SDSPAGE原理及結(jié)果分析技巧演示文稿

SDSPAGE原理及(Ji)結(jié)果分析技巧演示文稿第一頁，共二十頁。聚丙烯酰胺(An)凝膠聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（acrylamide,Acr）和交聯(lián)劑N’N’-甲叉雙丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide,Bis）以29:1的比例在聚合劑過硫酸銨(ammoniumpersulfate，APS)和催化劑TEMED的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。優(yōu)點：

凝膠孔徑可調(diào)節(jié)（改變單體和交聯(lián)劑的濃度），因此可根據(jù)被分離物的分子量范圍選擇合適的濃度靈敏度可達1mg

分辨率高，可分離大小相差僅3%的多肽。尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應為一體無電滲作用，只要純度高，操作條件一致，樣品分離重復性好凝膠透明，有彈性，機械效能好化學性能穩(wěn)定，與分離物不發(fā)生化學反應;對pH和溫度變化較穩(wěn)定第二頁，共二十頁。PAGE電泳原(Yuan)理分子篩效應:分子大小和形狀電荷效應：大部分的蛋白質(zhì)在pH8.3電泳緩沖液的條件下帶有負電荷，表面負電荷多的蛋白質(zhì)遷移快，反之則慢（強陰離子去污劑SDS使蛋白結(jié)構(gòu)松散，并帶上大量負電荷，導致本身電荷差別消失，因此SDS分離蛋白主要依賴分子大小，而非電荷或形狀）不連續(xù)系統(tǒng)具有對樣品的濃縮效應

pH值的不連續(xù)緩沖液離子成分的不連續(xù)電位梯度的不連續(xù)凝膠濃度的不連續(xù)以及電壓的不連續(xù).第三頁，共二十頁。分(Fen)離膠(8-15%,pH8.8)濃縮膠(5%,pH6.8)加樣加電場，樣品濃縮在界面上電泳結(jié)束—+第四頁，共二十頁。電泳(Yong)的應用

測定蛋白質(zhì)分子量（亞基）；結(jié)合凝膠過濾層析可用來測定蛋白質(zhì)的分子量和聚合狀態(tài)分析純度測定蛋白質(zhì)的含量蛋白質(zhì)水解分析鑒定修飾（糖基化）分離純化結(jié)合WesternBlot、免疫共沉淀等方法可用來鑒別蛋白質(zhì)相互作用第五頁，共二十頁。電泳(Yong)的應用

第六頁，共二十頁。測定分(Fen)子量

蛋白質(zhì)分子量在15,000～200,000之間時，電泳遷移率與分子量的對數(shù)值線性相關(guān)：若將已知分子量的標準蛋白質(zhì)的遷移率對分子量的對數(shù)作圖，可以獲得一條標準曲線，而從未知蛋白質(zhì)在相同電泳條件下的遷移率即可在標準曲線上求得其分子量。注意：①SDS單體的濃度，為保證蛋白質(zhì)與SDS的充分結(jié)合，它們的重量比應該為1:4或1:3；②樣品緩沖液的離子強度；③二硫鍵是否完全被還原，許多蛋白質(zhì)是由亞基或兩條以上肽鏈組成的，這一類蛋白質(zhì)，測定時只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量；④使用軟件分析需要圖片調(diào)正；⑤上樣量少，條帶越寬分析偏差（偏?。┰酱?。第七頁，共二十頁。測定分子(Zi)量

非還原/還原蛋白質(zhì)狀態(tài)的比較：為什么要用還原性電泳測分子量？第八頁，共二十頁。測定分(Fen)子量

第九頁，共二十頁。測定(Ding)分子量

第十頁，共二十頁。測定分子(Zi)量

第十一頁，共二十頁。測定(Ding)分子量

第十二頁，共二十頁。測定分(Fen)子量

第十三頁，共二十頁。純(Chun)度分析

第十四頁，共二十頁。含(Han)量測定

第十五頁，共二十頁。含量(Liang)測定

第十六頁，共二十頁。含量(Liang)測定

第十七頁，共二十頁。蛋白(Bai)質(zhì)水解分析