蛋白質(zhì)工程與食品工業(yè)

蛋白質(zhì)工程與食品工業(yè)第一頁，共四十八頁，2022年，8月28日

概述

蛋白質(zhì)是對生命至關(guān)重要的一類生物大分子，各種生命功能、生命現(xiàn)象、生命活動(dòng)都和蛋白質(zhì)有關(guān)。在生命有機(jī)體催化、運(yùn)動(dòng)、結(jié)構(gòu)、識(shí)別和調(diào)節(jié)等許多方面，起著關(guān)鍵的作用。第二頁，共四十八頁，2022年，8月28日

主要內(nèi)容蛋白質(zhì)的功能與結(jié)構(gòu)一蛋白質(zhì)工程的誕生二蛋白質(zhì)工程的基本步驟和改造方法三蛋白質(zhì)工程在食品產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用四第三頁，共四十八頁，2022年，8月28日第一節(jié)

蛋白質(zhì)的功能與結(jié)構(gòu)第四頁，共四十八頁，2022年，8月28日

主要內(nèi)容蛋白質(zhì)的功能一

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)二第五頁，共四十八頁，2022年，8月28日一、蛋白質(zhì)的功能(1)蛋白質(zhì)是構(gòu)成生命的重要物質(zhì)之一蛋白質(zhì)是一類重要而復(fù)雜的生物大分子，它廣泛地存在于所有生物界的機(jī)體之中，具有許多重要的作用；構(gòu)成生物體新陳代謝的幾乎全部的化學(xué)反應(yīng)都是在活性蛋白質(zhì)-酶的催化下進(jìn)行的；高等動(dòng)物的免疫反應(yīng)，也主要是通過蛋白質(zhì)即抗原和抗體來完成的；運(yùn)動(dòng)時(shí)的肌肉收縮靠的是某些蛋白質(zhì)的相互作用來完成的；運(yùn)輸氧和二氧化碳的是血紅蛋白；具有代謝和調(diào)節(jié)功能的是多種蛋白質(zhì)激素。第六頁，共四十八頁，2022年，8月28日一、蛋白質(zhì)的功能(2)蛋白質(zhì)的應(yīng)用①蛋白質(zhì)是人類賴以維持生命的重要營養(yǎng)來源之一。人們需要從各種肉、蛋、奶、豆類等主要食品中獲得所需的蛋白質(zhì)營養(yǎng)。②用蛋白質(zhì)診斷和治療某些疾病。淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶用于幫助消化，治療某些消化不良性疾??；胰島素用于治療嚴(yán)重的糖尿病；轉(zhuǎn)氨酶作為肝病變的指標(biāo)等。③食品工業(yè)和輕工業(yè)中主要應(yīng)用蛋白質(zhì)或利用蛋白質(zhì)的性質(zhì)制造各種產(chǎn)品。例如，釀造業(yè)要用蛋白酶來增加醬油的鮮味等。用于人類衣著的羊毛、紡織品和皮革主要組成是蛋白質(zhì)。第七頁，共四十八頁，2022年，8月28日二、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)氨基酸是蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位氨基酸的基本結(jié)構(gòu)：第八頁，共四十八頁，2022年，8月28日二、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)各種氨基酸之間通過肽鍵彼此按直線形頭尾相連，構(gòu)成不同長短的肽鏈。肽鍵就是由氨基酸的α-羧基與相鄰的氨基酸的α-氨基脫水縮合而形成的化學(xué)鍵肽鍵的形成肽鍵的形成第九頁，共四十八頁，2022年，8月28日二、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)肽:氨基酸通過肽鍵連結(jié)起來的化合物二肽:兩個(gè)氨基酸形成的肽三肽:三個(gè)氨基酸形成的肽多肽:許多氨基酸形成的肽蛋白質(zhì):大多為100個(gè)以上氨基酸組成的多肽第十頁，共四十八頁，2022年，8月28日二、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)多肽鏈的折疊可分為四種不同層次的結(jié)構(gòu)。一級結(jié)構(gòu)：僅指肽鏈中的氨基酸線型排列順序，不考慮空間的排列。牛胰島素的氨基酸序列第十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日二、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)：主鏈原子的局部空間排列，不包括側(cè)鏈構(gòu)象和與其他鏈段的相互關(guān)系，如-螺旋、-折疊等主鏈構(gòu)象單元就是二級結(jié)構(gòu)。主要形式：α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲等第十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日二、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)第十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日二、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)β-轉(zhuǎn)角第十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日二、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)的多肽鏈在各種二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上再進(jìn)一步盤曲或折疊形成具有一定規(guī)律的三維空間結(jié)構(gòu)。碳酸酐酶的多肽骨架示意圖第十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日二、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)：具有二條或二條以上獨(dú)立三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈組成的蛋白質(zhì)，其多肽鏈間通過次級鍵相互組合而形成的空間結(jié)構(gòu)。血紅蛋白的結(jié)構(gòu)第十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日二、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)（1）氫鍵：氫原子與負(fù)電性強(qiáng)的原子（如氧、氮等）間形成。對蛋白質(zhì)分子三維構(gòu)象的維護(hù)很重要。（2）靜電引力：正負(fù)帶電基團(tuán)之間的吸引力。對蛋白質(zhì)分子三維構(gòu)象的穩(wěn)定貢獻(xiàn)不是很大，也稱為離子鍵或鹽鍵（3）范德華力：原子團(tuán)相互接近時(shí)誘導(dǎo)所致。它變化多樣，對維持蛋白質(zhì)活性中心的構(gòu)象影響很大第十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日二、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)（4）疏水相互作用：是非極性基團(tuán)為了避開水相而群集在一起的作用力。疏水作用是維持蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的重要因素（5）二硫鍵：作用很強(qiáng)，對穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象起重要作用氫鍵、離子鍵、疏水作用和范德華力等次級鍵是非共價(jià)鍵肽鍵、二硫鍵、酯鍵等被稱之為共價(jià)鍵第十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日第二節(jié)

