微生物學(xué)的復(fù)制和修復(fù)

微生物學(xué)的復(fù)制和修復(fù)第一頁，共五十四頁，2022年，8月28日第一節(jié)DNA的復(fù)制(DNAreplication)

DNA復(fù)制的幾個原則：1.半保留復(fù)制(Semiconservative)

DNA復(fù)制時，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而成兩股單鏈，各自作為模板，合成新的互補(bǔ)鏈。子代細(xì)胞出現(xiàn)的DNA雙鏈，其中一條單鏈?zhǔn)菑挠H代完整地接受過來，另一條單鏈?zhǔn)切潞铣傻模@種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。1958年，M.Meselson和F.W.Stahl用同位素標(biāo)記和密度梯度離心的方法首次證明了這種復(fù)制機(jī)制。

第二頁，共五十四頁，2022年，8月28日

TheMeselson-StahlexperimentwasdesignedtodistinguishbetweentwoalternativeDNAreplicationmechanisms.第三頁，共五十四頁，2022年，8月28日

1963年，Cairns用放射自顯影的方法，第一次觀察到完整的正在復(fù)制的大腸桿菌的DNA，證明大腸桿菌的DNA是一個環(huán)狀分子，以半保留的方式進(jìn)行復(fù)制。ACB第四頁，共五十四頁，2022年，8月28日DNA的半保留復(fù)制可以說明DNA在代謝上的穩(wěn)定性。經(jīng)過許多代的復(fù)制后，DNA的結(jié)構(gòu)仍然可以保持完整，這與它的遺傳功能是相符的。

2.DNA復(fù)制有固定的起點(diǎn)，而且通常是雙向復(fù)制

原核生物的DNA和質(zhì)粒DNA屬于環(huán)狀雙鏈DNA，具有一個固定的復(fù)制起點(diǎn)，從該起點(diǎn)開始，雙向等速度地復(fù)制。復(fù)制過程中，在電鏡下可以看到一個形如眼睛的結(jié)構(gòu)，稱為復(fù)制眼，它類似于希臘字母θ，所以這種復(fù)制方式又稱為θ復(fù)制。

第五頁，共五十四頁，2022年，8月28日

ReplicationofacircularchromosomeproducesastructureresemblingtheGreeklettertheta(θ),andshowsthatbothstrandsarereplicatedatthesametime.第六頁，共五十四頁，2022年，8月28日

Additionof[3H]thymidineforashortperiodjustbeforethereactionisstoppedallowsadistinctiontobemadebetweenunidirectionalandbidirectionalreplication.第七頁，共五十四頁，2022年，8月28日

真核生物的DNA是線狀雙鏈DNA，有多個復(fù)制起點(diǎn)，在每個復(fù)制起點(diǎn)上雙向、等速度地進(jìn)行復(fù)制。第八頁，共五十四頁，2022年，8月28日

3.DNA復(fù)制的方向?yàn)?’→3’，是半不連續(xù)的子鏈DNA的復(fù)制方向都是5’→3’，所以母鏈的讀鏈方向是3’→5’。(前導(dǎo)鏈)(后續(xù)鏈)(岡崎片段)第九頁，共五十四頁，2022年，8月28日一、DNA的聚合反應(yīng)

從大腸桿菌中提取的DNA聚合酶Ⅰ，能在具備

底物：4種dNTP

模板：一條單鏈DNA

引物：一小段與模板配對的DNA或RNA，具備3′-OH

Mg2+

的條件下，使4種dNTP聚合起來。新加上的dNTP與引物的3′-OH作用，形成3′,5′-磷酸二酯鍵，且所加上的核苷酸要與模板上的堿基互補(bǔ)配對，合成方向是從5′→3′。第十頁，共五十四頁，2022年，8月28日

