白菜根腫病生防菌的篩選及防治效果評(píng)價(jià)

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材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1供試菌種及白菜品種

供試病原菌為黃瓜立枯病菌（Rhizoctoniasolani）、香蕉枯萎病菌（Fusariumoxysporumf.sp.cubense），均由本測(cè)驗(yàn)室保存。供試白菜為易感品種四季奶油小白菜，購(gòu)自臨沭縣城關(guān)供銷(xiāo)農(nóng)資超市。

1.1.2土壤樣品

用5點(diǎn)取樣法采集山東省臨沂市蘭陵縣、山東省壽光市、河南省商丘市夏邑縣土樣共15份，裝入自封袋中4℃保存[11]。

1.1.3培養(yǎng)基

（1）PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL。（2）高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g，KNO31g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g，NaCl0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01g，蒸餾水1000mL，pH=7.4～7.6。（3）LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母提取物10g，NaCl5g，蒸餾水1000mL，pH=7.0。固體培養(yǎng)基為每升液體培養(yǎng)基中參與15g瓊脂粉，121℃滅菌20min[12]。

1.1.4根腫病菌孢子提取

將罹患根腫病的白菜根用無(wú)菌水沖洗明凈，切碎，加蒸餾水于組織磨碎儀內(nèi)攪成勻漿，4層紗布過(guò)濾，濾液移入明凈的50mL離心管中，3100r/min離心15min;棄上清液，沉淀重溶于50mL滅菌水，3100r/min離心10min，重復(fù)3次;棄上清液，沉淀中加50%蔗糖溶液5mL，混勻后3100r/min離心10min，將上清液提防移入明凈的離心管中，加30mL滅菌水，3100r/min離心10min;棄上清液，沉淀重溶于30mL滅菌水，3100r/min離心10min，重復(fù)操作2次;棄上清加無(wú)菌水制成每毫升含2×109個(gè)孢子的懸液，放于4℃冰箱保存?zhèn)溆肹13]。

1.1.5根腫病病土制備

將提取的根腫病孢子懸液和無(wú)菌土以1∶20的比例混合平勻，配成每克含1×108個(gè)孢子的病土，避光放于24℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h[14]。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1生防菌的分開(kāi)

采用平板梯度稀釋法分開(kāi)土壤中微生物：稱(chēng)取土壤樣品10g于裝有90mL無(wú)菌水的滅菌三角瓶（300mL）中，于28℃、200r/min搖床振蕩30min得10-1g/mL的土壤稀釋液，按上述方法依次稀釋制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7g/mL的稀釋液。每個(gè)濃度分別取100μL涂布于培養(yǎng)基上，重復(fù)3次，PDA和高氏一號(hào)培養(yǎng)基放于28℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)4～6d用于分開(kāi)真菌和放線(xiàn)菌，LB培養(yǎng)基放于37℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)1～2d用于分開(kāi)細(xì)菌，待各平板長(zhǎng)出菌落后挑取單菌落重新接種于對(duì)應(yīng)平板上分開(kāi)純化，分開(kāi)出的土壤微生物于4℃冰箱備用。

1.2.2生防菌的篩選

采用平板對(duì)峙篩選法。拮抗真菌的篩選方法：取28℃恒溫培養(yǎng)5d的病原指示菌菌餅（直徑5mm）倒置接種在PDA培養(yǎng)基平板（直徑9cm）中心，同時(shí)在距中央菌餅3cm的圓周上對(duì)稱(chēng)接種分開(kāi)出的真菌菌餅（直徑5mm）;拮抗細(xì)菌和放線(xiàn)菌的篩選方法：取28℃恒溫培養(yǎng)5d的病原指示菌菌餅（直徑5mm）倒置接種在PDA培養(yǎng)基平板（直徑9cm）中心，28℃培養(yǎng)2d后在距中央菌餅3cm的圓周上對(duì)稱(chēng)劃線(xiàn)接種分開(kāi)出的細(xì)菌或放線(xiàn)菌。以只接病原指示菌的平板為對(duì)照，3次重復(fù)，28℃恒溫培養(yǎng)，待對(duì)照長(zhǎng)滿(mǎn)平板時(shí)，計(jì)算抑菌率[15]。

