腸道細(xì)胞釋放操作流程

1、解剖和分離腸道上皮細(xì)胞試劑和儀器設(shè)備的準(zhǔn)備：無(wú)Ca2+/Mg2+的PBS(CMFPBS)恢復(fù)至室溫含終濃度5%FBS的無(wú)Ca2+/Mg2+的Hank'sBalancedSaltSolution和2mMEDTA，恢復(fù)至室溫備用。37°C恒溫振蕩培養(yǎng)搖床。注意:步驟1.1到1.7操作時(shí)動(dòng)作要快，以減少細(xì)胞死亡的程度和達(dá)到最大細(xì)胞產(chǎn)量。1.1使老鼠在一個(gè)二氧化碳室安樂(lè)死，用70%乙醇噴霧對(duì)腹部和胸部表面進(jìn)行消毒。1.2用剪刀在腹部中間剪開(kāi)一個(gè)小的橫向切口，并且把皮卷起來(lái)露出腹膜1.3剪斷胃幽門(mén)括約肌使小腸上端與胃分離，用鑷子去除腸系膜，再剪斷回盲部，使完整的小腸與大腸分離。再將肛門(mén)邊緣剪斷，去除腸系膜，使大腸完全分離。1.4使用剪刀縱向切開(kāi)結(jié)腸，室溫下用CMFPBS洗掉腸腔內(nèi)的糞便和粘液。1.5使用剪刀和鑷子減掉小腸表面的PP節(jié)，然后縱向剪開(kāi)小腸。1.6在室溫下用CMFPBS清洗小腸內(nèi)腔中的糞便和粘液。1.7分別把大腸和小腸切成長(zhǎng)約1.5厘米的小段，分別放入含有30ml預(yù)熱的CMFHBSS/FBS和2mMEDTA的50ml離心管中。一個(gè)50ml離心管最多放一個(gè)腸道。1.8將50ml離心管水平地放置于一個(gè)搖床上，于37°C，250rpm，孵育20min。1.9將一個(gè)鋼網(wǎng)篩置于一個(gè)廢液桶上，分別將每個(gè)50ml離心管的內(nèi)容物倒在濾網(wǎng)上，回收1.5厘米的腸子片斷，再次置于含有30ml預(yù)熱的CMFHBSS/FBS和2mMEDTA的50ml離心管中，1.10重復(fù)步驟1.8組織消化和腸道細(xì)胞的隔離試劑和儀器設(shè)備的準(zhǔn)備:(1)膠原酶溶液:1.5mg/ml的膠原酶VIII溶解在預(yù)熱的含有40“g/mlDNaseI的CMFHBSS/FBS溶液中。預(yù)熱的CMFHBSS/FBS和2mMEDTA37°C預(yù)熱的振蕩培養(yǎng)搖床冰預(yù)冷的CMFHBSS/FBS

2.1第二輪震蕩結(jié)束后，再次濾掉50ml離心管中的液體，將篩網(wǎng)上的1.5厘米的小腸片斷轉(zhuǎn)移至一個(gè)小的塑料盒中，用紙巾擦去多余的液體。2.2用剪刀直接在這個(gè)小盒內(nèi)將1.5厘米的腸子盡可能剪碎，加入20ml的膠原酶溶液，并轉(zhuǎn)移至50ml離心管，水平放置于振動(dòng)器中消化，200rpm，10-20min，37幻。2.3消化完畢后，短暫的漩渦振蕩以確保徹底分離剩余的腸道組織，使用100pm的細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾至置一新的50ml離心管中。2.4每管加入CMFHBSS/FBS終止消化，1500rpm離心5min，4°C。如果離完心圍發(fā)現(xiàn)沉淀，可將樣品再次離心3.5min。重復(fù)此步驟一次2.5棄上清，用冰預(yù)冷的CMFHBSS/FBS重懸沉淀，置于冰上。2.6使用第三部分流式進(jìn)行分析或第四部分進(jìn)行磁珠富集或高速細(xì)胞分選?？贵w標(biāo)記染色，采用流式細(xì)胞儀分析DC和巨噬細(xì)胞試劑和儀器設(shè)備的準(zhǔn)備：（1）冰預(yù)冷的CMFPBS（2） 冰預(yù)冷的染色緩沖液（（CMFPBS+5%FBS））（3） 準(zhǔn)備死細(xì)胞染色：使用LIVE/DEADFixableAquaDeadCellStainKit，用冰預(yù)冷的CMFPBS進(jìn)行1:1000稀釋，（4） 在冰預(yù)冷的染色緩沖液中，配制下列熒光標(biāo)記的單克隆抗體進(jìn)行染色。3.1將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至5ml的聚苯乙烯圓底（FACS）管。3.2用冰預(yù)冷的CMFPBS將細(xì)胞洗兩遍。3.3將細(xì)胞與死細(xì)胞染液于黑暗處冰上孵育15min。3.4用冰預(yù)冷的CMFPBS將細(xì)胞洗兩遍。3.5用2.4G2anti-FcyRIII/II封閉細(xì)胞，冰上10min。3.6用冰預(yù)冷的CMFPBS將細(xì)胞洗兩遍。3.7將細(xì)胞與預(yù)先配制的抗體染液于黑暗處冰上孵育20min。3.8用冰預(yù)冷的染液緩沖液將細(xì)胞洗兩遍，重懸于400pl冰預(yù)冷的染色緩沖液中，用40pm濾網(wǎng)過(guò)濾至新的FACS的管中。3.9通過(guò)BD公司的LSRII流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。腸道DCs和巨噬細(xì)胞的富集

(1)冰預(yù)冷的染色緩沖液(CMFPBS+5%FBS)4.1根據(jù)操作說(shuō)明，使用抗體CD11b和CD11cMACSbeads與步驟2.5獲得單細(xì)胞懸液孵育。4.2使用預(yù)冷的染色緩沖液沖洗細(xì)胞并離心4.3棄上清，用1ml冰冷的染色緩沖重新懸浮細(xì)胞顆粒，先通過(guò)100pm細(xì)胞染色過(guò)濾器過(guò)濾，再使用40pm的進(jìn)行過(guò)濾。4.4使用MACSLS磁柱富集陽(yáng)性磁珠細(xì)胞。4.5重復(fù)4.2，棄上清4.6與細(xì)胞表面標(biāo)記孵育，如3.7中描述的步驟4.7利用冰冷的染