蛋白質(zhì)工程的誕生第十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)工程的誕生1983年，美國生物學(xué)家額爾默首先提出了“蛋白質(zhì)工程”的概念。蛋白質(zhì)工程的實(shí)踐依據(jù)DNA指導(dǎo)合成蛋白質(zhì)，因此，人們可以根據(jù)需要對負(fù)責(zé)編碼某種蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行重新設(shè)計(jì)，使合成出來的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變得符合人們的要求。第二十頁，共四十八頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)工程的誕生蛋白質(zhì)工程就是以蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能為基礎(chǔ)，利用基因工程的手段，按照人類自身的需要，定向地改造天然的蛋白質(zhì)，甚至創(chuàng)造新的、自然界本不存在的、具有優(yōu)良特性的蛋白質(zhì)分子。蛋白質(zhì)工程是指通過生物技術(shù)手段對蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或者對編碼蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行改造，以便獲的更適合人類需要的蛋白質(zhì)產(chǎn)品的技術(shù)。第二十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)工程的誕生蛋白質(zhì)工程是指通過蛋白質(zhì)化學(xué)、蛋白質(zhì)晶體學(xué)和動(dòng)力學(xué)的研究，獲取有關(guān)蛋白質(zhì)物理和化學(xué)等各方面的信息，在此基礎(chǔ)上利用生物技術(shù)手段對蛋白質(zhì)的DNA編碼序列進(jìn)行有目的的改造并分離、純化蛋白質(zhì)，從而獲取自然界沒有的、具有優(yōu)良性質(zhì)或適用于工業(yè)生產(chǎn)條件的全新蛋白質(zhì)的過程。第二十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)工程的誕生蛋白質(zhì)工程主要包括4大類研究：第一利用已知的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的信息開發(fā)應(yīng)用研究。第二定量確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系。這是目前蛋白質(zhì)工程研究的主體，它包括蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型的建立，酶催化的性質(zhì)、蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性研究等.第三，從混雜變異體庫中篩選具有特定結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的蛋白質(zhì)。第四，根據(jù)已知結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的蛋白質(zhì)，用人工方法合成它及其變異體.第二十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日第三節(jié)

