漆酶的固定化,實(shí)驗(yàn)方案

樹(shù)脂是工業(yè)中使用得比較廣泛的材料，它價(jià)格低廉、機(jī)械強(qiáng)度好、物化性能穩(wěn)定、容易再生，用作固定化酶的載體將會(huì)有很好的發(fā)展前景。離子交換樹(shù)脂是一類不溶也不熔且具有三維空間網(wǎng)狀骨架結(jié)構(gòu)親水性的功能高分子。連接在樹(shù)脂骨架上的功能基，可通過(guò)吸附、共價(jià)鍵、離子鍵、配位鍵、交聯(lián)、微膠囊等形式以及其他手段將酶固定在樹(shù)脂上，構(gòu)成固定化酶［65］。樹(shù)脂D380是一種淺黃色球形大孔弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹(shù)脂，在其苯乙烯-二乙烯苯骨架上帶有伯胺基，屬于反應(yīng)性高分子材料。該樹(shù)脂表面的功能基團(tuán)-NH2,可以和戊二醛一端的醛基反應(yīng)生成西弗(Schiff)堿，而戊二醛的另一個(gè)醛基可以連接酶蛋白中游離的-NH2,因此達(dá)到固定化酶的目的。2.1實(shí)驗(yàn)部分2.1.1實(shí)驗(yàn)儀器和試劑2.1.1.1.實(shí)驗(yàn)儀器試驗(yàn)中用到的主要實(shí)驗(yàn)儀器見(jiàn)表2.1。氣浴恒溫振蕩器 THZ-92B型數(shù)顯恒溫水浴鍋 HH-S型電子分析天平 AB204-N型紫外一可見(jiàn)光分光光度計(jì) VIS-7220G循環(huán)水真空泵 SHI-III型2.1.1.2.實(shí)驗(yàn)試劑主要實(shí)驗(yàn)試劑見(jiàn)表2.2。真菌漆酶>20u/mg樹(shù)脂D380戊二醛分析純鄰聯(lián)甲苯胺分析純醋酸分析純醋酸鈉分析純碳酸氫二鈉分析純

分析純分析純分析純分析純分析純氫氧化鈉鹽酸2.1.2實(shí)驗(yàn)方法2.1.2.1樹(shù)脂D380的預(yù)處理取一定量的樹(shù)脂，去離子水浸泡24h,然后用5%HCL浸泡12h,洗滌全中性后再用2%的Na0H浸泡12h,再次洗滌全中性，最后以去離子水浸泡備用。2.1.2.2漆酶的固定化首先，采用兩種方法路線固定化漆酶：先用戊二醛交聯(lián)載體后再吸附漆酶和先用載體吸附漆酶后再用戊二醛交聯(lián)，分別測(cè)定兩種方法固定化漆酶的活力，流程見(jiàn)圖2.1所示。其中戊二醛濃度為2%(V:V)，加入量為20mL，緩沖溶液為5mLpH為5.5的醋酸緩沖溶液，酶液為10mL濃度1mg/mL的稀釋酶液。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明前者效果明顯優(yōu)于后者，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用此法進(jìn)行。漆酶的固定化方法:取適量預(yù)處理過(guò)的樹(shù)脂，抽濾去除表面水分，稱取1g置于50ml圓底燒瓶中，加入20ml0.7%(V:V)的戊二醛，在4°C下攪拌反應(yīng)2h后靜置過(guò)夜，再用蒸餾水洗滌多次(至少5次)，去掉未交聯(lián)的戊二醛，然后加入5mlpH為4的醋酸一醋酸鈉緩沖液和2mL稀釋酶液在振蕩器中在25C振蕩反應(yīng)6h，反應(yīng)后放在冰箱于4C下靜置一夜，洗滌多次(至少5次)去除未固定化的漆酶，并測(cè)定固定化漆酶酶活。

