質(zhì)的制備與定值,該方式方法費用昂貴,樣品處理復(fù)雜,難以推廣應(yīng)用.酶標板法具有簡便快速、微量、精致細密度高的優(yōu)點,且特異性強,易于到達終點,線性范圍寬,故臨床實驗室應(yīng)用最為廣泛[1].武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司(下面簡稱武漢公司)血液制劑研究室研發(fā)的人血漿蛋白層析法純化工藝,主要經(jīng)過為原料血漿經(jīng)過各種親和層析及離子交換層析等步驟,依次獲得多種血漿蛋白制品.雜質(zhì)是影響血液制品特性及質(zhì)量的重要因素.研發(fā)經(jīng)過中曾發(fā)現(xiàn)層析法純化的人血白蛋白(humanserumalbumin,HSA)巴氏滅活后有不同程度的渾濁,但巴氏滅活前后樣品中白蛋白(albumin,ALB)的含量未見明顯變化,可能為血漿中的脂類析出.為了提高產(chǎn)品質(zhì)量,我們對工藝樣品的TG凈含量進行監(jiān)控,并以此指標來指導(dǎo)工藝的優(yōu)化.經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn),工藝樣品中確實含有TG,采用去脂劑(lipidremovalagent,LRA)優(yōu)化工藝去除后,人血白蛋白原液外觀為澄明液體,符合(中國藥典〕三部(2018版)相關(guān)規(guī)定[2].本實驗優(yōu)化了酶標板法檢測TG凈含量的方式方法,進行驗證后,將其應(yīng)用于監(jiān)測人血白蛋白層析純化工藝中樣品的脂類含量,對工藝優(yōu)化提供了指導(dǎo).1材料與方式方法1.1樣品4批原料血漿樣品包括13001、13002批血漿和13003、13004批冷沉淀上清;202007003及202007004批人血白蛋白純化工藝樣品包括原料血漿、血漿過濾后、纖維蛋白溶解酶原的親和層析流穿液(Pg-FT)、纖維蛋白原親和層析的流穿液(Fg-FT)、IgG親和層析的流穿液(IgG-FT)(加LRA前)、白蛋白親和層析上柱液(ALB-Load,加LRA后樣品)、Alb洗脫液(ALB-Elu);LRA小試樣品13004LRA2-61、13004LRA2-62,均由本公司血液制劑研究室提供.1.2標準品標準品[TG及游離甘油(freeglycerin,FG)的起始濃度分別為2.5和0.26mg/ml],批號:SLBF4338,為美國Sigma公司產(chǎn)品.1.3主要試劑及儀器TG試劑盒(批號:SLBD0025)[內(nèi)含F(xiàn)G檢測試劑,批號:SLBB4986V;TG檢測試劑,批號:SLBB9109V]及LRA(批號:39339V)均為美國Sigma公司產(chǎn)品;多功能酶標儀SpectramaxPlus384及分析軟件SoftMaxPro.5.2為美國MolecularDevices公司產(chǎn)品.1.4酶標板法檢測TG凈含量方式方法的建立1.4.1FG檢測試劑和TG檢測試劑的處理按試劑的標示量用注射用水分別將試劑盒中的FG和TG檢測試劑復(fù)溶,迅速顛倒混勻,置2~8℃避光保存.1.4.2標準品及質(zhì)控品溶液的制備將標準品平衡至室溫,用注射用水進行2倍系列稀釋,共8個稀釋度,TG濃度從2500~19.5g/ml.用注射用水按1∶5和1∶10稀釋標準品,制備2個質(zhì)控品,濃度在標準品系列的中段,TG濃度分別為500和250g/ml.1.4.3樣品處理樣品可直接用于檢測,如檢測結(jié)果高出檢測范圍,則稀釋樣品直至檢測值在線性范圍內(nèi).1.4.4檢測方式方法開啟酶標儀Softmax軟件的脂類-TG測定模板,設(shè)定波長為540nm,開啟加熱功能,使裝微量滴定板的托盤預(yù)溫到37℃,并持續(xù)在37℃保溫.