蛋白質(zhì)工程的基本步驟和保護(hù)方法第二十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日

主要內(nèi)容蛋白質(zhì)工程研究的主要步驟一蛋白質(zhì)改造方法二第二十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)工程研究的主要步驟分離純化目的蛋白，使之結(jié)晶并作X晶體衍射分析，結(jié)合核磁共振等其他方法的分析結(jié)果，得到其空間結(jié)構(gòu)的盡可能多的信息。對目的蛋白的功能作詳盡的研究，確定它的功能域。通過對蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)和功能之間的相互關(guān)系的分析，找出關(guān)鍵的基團(tuán)和結(jié)構(gòu)。第二十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)工程研究的主要步驟在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究的基礎(chǔ)上，借助于計(jì)算機(jī)圖像顯示和分子輔助設(shè)計(jì)，提出對目的蛋白分子的改建或構(gòu)建方案，并用基因工程的方法去實(shí)施。對經(jīng)過改造的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能性測定，看看改造的效果如何。第二十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)工程的改造方法在基因水平上對蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，按改造的規(guī)模和程度可以分為：初級改造：個(gè)別氨基酸的改變和一整段氨基酸序列的刪除、置換或插入高級改造：蛋白質(zhì)分子的剪裁，如結(jié)構(gòu)域的拼接從頭設(shè)計(jì)合成新型蛋白質(zhì)第二十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)工程的改造方法初級改造：通過基因突變方法，以達(dá)到改變氨基酸進(jìn)而改造蛋白質(zhì)的目的。

目前，主要采用的基因突變方法：

基因定位突變

盒式突變第二十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)工程的改造方法——初級改造基因定位突變的基本過程：

首先使目的基因由環(huán)狀載體折成單鏈，再對指定的位點(diǎn)用寡聚核苷酸誘導(dǎo)或置入合成的寡聚核苷酸產(chǎn)生定位突變基因，最后將突變基因?qū)脒m宜的表達(dá)系統(tǒng)(如大腸桿菌等)即可產(chǎn)生突變體蛋白質(zhì)。這是目前定向改造蛋白質(zhì)的基本手段。第三十頁，共四十八頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)工程的改造方法——初級改造M13-DNA寡聚核苷酸介導(dǎo)誘變技術(shù)twothreeonefour將要改造的蛋白質(zhì)的目的基因插入到M13單鏈DNA中將雜合DNA雙鏈再轉(zhuǎn)入大腸桿菌中將含突變目的基因的M13噬菌體篩選出來，提取它們的DNA，用限制性內(nèi)切酶把突變目的基因切下，并重組到表達(dá)質(zhì)粒中作為模板，以含有要改變的堿基的一段寡聚核苷酸作為引物，在體外用DNA聚合酶進(jìn)行雙鏈DNA的合成，用DNA連接酶連接成環(huán)狀第三十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)工程的改造方法——初級改造M13-DNA

寡聚核苷酸

介導(dǎo)誘變技術(shù)第三十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)工程的改造方法——初級改造1在目標(biāo)基因中選擇合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)2用含有突變序列的DNA片段來置換目標(biāo)基因上的一段DNA序列3產(chǎn)生突變序列被集中在目標(biāo)基因的一個(gè)特定區(qū)域的突變家族盒式突變的基本過程第三十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)工程的改造方法——初級改造盒式突變第三十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)工程的改造方法——高級改造高級改造：蛋白質(zhì)分子的剪裁，如結(jié)構(gòu)域的拼接結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)構(gòu)象中二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)之間的一個(gè)層次。在較大的蛋白質(zhì)分子中，由于多肽鏈上相鄰的超二級結(jié)構(gòu)緊密聯(lián)系，形成二個(gè)或多個(gè)在空間上可以明顯區(qū)別它與蛋白質(zhì)亞基結(jié)構(gòu)的區(qū)別。結(jié)構(gòu)域拼接是通過基因操作把位于兩種不同蛋白質(zhì)上的幾個(gè)結(jié)構(gòu)域連接在一起，形成融合蛋白，它兼有原來兩種蛋白的性質(zhì)。第三十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)工程的改造方法——高級改造用計(jì)算機(jī)分子模型軟件對金屬硫蛋白的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析表明，天然金屬硫蛋白的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間具有較大的獨(dú)立性，是可以拆分和構(gòu)建的，因而構(gòu)建α結(jié)構(gòu)域的“二倍體”的設(shè)想是可行的。用化學(xué)合成的方法分別合成結(jié)構(gòu)域和連接肽段的基因，并設(shè)法將它們拼接起來。再插入載體并轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞中，使金屬硫蛋白的α結(jié)構(gòu)域多倍體基因在植物中表達(dá)。第三十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)工程的改造方法——高級改造第三十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)工程的改造方法——