圖2.1兩種固定化方法的流程圖2.1.2.3漆酶活性的測(cè)定根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件，本文以鄰聯(lián)甲苯胺做底物，采用紫外分光光度法測(cè)定該真菌漆酶的酶活力。自由漆酶活力的測(cè)定方法【72】：按照表2.3所示，加入各試劑于比色管中，在25^的恒溫水浴中保溫30min,以煮沸滅活的方式終止反應(yīng)，在VIS-7220G型紫外一可見(jiàn)分光光度計(jì)上按表1所示波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值。定義每分鐘引起0.0l吸光度值變化所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(U/mg)。同時(shí)做3個(gè)平行樣，一個(gè)空白樣(0.1ml酶液換為蒸餾水),結(jié)果計(jì)算取平均值。表2.3.漆酶活力測(cè)定底物緩沖液漆酶用量測(cè)定波長(zhǎng)0.5ml3.36mM鄰聯(lián)甲苯胺3.4ml0.1M,pH4.6醋酸-醋酸鈉溶液0.1ml0.1mg/ml漆酶溶液600nm固定化酶活的測(cè)定：稱取50mg固定化漆酶于比色管中，加入表2.3中的底物和緩沖液，在氣浴恒溫振蕩器中25°C下振蕩30min,取上清液測(cè)其在600nm處的吸光度值，計(jì)算每克載體的酶活(u/g)。同樣做3個(gè)平行樣，一個(gè)空白樣，結(jié)果取平均值。固定化漆酶的酶活活回收率按照下式計(jì)算：酶活回收率(％)二固定化漆酶的總酶活/所用自由漆酶的總酶活2.1.2.4漆酶的米氏常數(shù)Km的測(cè)定按照測(cè)定自由酶和固定化酶的方法，配制不同濃度的底物，反應(yīng)后測(cè)定吸光度值A(chǔ)，以吸光度值的倒數(shù)1/A代表其反應(yīng)速度的倒數(shù)1/V作為縱坐標(biāo)，以底物鄰聯(lián)甲苯胺的濃度倒數(shù)1/S為橫坐標(biāo)，作圖以求出自由漆酶和固定化漆酶的Km值。2.2.2漆酶固定化條件優(yōu)化酶的固定化率受固定過(guò)程中各個(gè)因素的影響比較大，如交聯(lián)劑用量、交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間、酶用量、酶吸附時(shí)間、吸附溫度、pH值等。對(duì)這些因素進(jìn)行優(yōu)化研究，以得到固定漆酶的最佳條件。2.2.2.1戊二醛濃度對(duì)固定化漆酶的影響按照2.1.2.2的固定化方法，選擇戊二醛的濃度為0.1%、0.3%、0.5%、O.7%、0.9%和1%(v:v)，交聯(lián)反應(yīng)4出加入pH=5.5的醋酸一醋酸鈉緩沖溶液和5mL酶液，振蕩反應(yīng)6h。將結(jié)果畫(huà)成折線圖戊二醛是交聯(lián)劑，能夠與載體和漆酶的氨基發(fā)生反應(yīng)生成西弗(Schiff)堿【30】，隨著濃度的增加，固定在載體上的漆酶是增加的。但是，戊二醛也能使漆酶變性【571,達(dá)到一定濃度時(shí)，反而使漆酶因失活而回收率下降。2.2.2.2交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化漆酶的影響戊二醛濃度為0.7%,交聯(lián)時(shí)間分別為2、4、6、8、l0和12h,其他條件不變，測(cè)定固定化漆酶活力，作圖 酶活回收率下降，可能是由于戊二醛對(duì)漆酶的失活作用所致。隨著交聯(lián)時(shí)間的延長(zhǎng)，固定化漆酶的酶活回收率變化不大，說(shuō)明戊二醛與載體上氨基的反應(yīng)已經(jīng)飽和。2.2.2.3漆酶用量對(duì)固定化漆酶的影響按照以上的固定化方法，漆酶用量取1、2、3、4、5和6ml。作圖。當(dāng)給酶量一定時(shí)漆酶的游離氨基與載體上游離醛基的反應(yīng)達(dá)到飽和2.2.2.4吸附時(shí)間對(duì)固定化漆酶的影響當(dāng)給酶量為2ml，吸附時(shí)間分別為2、4、6、8、10、和12h時(shí)，測(cè)定固定化漆酶的酶活回收率。作圖。 隨著時(shí)間增加，酶活回收率先增加后降低，在最高點(diǎn)時(shí)吸附達(dá)到飽和，再增加吸附時(shí)間，由于振蕩會(huì)使吸附在載體上未反應(yīng)的漆酶掉落，酶活回收率降低。