DNA聚合酶催化DNA鏈的延長DNA聚合酶第十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日

二、與DNA聚合有關(guān)的酶

⒈DNA聚合酶

⑴原核生物DNA聚合酶

DNA聚合酶Ⅰ(PolⅠ)由大腸桿菌的polA基因編碼的一條多肽鏈，分子量為109KD，每個大腸桿菌中約有400個PolⅠ分子，它催化脫氧核苷酸聚合的速度為1000個/分。PolⅠ具有的功能：⑴按5′→3′方向延長核苷酸鏈的功能；⑵3′→5′外切酶的功能；⑶5′→3′外切酶的功能；該外切酶功能的特點(diǎn)是切去的核苷酸是正確配對的，這種功能在DNA的復(fù)制中引物的切除及DNA損傷的修復(fù)中起著重要作用。

第十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日正常的堿基互補(bǔ)配對由于互變異構(gòu)等導(dǎo)致的不正常配對第十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日DNA聚合酶Ⅰ的3→5外切酶的校對作用′′第十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日DNA的5′→3′外切酶功能可以切除一段與模板配對的DNA或RNA鏈，同時又可以合成一段新的DNA單鏈，表現(xiàn)為“切口位移”。第十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日用枯草桿菌蛋白酶將PolⅠ水解成大、小兩個片段，大片段有聚合酶和3′→5′外切酶的功能，又稱為Klenow片段。DNA聚合酶Ⅰ的空間構(gòu)型第十六頁，共五十四頁，2022年，8月28日

DNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)也需要模板、引物、底物和Mg2+，合成方向也是5′→3′,也具有3′→5′外切酶功能，但沒有5′→3′外切酶功能。它只在無PolⅠ和PolⅢ的時候才發(fā)揮聚合酶作用,每個大腸桿菌中有約40個酶分子。

DNA聚合酶Ⅲ(PolⅢ)在大腸桿菌中的量只有PolⅠ的1/20，但活性比PolⅠ高40倍以上，每分鐘能催化105個核苷酸的聚合，是大腸桿菌中真正負(fù)責(zé)合成DNA的聚合酶，由多種亞基組成。第十七頁，共五十四頁，2022年，8月28日

E.coli中三種DNA聚合酶的比較第十八頁，共五十四頁，2022年，8月28日E.coliDNA聚合酶Ⅲ的亞基組成及主要功能第十九頁，共五十四頁，2022年，8月28日E.coliDNA聚合酶Ⅲβ-亞基形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)圍繞著DNA雙鏈。第二十頁，共五十四頁，2022年，8月28日

⑵真核生物的DNA聚合酶

真核生物中發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶有α、β、γ、δ四種。α-DNA聚合酶的活性與DNA合成的活躍程度有時相的相關(guān)，負(fù)責(zé)真核生物DNA中后隨鏈的合成；β-DNA聚合酶存在于細(xì)胞核，最適pH為堿性，有最強(qiáng)的外切酶活性，被認(rèn)為與損傷的修復(fù)有關(guān)。γ-DNA聚合酶存在于線粒體，參與線粒體DNA的復(fù)制。δ-DNA聚合酶是多亞基酶，有3′→5′外切酶活性，負(fù)責(zé)真核生物DNA中前導(dǎo)鏈的合成。第二十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日

復(fù)制的保真性

DNA聚合酶對模板的依賴性，是子鏈與母鏈能準(zhǔn)確配對，使遺傳信息延續(xù)、傳代的保證。要確保DNA復(fù)制的保真性，至少依賴三種機(jī)理：⒈遵守嚴(yán)格的堿基配對規(guī)律；⒉聚合酶在復(fù)制延長中對堿基的選擇作用；⒊復(fù)制中出錯時有及時的校對功能。第二十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日

⒉DNA連接酶(ligase)

因?yàn)镈NA聚合酶不能將3′-OH和5′-PO32-連接起來，所以不能形成閉合、連續(xù)的子鏈。

DNA連接酶是能催化一條DNA鏈的3′-OH和另一條DNA鏈的5′-PO32-之間形成磷酸二酯鍵的酶，但連接的都是堿基互補(bǔ)基礎(chǔ)上的雙鏈中的單鏈缺口，它并沒有連接單獨(dú)存在的DNA單鏈或RNA單鏈的能力，也沒有連接超過兩個堿基以上的缺口的能力。

