藥用植物Lippiasidoides內(nèi)生真菌

摘要EndophyticfungiwereisolatedfromhealthytissuesofLippiasidoidesCham.(Verbenaceae),from480fragmentsofleaves(240)andstems(240),atotalof203endophyticfungiwereisolated,representing14speciesbelongingtothegroupsAscomycota,CoelomycetesandHyphomycetes.Endophyticcolonizationwasgreaterinleaves(50.4%)thaninstems(35.4%).Colletotrichumgloeosporiodeshadthemaximumcolonizationfrequency(12.3%),followedbyAlternariaalternata(7.08%),Guignardiabidwelli(6.87%)andPhomopsisarcheri(5.41%).

內(nèi)生真菌是從健康的利比草（馬鞭草科）中分離。（240個葉子組織，240個莖段，總共480個組織中分離出203個真菌）真菌從屬于14個菌種，其中子囊菌，腔胞菌，以及絲孢菌。炭疽菌是分布最大的真菌（12.3%），接下來是交鏈格孢（7.08%），葡萄球黑腐病（6.87%），阿切爾擬莖點霉菌（5.41%）第1頁/共34頁第一頁，共35頁。Somespeciesshowedspecificityforthehosttissue:Curvulariapallescens,Dreschleradematioidea,G.bidwellii,Microascusdesmosporum,Peacilomycesvariotti,PericoniabyssoidesandUlocladiumoudemansiiwereonlyisolatedfromleaveswhileFusariumlateritiumandPhomatracheiphilawereonlyisolatedfromstems.Throughapreliminaryscreeningandfermentationassay,16isolateswherefoundtoproduceantimicrobialmetabolitesagainstbacterialandfungi.Thediversityandroleofendophytesinmedicinalplantsisbrieflydiscussed.Inconclusion,endophyticfungifromL.sidoideshavepharmaceuticalpotentialandcanbeseenasanattractivesourceofbiologicallyactivecompounds.一些菌種在寄主植物中表現(xiàn)出獨特的分布特點：蒼白彎孢霉，Dreschleradematioidea，葡萄球黑腐病菌，

Microascusdesmosporum,擬青霉，黑團孢，奧德曼細基格孢只能從葉子中分離，而磚紅鐮孢霉

，桔莖點霉

只能從莖中分離，通過初步篩選以及發(fā)酵產(chǎn)物分析，16種分離的真菌發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生抗菌性代謝產(chǎn)物來抑制細菌和真菌，在藥用植物中內(nèi)生真菌的差異以及作用進行了簡短的討論?？傊?，從立比草中分離的內(nèi)生真菌在藥物學上有很大的潛力，可以被看做頗具吸引了的生物活性化合物第2頁/共34頁第二頁，共35頁。立比草的藥用特性

立比草屬于南美，中美和非洲生長的馬鞭草科，有大約200種不同的種類。它產(chǎn)生的香精油含有高含量的成分麝香和香芹酚。許多藥理學家測試確認它可作為傳統(tǒng)藥物來治療感染性疾病。它的葉子和花制成的茶葉能夠作為防腐劑治療刀傷和燒傷的抗感染藥物第3頁/共34頁第三頁，共35頁。內(nèi)生真菌與寄生植物的關(guān)系

寄主植物健康組織和細胞內(nèi)的內(nèi)生真菌一般不引起任何明顯的疾病癥狀，他們能夠建立起一種共生的關(guān)系，研究表明內(nèi)生真菌給他們的寄主提供一些利益，比如幫助他們抵抗有害昆蟲，病原體甚至家禽。因此，植物的藥物學特性可能來自于其產(chǎn)生的具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物。這些產(chǎn)物可能是極其罕見的重要的有機物。因此內(nèi)生真菌被視為對農(nóng)業(yè)，工業(yè)，醫(yī)藥領(lǐng)域新的有用的天然的具有活性的產(chǎn)品的重要來源。第4頁/共34頁第四頁，共35頁。研究目的★

分離內(nèi)生真菌★

確定各真菌的分布頻率★

評價他們產(chǎn)生的抗菌化合物的潛力第5頁/共34頁第五頁，共35頁。實驗過程

一.真菌分布率的計算

⑴

立比草植物材料表面進行消毒及滅菌。莖和葉在流動的水龍頭下沖洗，70%酒精下浸泡1min，NaClO浸泡4min，再在70%乙醇中浸泡30S，最后用滅菌的蒸餾水洗3次。通過取最后一滴的沖洗水滴到含有TSA皮氏培養(yǎng)基中來確定滅菌效率。（為什么用這種培養(yǎng)基）

