第21章臨床生化檢驗(yàn)方法與試劑盒評(píng)價(jià)

第二十一章

臨床生化檢驗(yàn)方法與試劑盒評(píng)價(jià)第1頁(yè)教學(xué)目標(biāo)與要求

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掌握校準(zhǔn)品的分類(lèi)和正確使用；測(cè)定系統(tǒng)的概念和比對(duì)；試劑盒的性能指標(biāo)和評(píng)價(jià)方法。

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熟悉方法學(xué)性能指標(biāo)和評(píng)價(jià)；量值溯源和量值傳遞的概念；液體雙試劑的優(yōu)點(diǎn)。

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了解試劑盒的分類(lèi)和發(fā)展趨勢(shì)。2第3頁(yè)第3頁(yè)臨床生化檢驗(yàn)方法的性能評(píng)價(jià)臨床生化檢驗(yàn)試劑盒的性能評(píng)價(jià)

臨床生化檢驗(yàn)方法分級(jí)和標(biāo)準(zhǔn)品

主要內(nèi)容3臨床生化檢驗(yàn)方法分級(jí)

一

二

三第一節(jié)臨床生化檢驗(yàn)方法分級(jí)和標(biāo)準(zhǔn)品

臨床生化檢驗(yàn)的參考物質(zhì)和校準(zhǔn)品

量值溯源檢測(cè)系統(tǒng)的比對(duì)

四4

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是指準(zhǔn)確度最高，系統(tǒng)誤差最小，經(jīng)過(guò)詳細(xì)的研究，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生誤差的原因或在某些方面不夠明確的方法。決定性方法參考方法

是指準(zhǔn)確度與精密度已經(jīng)充分證實(shí)的分析方法，干擾因素少，系統(tǒng)誤差與重復(fù)測(cè)定的隨機(jī)誤差相比可以忽略不計(jì)，有適當(dāng)?shù)撵`敏度、特異性及較寬的分析范圍。常規(guī)方法

是指性能指標(biāo)符合臨床或其他目的需要，有足夠的精密度、準(zhǔn)確度、特異性和適當(dāng)?shù)姆治龇秶医?jīng)濟(jì)實(shí)用。

一臨床生化檢驗(yàn)方法分級(jí)5決定性方法（definitivemethod）也稱(chēng)為一級(jí)參考方法（primaryreferencemethod)參考方法（referencemethod）也稱(chēng)為二級(jí)參考方法（secondaryreferencemethod）常規(guī)方法（routinemethod）；推薦方法（recommendedmethod）6表21-1臨床生化檢驗(yàn)項(xiàng)目的決定性方法、參考方法、常規(guī)方法項(xiàng)目決定性方法參考方法

常規(guī)方法鈣ID-MS原子吸收分光光度法鄰甲酚酞絡(luò)合酮法、MTB法氯ID-MS、中子活化法電流滴定法硫氰酸汞法、選擇性電極法鎂ID-MS原子吸收分光光度法MTB法鉀ID-MS、中子活化法火焰光度法離子選擇電極法、火焰光度法鈉中子活化法火焰光度法離子選擇電極法、火焰光度法清蛋白-免疫化學(xué)法溴甲酚綠法總蛋白-凱氏定氮法雙縮脲法肌肝ID-MS離子交換層析法苦味酸法、酶法尿素ID-MS尿素酶法二乙酰一肟法、酶法尿酸ID-MS尿酸酶法（紫外）磷鎢酸比色法膽紅素-重氮反應(yīng)法J-G法、釩酸鹽氧化法葡萄糖ID-MS已糖激酶法葡萄糖氧化酶法膽固醇ID-MSAbell-Kendall法酶法甘酒三脂ID-MS變色酸顯色法酶法7

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`（primaryreferencematerials）也稱(chēng)一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品，與決定性方法平行，用于驗(yàn)證決定性方法、評(píng)價(jià)與校準(zhǔn)參考方法，以及為二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品定值。

原級(jí)參考物質(zhì)次級(jí)參考物質(zhì)