分別取50l注射用水(空白)、標準品系列、質(zhì)控品系列或樣品加至相應(yīng)的反響管中,每管參加FG檢測試劑0.8ml,混勻2~3s后,轉(zhuǎn)移至96孔板,200l/孔,每個樣品作3個復(fù)孔,將96孔板置于酶標儀托盤中,(371)℃孵育5min,用酶標儀檢測A540值,此為FG的吸收值;第1次讀數(shù)結(jié)束,取出96孔板,參加TG試劑,50l/孔,混勻,同上進行第2次孵育和讀數(shù),此為TG的吸收值.1.4.5結(jié)果計算以標準品系列的FG濃度為橫坐標,以相應(yīng)濃度的FG吸收值為縱坐標,繪制FG含量標準曲線,按一次方程擬合標準曲線,計算線性的相關(guān)系數(shù),并計算質(zhì)控品中的FG含量;以標準品系列的TG濃度為橫坐標,相應(yīng)濃度的TG吸收值為縱坐標,繪制TG含量標準曲線,按一次方程擬合標準曲線,計算線性的相關(guān)系數(shù),并計算質(zhì)控品中的TG含量.TG含量減去FG含量即為TG凈含量.1.5方式方法的驗證1.5.1標準曲線線性范圍確實立將標準品作2倍稀釋系列(共7個稀釋度),使TG濃度從2500~19.5g/m(lS1~S7),作為標準品系列;將標準品一步稀釋至不同濃度(1500、500、234.5、58.5g/mlTG)覆蓋在標準曲線的高值和低值區(qū)作為質(zhì)控品系列(C1~C4).每個濃度的樣品重復(fù)測定3次,計算各濃度樣品的吸光度均值,分別以FG和TG的濃度對其相應(yīng)的吸光度值做線性回歸,R2應(yīng)均不低于0.99,各個稀釋度的變異系數(shù)(CV)不大于15%.計算2條標準曲線下各稀釋度質(zhì)控品的FG和TG的回收率(可接受標準為90%~110%),確定標準曲線的線性范圍.1.5.2準確度取TG濃度為2500g/ml的標準品和樣品13004LRA2-62,以0∶1、1∶7、1∶3和1∶1(即低、中、高濃度)的比例混合,按建立的方式方法進行檢測.取平均值計算樣品中FG、TG含量及TG凈含量,并計算回收率(可接受標準為90%~110%).1.5.3精致細密度1.5.3.1重復(fù)性取樣品13004LRA2-61,按建立的方式方法,由同一個實驗員在同一試驗中連續(xù)測定6次,計算CV(可接受標準為CV10%).1.5.3.2中間精致細密度取樣品13004LRA2-61,按建立的方式方法,由不同的實驗員在不同日期內(nèi)分別測定3次,計算CV(可接受標準為CV10%).1.6方式方法的初步應(yīng)用1.6.1TG含量的檢測在蛋白純化工藝中的應(yīng)用用建立的方式方法檢測4批混合原料血漿中的TG凈含量,初步建立工藝數(shù)據(jù);檢測202007003和202007004批中間品(原料血漿、Pg-FT、Fg-FT、IgG-FT)的TG凈含量,監(jiān)測工藝流程中TG的流向.1.6.2LRA在白蛋白純化工藝中的應(yīng)用取202007004批IgG-FT,采用低溫乙醇法制備白蛋白常用的硅藻土濃度,處理樣品,經(jīng)1m濾膜過濾后,收集上清;取同批IgG-FT,參加不同量的LRA(A、B、C方案),LRA用量:A方案=C方案B方案,攪拌時間:A方案B方案=C方案,經(jīng)1m濾膜過濾后,收集上清.