⑵

表面消毒后，將樣品葉子切成0.5cm2，莖切成第6頁/共34頁第六頁，共35頁。0.5㎝的碎片，在無菌條件下轉(zhuǎn)接到含SAB的皮氏培養(yǎng)基（添加了四環(huán)素100μg/mL和氯霉素100μg/mL來抑制雜菌生長）中。（為什么用這種培養(yǎng)基）

⑶

30℃培養(yǎng)30天。每天進行觀察，將所有出現(xiàn)的真菌都進行分離后，再培養(yǎng)在PDA上供進一步鑒定，真菌的分布頻率考慮了分離得到的菌株Ni數(shù)和總的細菌數(shù)Nf。（為什么用這種培養(yǎng)基，怎樣將所有真菌分離，如何準確確定分離真菌）

FC%=Ni/Nf×100%第7頁/共34頁第七頁，共35頁。注釋（查找個培養(yǎng)基的作用）

SAB培養(yǎng)基=沙氏瓊脂培養(yǎng)基組成（g/L蛋白胨10；葡萄糖10；瓊脂15；pH5.6

）PDA培養(yǎng)基=馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基組成（g/L馬鈴薯200；葡萄糖20；瓊脂15；pH6.0

）TSA培養(yǎng)基=大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基組成（g/L

蛋白胨5；胰蛋白胨5；次氯酸鈉15；瓊脂15；pH5.6

）

第8頁/共34頁第八頁，共35頁。二.內(nèi)生真菌的鑒定利用菌落的宏觀特性（顏色，外觀，黏度，和色素沉淀）以及他們的微觀特性（植物形態(tài)和生物結(jié)構(gòu)），在鑒定時，待鑒定的真菌需要先在PDA,SAB和液體培養(yǎng)基在28±2℃下培養(yǎng)30天。第9頁/共34頁第九頁，共35頁。三.目標微生物（為什么用這些菌）作為本次實驗抗菌活性目標微生物的細菌是金黃色葡萄球菌，枯草桿菌，大腸桿菌，肺炎桿菌，銅綠假單胞菌，真菌則是白色念珠菌，糠秕馬拉色霉菌，深紅毛癬菌第10頁/共34頁第十頁，共35頁。四.抗菌活性的篩選每種真菌在PDA皮氏培養(yǎng)基表面30℃下培養(yǎng)7天，平板上用被火燒熱后的塞子鉆孔（直徑6㎜）取菌落并轉(zhuǎn)移到預先鋪有細菌，白色念珠菌和深紅毛癬菌及糠秕馬拉色菌的0.5%橄欖油的SAB培養(yǎng)基上。接有細菌的皮氏培養(yǎng)皿在37℃下培養(yǎng)24h，真菌在30℃下培養(yǎng)48h，通過可視法檢測抑制環(huán)來確認抗菌活性。第11頁/共34頁第十一頁，共35頁。五，發(fā)酵產(chǎn)物檢測利用擴散分析對上面篩選顯示生長最好的菌株進行進一步檢測。通過生長著培養(yǎng)菌的5個塞子（直徑6㎜）和50mlPDB燒瓶來準備預接種菌。所有的培養(yǎng)物都在28±2℃，轉(zhuǎn)速為180r/min的搖床上培養(yǎng)。將10ml的培養(yǎng)物分別轉(zhuǎn)接到90mlPDA，ME，EPM的500ml燒瓶中，燒瓶在同樣條件下培養(yǎng)96h,每隔24h,將1ml的發(fā)酵液在225g下離心15min。利用培養(yǎng)皿擴散法測定30μL浮在上面的物質(zhì)抗菌活性。第12頁/共34頁第十二頁，共35頁。注釋PDB馬鈴薯葡萄糖肉湯組成（g/L馬鈴薯200，葡萄糖20；