（secondaryreferencematerials）也稱(chēng)二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品，二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品的定值源于一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品和參考方法，主要用于評(píng)價(jià)常規(guī)方法，也可為質(zhì)控物定值。

常規(guī)校準(zhǔn)品

校準(zhǔn)（calibration）指的是對(duì)由儀器、方法和試劑所組成的檢測(cè)系統(tǒng)的校準(zhǔn)過(guò)程。電解質(zhì)、酶類(lèi)、其他生化指標(biāo)應(yīng)合理選擇校準(zhǔn)品二臨床生化檢驗(yàn)的參考物質(zhì)和校準(zhǔn)品

8標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)品質(zhì)控品一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品用高純化學(xué)物質(zhì)（純度>99.98%）直接通過(guò)稱(chēng)重配制的溶液，是唯一值。一般由國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)計(jì)量局出具證書(shū)。二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品某種成分的濃度可用公認(rèn)的參考方法測(cè)定。由參考實(shí)驗(yàn)室或權(quán)威學(xué)術(shù)組織出具證書(shū)，如SRM、BCR、IFCC。標(biāo)準(zhǔn)品(standard）可用做校準(zhǔn)品（calibrater），考慮血清成分復(fù)雜、難以避免基質(zhì)效應(yīng)，建議用與新鮮血清相似的介質(zhì)做校準(zhǔn)品，一般由試劑盒供應(yīng)商提供和賦值。校準(zhǔn)品的量值應(yīng)有溯源性，不同測(cè)定系統(tǒng)賦值不同。質(zhì)控品多是成分相對(duì)穩(wěn)定的混合血清，分為定值和非定值、凍干或液體，添加了防腐劑和保護(hù)劑等。定值往往由試劑盒供應(yīng)商委托幾家實(shí)驗(yàn)室在特定測(cè)定系統(tǒng)上測(cè)得的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。9標(biāo)準(zhǔn)品與校準(zhǔn)品大多數(shù)定量的方法（分光光度法、電化學(xué)、免疫定量）都需要用標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)，即通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)比較來(lái)計(jì)算。校準(zhǔn)是這些方法定量必經(jīng)的過(guò)程。用什么“標(biāo)準(zhǔn)”來(lái)校準(zhǔn)？羅氏公司的C.f.a.s（calibratorforautomationsystem），屬于多項(xiàng)校準(zhǔn)品，因使用方便，很多實(shí)驗(yàn)室都在使用。但前提是“指定的測(cè)定系統(tǒng)”。10圖21-1各級(jí)參考物質(zhì)和校準(zhǔn)品的關(guān)系及其量值傳遞過(guò)程11三量值溯源溯源性(traceability）是指通過(guò)一條具有規(guī)定不確定度（uncertainty）的不間斷的比較鏈，使測(cè)量結(jié)果或測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)的值能夠與規(guī)定的參考標(biāo)準(zhǔn)（通常是國(guó)家或國(guó)際測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)）聯(lián)系起來(lái)的特性，稱(chēng)為溯源性。其不間斷的比較鏈稱(chēng)為溯源鏈。溯源性12測(cè)量不確定度測(cè)量不確定度是指表征合理地賦予被測(cè)之值的分散性。是與測(cè)量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)，可理解為排除系統(tǒng)誤差之外的所有隨機(jī)誤差的合成方差。13圖21-2量值溯源和量值傳遞途徑14四檢測(cè)系統(tǒng)的比對(duì)完成一個(gè)項(xiàng)目檢驗(yàn)所涉及的儀器、試劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、操作程序、質(zhì)量控制、保養(yǎng)計(jì)劃等的組合稱(chēng)為檢測(cè)系統(tǒng)（testingsystem）。常規(guī)檢測(cè)系統(tǒng)有配套檢測(cè)系統(tǒng)和自建檢測(cè)系統(tǒng)。（一）檢測(cè)系統(tǒng)的概念15

.配套檢測(cè)系統(tǒng)

自建檢測(cè)系統(tǒng)