第二十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日常用的DNA連接酶有兩種：⑴大腸桿菌的DNA連接酶：能催化粘性末端的連接；⑵T4DNA連接酶：既能催化粘接，也能催化平頭連接；

連接反應(yīng)的能量來源：①細(xì)菌的DNA連接酶以NAD作為能量來源；②動物細(xì)胞和噬菌體的DNA連接酶以ATP為能量來源；第二十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日DNA連接酶的作用機(jī)理第二十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日

⒊DNA引物酶(primase）因?yàn)镈NA聚合酶不能起始合成新的DNA鏈，所以需要合成一段引物提供3′-OH。催化RNA引物形成的酶就是RNA引物酶，本質(zhì)上屬于以DNA為模板的RNA聚合酶，但與催化轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶有本質(zhì)的不同：引物酶在模板的起始部位催化互補(bǔ)堿基的聚合，形成10-60個核苷酸長的RNA的引物片段。第二十六頁，共五十四頁，2022年，8月28日

⒋DNA解螺旋酶(helicase)

DNA在復(fù)制之前，須先排除核苷酸之間的氫鍵作用和疏水性基團(tuán)的相互作用，將雙鏈解開，DNA解螺旋酶就是一類通過水解ATP獲得能量，在復(fù)制叉處解開DNA雙鏈的酶。每解開一對雙鍵，要消耗2個ATP的2個高能鍵。

DNA解螺旋酶首先同DNA的單鏈部分結(jié)合，再按復(fù)制叉移動方向向雙鏈部分延伸，DNAhelicase和Rep蛋白(解螺旋酶的一種)協(xié)同作用，前者結(jié)合在滯后鏈的模板上(即在方向5′→3′母鏈上隨復(fù)制叉方向移動)，后者結(jié)合在前導(dǎo)鏈的模板上。

第二十七頁，共五十四頁，2022年，8月28日

⒌DNA單鏈結(jié)合蛋白(DNASSB)

DNA解螺旋酶解開的雙鏈由DNA單鏈結(jié)合蛋白來穩(wěn)定，DNASSB的特性就是能專一性地同DNA分子中已解開的單鏈區(qū)結(jié)合，阻止復(fù)性和DNA被核酸酶降解。SSB同DNA結(jié)合時表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。第二十八頁，共五十四頁，2022年，8月28日

⒍DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ(topisomeraseⅠ)

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ可以將共價閉環(huán)的超螺旋DNA解開成松弛態(tài)的閉合環(huán)狀DNA，反應(yīng)機(jī)理是先切開雙鏈DNA的一條鏈，使鏈的末端螺旋向擰松超螺旋的方向轉(zhuǎn)動，然后再將切口連接起來，所以兼有水解酶和連接酶的功能。每作用一次，使負(fù)超螺旋數(shù)目+1。

第二十九頁，共五十四頁，2022年，8月28日⒎DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(topisomeraseⅡ)

與DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ相反，DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ能在DNA中引入負(fù)超螺旋，作用機(jī)理是在ATP提供能量下，水解切斷DNA的兩條鏈，兩條鏈的斷口同時饒過切口，然后再重新形成磷酸二酯鍵。每作用一次可使超螺旋數(shù)目－2。第三十頁，共五十四頁，2022年，8月28日

三種能催化形成磷酸二酯鍵的酶的比較

提供3′-OH提供5′-P結(jié)果

DNA聚合酶引物或延長中的新鏈游離的dNTP形成(dNMP)n+1DNA連接酶復(fù)制中不連續(xù)的兩條單鏈形成連續(xù)的鏈DNA拓?fù)涿盖袛嗖⒄砗蟮膯捂溁螂p鏈改變拓?fù)錉顟B(tài)第三十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日

三、DNA的復(fù)制過程

E.coli復(fù)制的起始位點(diǎn)(oriC)第三十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日