pH6.0

）ME麥芽浸膏湯組成（g/L麥芽提取物20）

EMP（eurimycinproductionmedium）泛霉素培養(yǎng)基組成（g/L

大豆粉20；葡萄糖20,；碳酸鈣2；氯化鈉5）第13頁/共34頁第十三頁，共35頁。實驗結(jié)果和討論㈠

表面滅菌的效率是通過微生物在接種30天后增加的減少量來確定，從植物組織中真菌的產(chǎn)物是在48h后被首次發(fā)現(xiàn)的㈡真菌的分布特性總共203種分離的內(nèi)生真菌是從被分析的480塊植物碎片中分離的（240片葉子和240塊莖碎片），分布率為42.29%。第14頁/共34頁第十四頁，共35頁。㈢在葉片和莖塊中真菌群落中有所不同。其中121種（50.41%）真菌從葉片中獲得，83種（41.2%）從莖塊中獲得㈣這些被分離的菌種能夠被確認從屬于下列14種菌種屬于子囊菌，腔胞菌，以及絲孢菌，炭疽菌是被分離出來頻率最大的菌種（12.3%），接下來是交鏈格孢（7.08%），葡萄球黑腐菌（6.87%），阿切爾擬莖點霉菌（5.41%）這些分離的菌中顯示是沒有生殖結(jié)構(gòu)的則屬于無孢菌類，

第15頁/共34頁第十五頁，共35頁。立比草組織中分離的內(nèi)生真菌的數(shù)目及其比例葉子莖總數(shù)N%N%N%交鏈格孢72.912711.2347.08鏈格孢菌10.4110.4120.41膠孢炭疽菌4217.5177.085912.3棒孢菌20.8320.41蒼白彎孢霉10.4110.2德氏dematioidea31.2530.62磚紅鐮孢霉52.0851.04葡萄球黑腐病菌3313.7336.87第16頁/共34頁第十六頁，共35頁。microascusdesmosporum20.8320.41擬青霉10.4110.2黑團孢20.8320.41桔莖點霉83.381.66阿切爾擬莖點霉104.16166.6265.41奧德曼細基格孢10.4110.2無孢霉群166.683.3245total12150.418335.4203空格表示沒有真菌第17頁/共34頁第十七頁，共35頁。㈤一些核心的內(nèi)生菌種比如交鏈菌，炭疽菌，擬莖點霉，以及球座菌總是從任意給定的寄主中分離出來以外，還有一系列次要的菌種均能每次在數(shù)百個樣品中被分發(fā)現(xiàn)一到兩次。包括細極鏈格孢念珠菌，棒孢霉，蒼白彎孢霉，多變擬毒霉，亞麻色黑團孢霉以及奧德曼細單格孢這些只能從小部分樣品中被分離出來。通常稀有的和次要的真菌菌種分離的數(shù)目與取樣的次數(shù)有關(guān)。第18頁/共34頁第十八頁，共35頁。㈥分生聚集體趨向于分布在特定的組織中，例如葡萄球黑腐病菌僅能從立比草的葉子中獲得，桔莖點霉僅能從莖中獲得，以及炭疽菌和交鏈格孢能從葉和莖中獲得。㈦不同植物組織就像分開的小環(huán)境，甚至一種植物相關(guān)的習性是一種動態(tài)的環(huán)境。這些植物寄主與內(nèi)生真菌以及致病微生物相聯(lián)系，寄主植物的年齡，生長海拔以及生長方位都能夠影響內(nèi)生真菌聚集體以及菌群出現(xiàn)的頻率。第19頁/共34頁第十九頁，共35頁。真菌抗菌性分析所有從立比草中分離的真菌都被提取出來在固體培養(yǎng)基上進行了抗菌性分析。（一）203種內(nèi)生真菌中有16種真菌在培養(yǎng)基上對目標微生物產(chǎn)生了從12到30mm不等的抑菌圈。第20頁/共34頁第二十頁，共35頁。從葉子上分離的雖然只有一小部分菌種，但是有較廣的活性光譜，以及抑制革蘭氏陽性菌和陰性菌的能力。這可以來解釋傳統(tǒng)藥物中利用立比草葉子來簡要治療細菌和真菌感染的傳染性疾病。活性光譜第21頁/共34頁第二十一頁，共35頁。（二）從立比草葉片中提取的香精油以高含量的百里香酚和香芹酚而著名。這些物質(zhì)顯示出很強的抗藥活性。特別是對于扛細菌和真菌的醫(yī)學重要性?？蓺绲木N如下①假絲酵母和狗小孢霉。②傳染性皮膚?、凵x齒的鏈球菌和白色念珠菌酵母④二斑葉螨，二斑葉螨是世界上比較嚴重的大棚蔬菜害蟲。⑤埃及伊蚊的幼蟲第22頁/共34頁第二十二頁，共35頁。內(nèi)生真菌的有抗菌活性的菌被限制在四種菌：交鏈格菌(9)，阿切爾擬莖點霉（2），D.dematioidea(2)，炭疽菌（11），還有另外兩種類型顯示出生物活性，但是不能產(chǎn)生生殖結(jié)構(gòu)因此被稱為無孢菌絲類（2）（括號里的數(shù)字表明每種表現(xiàn)出對于生物抗性活性的菌的數(shù)目）