（二）檢測(cè)系統(tǒng)的分類(lèi)整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)涉及的各個(gè)部分完全按照指定廠商要求配套使用。若該系統(tǒng)已經(jīng)國(guó)家法定部門(mén)認(rèn)證,則使用這樣的檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，其結(jié)果具溯源性。實(shí)驗(yàn)室自行建立的檢測(cè)系統(tǒng)，如A制造商的試劑盒、B制造商的校準(zhǔn)品、C制造商分析儀的組合。16①制訂分析質(zhì)量目標(biāo)

②儀器性能評(píng)價(jià)

③確定對(duì)比檢測(cè)系統(tǒng)

內(nèi)容④初步評(píng)價(jià)檢測(cè)系統(tǒng)⑤比對(duì)允許不精密度、允許偏倚和允許總誤差準(zhǔn)確度和精密度

參考系統(tǒng)或公認(rèn)的測(cè)定系統(tǒng)性能指標(biāo)40-100例（二）檢測(cè)系統(tǒng)比對(duì)的實(shí)施步驟可接受性判斷步驟17第18頁(yè)測(cè)定系統(tǒng)方法學(xué)操作程序校準(zhǔn)品儀器試劑配方和來(lái)源測(cè)定系統(tǒng)的關(guān)鍵要素18第19頁(yè)

1

2統(tǒng)一方法：以方法學(xué)評(píng)價(jià)為基礎(chǔ)，提出參考方法或推薦方法。統(tǒng)一試劑的主要成分和測(cè)定條件。實(shí)施機(jī)構(gòu)：國(guó)際臨床化學(xué)學(xué)會(huì)、臨檢中心逐級(jí)溯源：常規(guī)校準(zhǔn)品應(yīng)向二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品、一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)溯源。實(shí)施機(jī)構(gòu)：ISO、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)計(jì)量局、參考實(shí)驗(yàn)室、試劑盒供應(yīng)商、臨床實(shí)驗(yàn)室全球性可比性戰(zhàn)略實(shí)施33保證儀器良好的工作狀態(tài)、嚴(yán)格的操作規(guī)程和質(zhì)量控制、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部測(cè)定系統(tǒng)的比對(duì)、實(shí)驗(yàn)室間的比對(duì)19方法學(xué)的性能指標(biāo)

一

二

三第二節(jié)臨床生化檢驗(yàn)方法的性能評(píng)價(jià)

方法學(xué)性能評(píng)價(jià)的內(nèi)容

方法學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)

臨床生物化學(xué)方法學(xué)性能判斷

四20

可靠性

實(shí)用性

一方法學(xué)性能指標(biāo)準(zhǔn)確度精密度方便性經(jīng)濟(jì)性安全性

簡(jiǎn)單快速可測(cè)范圍21

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`準(zhǔn)確度（accuracy）的傳統(tǒng)定義是指測(cè)定值與“真值”的接近程度。是指一次測(cè)定的結(jié)果與被測(cè)物真值的接近程度。

準(zhǔn)確度正確度

“正確度”（trueness），是指一系列測(cè)定結(jié)果得到的均值與“真值”的接近程度。通常以偏倚（bias）來(lái)表示精密度

精密度（precision）是指在規(guī)定條件下，相互獨(dú)立的檢測(cè)結(jié)果間的一致程度。不精密度（imprecision）通常用標(biāo)準(zhǔn)差（S）和變異系數(shù)（CV%）來(lái)表示22表21-3臨床生化檢驗(yàn)方法的誤差及評(píng)價(jià)方法系統(tǒng)誤差誤差分類(lèi)評(píng)價(jià)試驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)理想結(jié)果比例系統(tǒng)誤差回收試驗(yàn)回收率95-105%恒定系統(tǒng)誤差干擾試驗(yàn)干擾值接近0比例系統(tǒng)誤差方法對(duì)比試驗(yàn)Y=a+bXb接近1.0恒定系統(tǒng)誤差a接近0隨機(jī)誤差重復(fù)性試驗(yàn)（批內(nèi)、批間、日間）、總不精密度CV<3%二方法學(xué)性能評(píng)價(jià)內(nèi)容23回收試驗(yàn)

干擾試驗(yàn)