用建立的方式方法檢測TG凈含量,分析各組檢測結(jié)果,獲得LRA最佳應(yīng)用條件.2結(jié)果2.1酶標板上的TG凈含量檢測方式方法的建立檢測結(jié)果顯示,FG的標準曲線線性回歸方程為Y=0.002+0.00393X,R2=0.999;TG的標準曲線線性回歸方程為Y=0.0612+0.000407X,R2=1;2個質(zhì)控品系列的回收率在90%~110%,CV10%.表示清楚由傳統(tǒng)的試管法改為酶標板法是可行的.由于S-8的A540值極低,且CV10%,故標準曲線范圍暫定在S-1~S-7.2.2方式方法的驗證2.2.1線性范圍FG的標準曲線線性回歸方程為:Y=0.00525+0.00411X,R2=0.997;TG的標準曲線線性回歸方程為:Y=0.00974+0.000427X,R2=0.997.質(zhì)控品4(TG:58.5g/ml,FG:6g/ml)回收率不合格,因而,確定該方式方法檢測的線性范圍在S-1~S-6(即TG:78~2500g/ml;FG:8.13~260g/ml)之間.見表1和表2.2.2.2準確度檢測結(jié)果顯示,在標準曲線的有效范圍內(nèi),各樣品的CV均4%,回收率在102%~107%之間,準確度較好.見表3.2.2.3精致細密度檢測結(jié)果顯示,同一樣品由同一個實驗員在同一試驗中連續(xù)測定6次和由不同的實驗員在不同日期內(nèi)分別測定3次的結(jié)果的CV均3%,精致細密度較好.見表4和表5.2.3方式方法的初步應(yīng)用2.3.1TG含量的檢測在蛋白純化工藝中的應(yīng)用檢測結(jié)果顯示,4批混合原料血漿(13001、13002批血漿及13003、13004批冷沉淀上清)的TG凈含量分別為1388.256、1161.504、1388.651、1280.362g/ml.冷沉淀前后血漿中脂類含量未見明顯變化.2020-07003和202007004批原料血漿及3步親和層析的流穿液檢測結(jié)果顯示,血漿中的脂類物質(zhì)隨著工藝走向主要存在于親和層析的流穿液中,見表6.2.3.2LRA在白蛋白純化工藝中的應(yīng)用結(jié)果顯示,在白蛋白分離純化工藝中采用去脂劑可將脂類去除,效果優(yōu)于硅藻土.綜合LRA用量,工藝時間等因素,將B方案作為最終方案,見表7.3討論TG的檢測當前在臨床上主要用于監(jiān)測不同階段的人群的TG.TG的正常參考值為:兒童l000g/ml(1.13mmol/L),成人1500g/ml(1.7mmol/L)[3].本實驗檢測的原料血漿及去冷沉淀血漿數(shù)據(jù)與成人標準相符.脂肪組織中的TG在一系列脂肪酶的作用下,分解生成甘油和脂肪酸,并釋放入血液,供其他組織利用的經(jīng)過,稱為脂發(fā)動.脂發(fā)動生成的脂肪酸可釋放入血液,與白蛋白結(jié)合構(gòu)成脂酸白蛋白運輸至其他組織被利用.從上述脂肪的分解代謝經(jīng)過能夠看到,白蛋白是主要的脂肪酸載體.由本公司血漿蛋白層析純化工藝TG監(jiān)測結(jié)果可知,工藝中TG主要存在于白蛋白分離部分,與理論相符.在白蛋白分離純化工藝中采用去脂劑可將脂類去除,效果優(yōu)于硅藻土.LRA用量A方案=C方案B方案,攪拌時間A方案B方案=C方案,由B和C方案結(jié)果可知,在一樣攪拌時間下,LRA用量與脂類去除效果成正比;由A和C方案結(jié)果可知,在一樣LRA用量下,LRA作用時間與脂類去除效果成正比;綜合考慮工藝時間和LRA成本,我們確定B方案為最終方案,應(yīng)用于白蛋白的分離純化工藝中.TG的早期測定方式方法是以總脂質(zhì)與膽固醇和磷脂之差估算.