第23頁/共34頁第二十三頁，共35頁。通過發(fā)酵液中內(nèi)生真菌在預先接種的培養(yǎng)基上抑菌圈的大小來測定它們抗菌活性第24頁/共34頁第二十四頁，共35頁。通過發(fā)酵液中內(nèi)生真菌在預先接種的培養(yǎng)基

上抑菌圈的大小來測定它們抗菌活性

內(nèi)生真菌培養(yǎng)基時間PH

抑菌圈（mm）SABSKPMFTR交鏈格孢EMP967.2817ntntntnt交鏈格孢ME726.3417ntntntnt交鏈格孢ME725.982518ntntnt交鏈格孢ME965.62---—--------交鏈格孢ME726.0225ntntntnt交鏈格孢ME966.19---—--------第25頁/共34頁第二十五頁，共35頁。交鏈格孢ME726.6515ntntntnt交鏈格孢ME726.2217ntntntntdrechsleradematioidea

ME725.1317ntntnt--drechsleradematioideaPDB967.3215—nt----阿切爾擬莖點霉PDB725.218—ntntnt無孢霉群ME966.36ntnt13--nt無孢霉群PDB964.711513---nt---無孢霉群PDB486.02-------------第26頁/共34頁第二十六頁，共35頁。注釋nt=nottested;---=無活性；SA=金黃色葡萄球菌;BS=枯草桿菌;KP=肺炎桿菌;MF=糠秕馬拉色菌;TR=深紅毛癬菌第27頁/共34頁第二十七頁，共35頁。將16種內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物進行進一步分析。10種表現(xiàn)出抗微生物活性，他們中90%表現(xiàn)出對于金黃色葡萄球菌的抗性，30%對枯草桿菌有抗性，10%對肺炎桿菌有抗性。這些抑菌圈的直徑范圍在13mm到25mm之間。但是沒有內(nèi)生真菌表現(xiàn)出對于糠秕馬拉色菌和深紅毛癬菌的抗菌活性。第28頁/共34頁第二十八頁，共35頁。在發(fā)酵產(chǎn)物鑒定中的參數(shù)：像PH,生產(chǎn)時間，和培養(yǎng)基組成進行分析表明麥芽浸膏湯（ME）（72~96h)以及ph5~7是對于微生物產(chǎn)活性化合物最好的培養(yǎng)條件。這些培養(yǎng)條件，攪動以及溫度能夠增加或減少真菌發(fā)酵的產(chǎn)的具有生物活性化合物的產(chǎn)量。培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)基組成，以及通氣量也會影響內(nèi)生真菌產(chǎn)化合物的數(shù)目，組成。因此，更加深入的檢測需要去評估這些菌種的生物活性。第29頁/共34頁第二十九頁，共35頁。延伸研究在另外一些藥性植物的研究中，交鏈格孢，交鏈孢霉，炭疽菌和擬莖點霉也被分離出來，并且發(fā)現(xiàn)他們對于細菌金黃色葡萄球菌，耐甲氧西林金葡萄球菌，大腸桿菌和苦草桿菌具有抗性。還有從蒙古蒿莖內(nèi)分離的膠孢炭疽菌作為一種內(nèi)生菌，它產(chǎn)生的一種抗菌代謝物被稱為炭疽酸，能抑制枯草桿菌，金黃色葡萄球菌，以及植物性病源真菌麥根腐長蠕孢。。第30頁/共34頁第三十頁，共35頁。

擬莖點霉從藥用植物雞冠刺桐中分離，產(chǎn)生的抗生素命名為