抑菌率（%）=（對(duì)照病原菌的菌落直徑-處理病原菌的菌落直徑）/對(duì)照病原菌的菌落直徑×100

1.2.3生防菌代謝產(chǎn)物制備

將篩選出的生防菌活化后接入液體培養(yǎng)基中，細(xì)菌用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37℃、200r/min搖床培養(yǎng)1d，真菌用PDA液體培養(yǎng)基于28℃、180r/min搖床培養(yǎng)4d，放線(xiàn)菌用高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基于28℃、180r/min搖床培養(yǎng)6d。8層滅菌紗布過(guò)濾，濾液8000r/min離心20min，上清液即為生防菌代謝產(chǎn)物。

1.2.4生防菌對(duì)根腫病菌孢子的裂解率

取4mL預(yù)先制備的根腫病菌孢子懸浮液同生防菌代謝產(chǎn)物上清液等體積混合裝入15mL滅菌離心管中，空白培養(yǎng)基與根腫病菌孢子等體積混合后作為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)，置于25℃、200r/min搖床振蕩24h，取樣后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)形態(tài)完整的根腫病孢子數(shù)量并計(jì)算裂解率[13]。

裂解率（%）=（1-生防菌代謝產(chǎn)物上清液中形態(tài)完整的根腫病菌孢子數(shù)/空白培養(yǎng)基中形態(tài)完整的根腫病菌孢子數(shù)）×100

1.2.5溫室盆栽防病試驗(yàn)與防效評(píng)價(jià)

本試驗(yàn)于2022年2月14日至2022年3月15日在金正大生態(tài)工程集團(tuán)股份有限公司智能溫室內(nèi)舉行。取培養(yǎng)48h的根腫病病土和無(wú)菌土按1∶10的比例混合平勻后分裝到塑料缽（11cm×8cm×6cm）中，每缽裝土5kg并栽種1棵育苗20d的小白菜。分別在移栽時(shí)及移栽后10、20d將篩選出的10mL生防菌培養(yǎng)液和1g20-20-20水溶肥溶于300mL水中澆于白菜根部，每種生防菌6次重復(fù)，以空白培養(yǎng)基和沖施1g20-20-20水溶肥為對(duì)照。種植約30d后調(diào)查根腫病發(fā)生處境。

根腫病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[16]：0級(jí)，根部無(wú)腫瘤;1級(jí)，側(cè)根有小腫瘤;3級(jí)，主根腫大，直徑小于2倍莖基部;5級(jí)，主根腫大，直徑是莖基部的2～3倍;7級(jí)，主根腫大，直徑是莖基部的3～4倍;9級(jí)，主根腫大，直徑是莖基部的4倍以上或腫瘤龜裂。

病情指數(shù)=∑（各級(jí)發(fā)病株數(shù)×各級(jí)代表值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)發(fā)病值）×100;

防治效果（%）=（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100。

2結(jié)果與分析

2.1生防菌的篩選

從15份土壤樣品中共分開(kāi)出421株菌，其中細(xì)菌255株、放線(xiàn)菌101株、真菌65株。共篩選出18株對(duì)黃瓜立枯病菌和香蕉枯萎病菌均有較強(qiáng)抑制作用的生防菌，包括細(xì)菌（KB）11株、放線(xiàn)菌（KA）5株、真菌（KF）2株，抑菌效果見(jiàn)表1。其中放線(xiàn)菌KA-35對(duì)兩種病原菌均有很強(qiáng)的抑制作用，抑菌率分別是78.67%和63.83%;細(xì)菌KB-94對(duì)黃瓜立枯病菌有很強(qiáng)的抑制作用（79.33%）;放線(xiàn)菌KA-3對(duì)香蕉枯萎病菌有很強(qiáng)的抑制作用（63.00%）。