合成新型蛋白質(zhì)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改造的蛋白質(zhì)工程可以優(yōu)化蛋白質(zhì)的活性，而全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)是合成具有新奇的結(jié)構(gòu)與功能的新蛋白質(zhì)。第三十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)工程的改造方法——

合成新型蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)一個(gè)蛋白質(zhì)的基本步驟：

（1）從已知三維結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)庫中挑選出一個(gè)合適的片段，進(jìn)行修改和組合

（2）構(gòu)建一個(gè)多肽鏈骨架模型

（3）依據(jù)氨基酸殘基的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)和排列的優(yōu)先順序，確定每個(gè)殘基位置上的氨基酸

（4）優(yōu)化目標(biāo)蛋白的三維模型

（5）檢驗(yàn)和考核所給定的目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是否合理，對所設(shè)計(jì)的模型做進(jìn)一步修正

（6）幾輪的設(shè)計(jì)、檢驗(yàn)和再設(shè)計(jì)，獲得一個(gè)正確折疊和帶有人們預(yù)期功能的目標(biāo)蛋白質(zhì)第三十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日第四節(jié)

蛋白質(zhì)工程在食品產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用第四十頁，共四十八頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)工程在食品產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用

在實(shí)際生產(chǎn)中，可以應(yīng)用蛋白質(zhì)工程對一些生產(chǎn)中重要酶或蛋白質(zhì)性質(zhì)加以改造，提高現(xiàn)有酶或蛋白質(zhì)的工業(yè)實(shí)用性，如提高酶的熱穩(wěn)定性、改變酶的最適pH值條件、提高酶的催化活性等。例如，通過引入二硫鍵，改善酶的熱穩(wěn)定性。第四十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)工程在食品產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)工程自問世以來，短短十幾年的時(shí)間，已取得了引人矚目的進(jìn)展，在醫(yī)學(xué)和工業(yè)用酶方面也獲得了良好的應(yīng)用前景。第四十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日提高蛋白的穩(wěn)定性包括以下幾個(gè)方面：①延長酶的半衰期②提高酶的熱穩(wěn)定性③延長藥用蛋白的保存期④抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性喪失蛋白質(zhì)工程在食品產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用第四十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)工程在食品產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用引入二硫鍵，改善蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性溶菌酶分子：由一條肽鏈構(gòu)成，并在空間上折疊形成二個(gè)相對獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域，酶活性中心位于二個(gè)結(jié)構(gòu)域之間。該酶分子在第97位和54位殘基上是兩個(gè)未形成二硫鍵的半胱氨酸由于二硫鍵是一種穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)的重要共價(jià)化學(xué)鍵，有如建筑所用的鋼筋一樣，因而能將分子中的不同部位牢固地聯(lián)結(jié)在一起。因此，提高酶熱穩(wěn)定性最常用的辦法是在分子中增加一對或數(shù)對二硫鍵。

第四十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)工程在食品產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用轉(zhuǎn)化氨基酸殘基，改善蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性在高溫下Asn和Gln容易脫氨形成Asp和Glu，而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的改變，使蛋白質(zhì)失去活性。對釀酒酵母的磷酸丙糖異構(gòu)酶進(jìn)行誘變改造。這種酶有