要開始復(fù)制，至少需要以下的蛋白質(zhì)因子：

DnaA蛋白：識別oriC，在特定部位解開雙鏈

DnaB蛋白：即解螺旋酶

DnaC蛋白：幫助DnaB在起始位點(diǎn)的結(jié)合

HU:類似組蛋白的蛋白質(zhì)，啟動復(fù)制的起始引物酶：合成RNA引物

SSB：結(jié)合單鏈DNADNA拓?fù)洚悩?gòu)酶：釋放DNA解鏈產(chǎn)生的超螺旋1.復(fù)制的起始第三十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日E.中DNA復(fù)制的起始coli在解鏈酶、SSB和拓?fù)涿傅让讣暗鞍踪|(zhì)因子的共同作用下，DNA雙鏈解開成單鏈。第三十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日

⒉復(fù)制的延長延長階段同樣需要解螺旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶解開雙鏈，需要SSB穩(wěn)定DNA單鏈，但前導(dǎo)鏈和滯后鏈的復(fù)制是完全不同的。前導(dǎo)鏈的復(fù)制，可以由5′→3′方向，在引物上連續(xù)進(jìn)行，直至復(fù)制終點(diǎn)。第三十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日在滯后鏈上，要先由引物酶分段合成RNA引物，在各段引物上按5′→3′方向分別形成DNA片段(即岡崎片段)至前一個岡崎片段的前方為止。引物酶和其他蛋白質(zhì)因子共同組成引發(fā)體。第三十六頁，共五十四頁，2022年，8月28日前導(dǎo)鏈和滯后鏈的合成實(shí)際上是由DNA聚合酶Ⅲ二聚體催化同時完成的。第三十七頁，共五十四頁，2022年，8月28日E.coliDNA聚合酶Ⅲ二聚體的作用機(jī)理第三十八頁，共五十四頁，2022年，8月28日

⒊復(fù)制的終止

DNA聚合酶Ⅰ利用其5′→3′核酸外切酶的活性，將岡崎片段的RNA引物水解，產(chǎn)生的空隙由后面的岡崎片段繼續(xù)延伸填補(bǔ)，這個過程也由DNA聚合酶Ⅰ來完成，延長直至前一個片段的5′-P，最后由DNA連接酶將片段之間所剩的小缺口通過形成磷酸二酯鍵連接起來，成為真正連續(xù)的子鏈。第三十九頁，共五十四頁，2022年，8月28日

第二節(jié)DNA的損傷與修復(fù)

DNA的突變和保守是對立統(tǒng)一的自然現(xiàn)象，沒有突變，就沒有今天多種多樣的物種。

㈠突變的分子基礎(chǔ)突變就是DNA分子上堿基的改變，分為自發(fā)突變和誘發(fā)突變。突變的后果有以下四種：①致死性的；②使生物體功能喪失；③只改變基因型而無表現(xiàn)型的改變；④有益的突變。第四十頁，共五十四頁，2022年，8月28日

根據(jù)DNA分子的改變，可把突變分為①點(diǎn)突變DNA分子上一個堿基的變換，又分為轉(zhuǎn)換（同型堿基的相互替換）和顛換（異型堿基的相互替換）；②缺失一個堿基或一段核苷酸鏈從DNA分子上消失；③插入一個原來沒有的堿基或一段原來沒有的核苷酸鏈插入到DNA分子中間；缺失和插入可以引起移碼突變，④倒位DNA鏈內(nèi)部重組，使其中一段方向反置，或大片段的鏈在DNA分子內(nèi)遷移。第四十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日

誘發(fā)突變的原因及突變類型誘變因素突變類型物理因素紫外線照射形成胸腺嘧啶二聚體離子輻射打斷DNA分子的共價鍵化學(xué)因素5-溴尿嘧啶使A-T對最終變成G-C對羥胺使G-C對最終變成A-T對亞硝酸鹽使G-C對最終變成A-T對氮芥類使DNA鏈脫鳥嘌呤第四十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日復(fù)制甲基化的G使DNA發(fā)生G-C→A-T的突變第四十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日

二、損傷的修復(fù)

㈠光修復(fù)

紫外線引起相鄰嘧啶堿基之間形成二聚體。第四十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日光復(fù)活酶修復(fù)嘧啶二聚體第四十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日

㈡切除修