2.2生防菌對(duì)根腫病菌孢子的裂解率

18株生防菌中有8個(gè)生防菌代謝產(chǎn)物上清液對(duì)根腫病菌孢子的裂解率在30%以上（表2），其中放線(xiàn)菌株KA-35、KA-29和細(xì)菌菌株KB-244代謝產(chǎn)物上清液對(duì)根腫病菌孢子的裂解率分別達(dá)45.26%、42.11%和48.42%。

2.3溫室盆栽防治效果評(píng)價(jià)

選用對(duì)根腫病菌孢子裂解效果較好的KA-35、KA-29和KB-244菌株，通過(guò)沖施四季小白菜檢測(cè)對(duì)根腫病的防治效果。結(jié)果（表3）說(shuō)明，三個(gè)菌株均對(duì)根腫病有防治效果，其中放線(xiàn)菌株KA-35防效最好，為57.11%，單株地上部鮮重增加127.40%;細(xì)菌KB-244防效次之，為39.61%，單株地上部鮮重增加33.41%。

3議論與結(jié)論

本研究從土壤中篩選出了11株細(xì)菌、5株放線(xiàn)菌、2株真菌共18株對(duì)黃瓜立枯病菌和香蕉枯萎病菌都有較強(qiáng)抑制作用的生防菌，通過(guò)根腫病孢子裂解試驗(yàn)從中篩選出KA-35、KA-29和KB-2443株生防菌用于盆栽試驗(yàn)，察覺(jué)KA-35和KB-244能有效抑制白菜根腫病的爆發(fā)，且單株地上部鮮重較對(duì)照顯著增加。多數(shù)生防菌在測(cè)驗(yàn)室內(nèi)有較好防效，在田間應(yīng)用時(shí)卻不甚夢(mèng)想，主要理由是生防菌在農(nóng)作物上難以定殖[17]。雖然KA-35和KB-244均來(lái)源于白菜根系，且在盆栽試驗(yàn)中能有效抑制根腫病的爆發(fā)，但其在大田中的效果還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

蔣歡等[18]察覺(jué)土壤pH4.50～6.50的弱酸性環(huán)境利于根腫病的發(fā)生，通過(guò)調(diào)理土壤pH值可以有效防治根腫病的發(fā)生。楊亨等[19]對(duì)綿陽(yáng)28個(gè)油菜主栽品種舉行抗根腫病鑒定及聚類(lèi)分析，察覺(jué)不同品種對(duì)根腫病的抗性不同，通過(guò)選育抗性品種可以降低根腫病的發(fā)病處境?？赏ㄟ^(guò)栽培前施用石灰、硅鈣鉀鎂肥等調(diào)理土壤pH為中性或偏堿性，再結(jié)合栽培抗根腫病品種，移栽后沖施KA-35、KB-244、XF-1等生防菌株綜合防治根腫病的發(fā)生。

放線(xiàn)菌能產(chǎn)生豐富的、活性多樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物，與人類(lèi)生產(chǎn)、生活有著極為緊密的關(guān)系，其自然代謝產(chǎn)物一向是現(xiàn)代醫(yī)藥業(yè)、農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)中藥物先導(dǎo)化合物的重要來(lái)源，如阿維菌素、鏈霉素、寧南霉素、多抗霉素等，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有很重要的地位。應(yīng)用其代謝產(chǎn)物防治植物病害，可裁減農(nóng)藥用量，維系生態(tài)平衡，確保農(nóng)業(yè)可持續(xù)進(jìn)展[20，21]。本研究篩選出的放線(xiàn)菌株KA-35不僅能抑制白菜根腫病的爆發(fā)，而且對(duì)黃瓜立枯病菌和香蕉枯萎病菌都有很好的抑制效果，后期將通過(guò)發(fā)酵優(yōu)化、提純對(duì)其代謝產(chǎn)物做進(jìn)一步研究。

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