2.2.2.5溫度對(duì)固定化漆酶的影響按照以上的固定化方法，設(shè)定吸附溫度為15、20、25、30、35和40°C，測(cè)定漆酶活力，作圖。2.2.2.6pH值對(duì)固定化漆酶的影響吸附溫度設(shè)為25C，加入緩沖液的pH分別為3、3.5、4、4.5、5、5.5和6時(shí)，觀察固定化酶的酶活回收率變化，作圖。2.2.3.紅外分析樹(shù)脂D380是一種淺黃色球形大孔弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹(shù)脂，在其苯乙烯-二乙烯苯骨架上帶有伯胺基，屬于反應(yīng)性高分子材料。該樹(shù)脂表面的功能基團(tuán)-NH2,可以和戊二醛一端的醛基反應(yīng)生成西弗（Schiff）堿，而戊二醛的另一個(gè)醛基可以連接酶蛋白中游離的-NH2,因此達(dá)到固定化酶的目的。將戊二醛交聯(lián)后和固定化漆酶后的載體做紅外光譜檢測(cè)圖中3400cm處的強(qiáng)峰為-OH和-NH2的伸縮振動(dòng)峰，2920cm附近的吸收峰均為C-H的伸縮振動(dòng)峰2.2.4.1固定化漆酶的最適溫度在不同的溫度下測(cè)定固定化漆酶的活力，如圖2.10所示，15?20°C為固定化漆酶的最適溫度范圍，30C以后酶活力損失較大，說(shuō)明該形式的漆酶在過(guò)高的溫度下容易失活。相對(duì)于自由漆酶的最適溫度30C，固定化漆酶的最適溫度有所下降。2.2.4.2固定化漆酶的最適pH在不同的pH（3—6為CH3COOH-CH3COONa溶液，7—8為NaH2P04-Na2HP04溶液）下測(cè)定固定化漆酶的活力，如圖2.11所示，可見(jiàn)該固定化漆酶的最適pH為4，比較適合酸性環(huán)境，當(dāng)pH大于5時(shí)，酶活力損失較大。2.2.4.3兩種形式漆酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性比較將自由漆酶和固定化漆酶在4C下存放兩周，定期分別測(cè)定其酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖2.12。由圖可見(jiàn)，固定化漆酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性較好，在兩周后還有約80%的相對(duì)酶活，而自由漆酶僅為50%。由此可見(jiàn)，固定化漆酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性大大提高。2.2.4.4兩種形式漆酶的米氏常數(shù)Km按照測(cè)定自由酶和固定化酶的方法配置不同濃度的鄰甲聯(lián)苯胺（0.1、0.2、03、0.4和0.5mmol/L）作為底物測(cè)定反應(yīng)后的吸光度值A(chǔ)，以吸光度值的倒數(shù)1/A代表其反應(yīng)速度的倒數(shù)1/V作為縱坐標(biāo)，以底物鄰聯(lián)甲苯胺的濃度倒數(shù)1/S為橫坐標(biāo)，依照Lineweaver一Burk圖解法求出自由漆酶和固定化漆酶的Km值。2.3本章小結(jié)樹(shù)脂的諸多優(yōu)點(diǎn)使其成為工業(yè)上廣泛使用的材料。用離子交換樹(shù)脂D380已經(jīng)成功地固定了胰蛋白酶【75】和果膠酶‘651，而用其固定漆酶尚未見(jiàn)報(bào)道。本章以樹(shù)脂D380為載體，戊二醛為交聯(lián)劑固定化漆酶，得到最佳固定化條件為：戊二醛濃度0.7%,交聯(lián)時(shí)間2h,加酶量2mL,吸附時(shí)間6h,固定化溫度25°C,pH為4,最終得到的酶活回收率為65.94%。在最佳條件下得到的固定化漆酶的最適溫度為20C,最適pH為4,在4C下保存兩星期仍保持約80%的酶活，而自由漆酶僅為