化學(xué)法用有機溶劑抽提標本中的TG,去除抽提液中磷脂等干擾物后,用堿水解(皂化)TG,以過碘酸氧化甘油生成甲醛,然后用顯色反響檢測甲醛.比擬準確的是二氯甲烷-硅酸-變色酸法(vanhandel-caslson法),該方式方法抽提完全,能去除磷脂及甘油干擾,變色酸顯色靈敏度高,顯色穩(wěn)定,至今還是美國疾病控制與預(yù)防中心(CDC)內(nèi)部參考方式方法.但因操作步驟繁多、技術(shù)要求高而不適于常規(guī)工作應(yīng)用.當前幾乎所有的臨床實驗室均采用酶標板法檢測血清TG水平.如脂蛋白脂肪酶-甘油磷酸氧化酶-過氧化物酶-4-氨基安替比林和酚法(GPO-PAP法).其反響原理如下:①血清中TG在脂肪酶(lipo-prteinlipase,LPL)作用下,水解為甘油和游離脂肪酸(freefattyacids,FFA);②甘油在ATP和甘油激酶(glyc-erokinase,GK)作用下,生成3-磷酸甘油;③3-磷酸甘油經(jīng)磷酸甘油氧化酶(glycerophosphateoxidase,GPO)作用氧化生成磷酸二羥丙酮和H2O2;④H2O2與4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine,4-AAP)及4-氯酚在過氧化物酶(peroxidase,POD)作用下,生成紅色醌類化合物,其在540nm的吸收值與TG濃度成正比.酶標板法分一步法和兩步法,用一步法測定的是血清總甘油酯(定義為TG和FG及少量甘油二酯、甘油一酯之和),為了消除FG的干擾,中華醫(yī)學(xué)會檢驗分會曾在(關(guān)于臨床血脂測定的建議〕文件中推薦GPO-PAP法的兩步酶標板法作為血清TG常規(guī)測定方式方法[4].該方式方法是內(nèi)游離甘油空白法,即將試劑中的脂肪酶與其他試劑成分分開,樣品先與不含脂肪酶的試劑混合,孵育后測定吸光度,參加脂肪酶孵育后再測定吸光度,用兩吸光度之差計算TG濃度.為消除FG對檢測結(jié)果的影響,本實驗采用美國Sigma公司的TG試劑盒方式方法A即采用GPO-PAP的內(nèi)游離甘油空白法.由于酶標儀的出現(xiàn),微量滴定板上的比色所具有的高通量、高效率的特點獲得極大的發(fā)揮,我們根據(jù)前期BCA法檢測總蛋白[5]的經(jīng)歷體驗,也嘗試著將常規(guī)的試管比色法改良為微量滴定板和酶標儀快速測定法,即第一步反響增加樣品與游離甘油試劑的反響比例(從標示的1∶80提高到1∶16),取部分混合樣品至微量滴定板上進行孵育,第二步反響的樣品與脂肪酶的比例仍為4∶1,兩步的反響形式均為37℃孵育5min.該方式方法驗證結(jié)果顯示,準確度、精致細密度均符合驗證要求.我們將該方式方法引入血漿層析純化工藝的監(jiān)測,既能幫助優(yōu)化工藝,又能作為質(zhì)量控制的一部分來監(jiān)控工藝的穩(wěn)定性,擴大了該方式方法的適用范圍.以下為參考文獻[1]ColeTG,KlotzschSG,McNamaraJR.Meastlrementoftriglyc-erideconcentraton//RifaiN,WarnickGR,DominiczakMH.Handbookoflipoproteintesting[M].Washington:AACCPress,2000:207.[2]ChinesePharmacopoeiaCommission.PharmacopoeiaofPeoplesRepublicofChina(VolⅢ)[S].Beijing:China