線(xiàn)性試驗(yàn)

重復(fù)性試驗(yàn)對(duì)比試驗(yàn)檢測(cè)限與檢測(cè)范圍批內(nèi)批間

日內(nèi)日間總不精密度三方法學(xué)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度24（一）重復(fù)性試驗(yàn)1.試驗(yàn)樣品一般選擇2個(gè)，一個(gè)在參考區(qū)間附近，另一個(gè)為異常值2.初步的批內(nèi)精密度評(píng)價(jià)：即一個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定20次，計(jì)算出均值，標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。

用2個(gè)樣品每天測(cè)定2批，批間測(cè)定間隔不得少于2h，每批平行測(cè)定2份，至少共測(cè)定20天，80個(gè)數(shù)據(jù)。每對(duì)結(jié)果間的差（共40個(gè)）代表批內(nèi)差；2批均值之間的差（共20個(gè)）代表批間差；每天4個(gè)結(jié)果的均值（共20個(gè)）代表日間差。每批測(cè)定至少做一個(gè)質(zhì)控。

25（二）回收試驗(yàn)所謂回收即評(píng)定方法正確測(cè)定加入常規(guī)樣品中的純分析物的能力。即在未知濃度的常規(guī)樣品中加入一定量的待測(cè)組分，檢測(cè)加入前后該組分的增加量，實(shí)際增加量與理論加入量的比值就是回收率。目的是測(cè)定比例系統(tǒng)誤差。

26（三）干擾試驗(yàn)干擾是指在測(cè)定某分析物時(shí)，受其他非分析物的影響而導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果增高（正干擾）或降低（負(fù)干擾）。根據(jù)干擾的產(chǎn)生原因分為：基質(zhì)效應(yīng)、非特異反應(yīng)、外部干擾物等。干擾試驗(yàn)的設(shè)計(jì)同回收試驗(yàn)，即將不同濃度的干擾物代替純標(biāo)準(zhǔn)品。一般規(guī)定只對(duì)膽紅素、血紅蛋白、脂類(lèi)做干擾試驗(yàn)。干擾值＝加入干擾物后的測(cè)定值－基礎(chǔ)測(cè)定值

27（四）線(xiàn)性試驗(yàn)線(xiàn)性試驗(yàn)用來(lái)評(píng)價(jià)劑量和反應(yīng)之間的線(xiàn)性關(guān)系，并把呈直線(xiàn)部分確定為線(xiàn)性范圍（linearrange）。線(xiàn)性范圍指檢測(cè)信號(hào)與被測(cè)物濃度呈線(xiàn)性時(shí)的被測(cè)物濃度范圍。

1.樣品濃度線(xiàn)性評(píng)價(jià)至少應(yīng)有5個(gè)不同濃度，可選擇低值和高值樣品各一份，低值樣品和高值樣品分別按體積3：1混勻、等份混勻、1:3混勻，形成5個(gè)不同濃度。2..試驗(yàn)方法將不同濃度的樣品（X），隨機(jī)排列，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定4次（Y），并要求在當(dāng)天完成所有分析。

28（五）對(duì)比試驗(yàn)對(duì)比試驗(yàn)是指分別用兩種方法測(cè)定一組臨床不同濃度和病理情況的樣品，測(cè)定結(jié)果進(jìn)行回歸分析。比較方法應(yīng)選擇參考方法或公認(rèn)的常規(guī)方法，測(cè)定偏差主要來(lái)源于評(píng)價(jià)方法。1.試驗(yàn)樣品應(yīng)收集新鮮的正常和異常的臨床樣品，應(yīng)有足夠?qū)挼臐舛确秶?，各濃度樣品?shù)量應(yīng)有合適的比例。2．樣品測(cè)定樣品數(shù)至少為40個(gè)，每個(gè)樣品用2種方法分別作雙份測(cè)定。每天測(cè)定8個(gè)樣品，雙份測(cè)定時(shí)第一次按順序1，2……7，8，第二次8，7……2，1，共測(cè)試5天。

29（六）檢測(cè)限檢測(cè)低限通常是指能與適當(dāng)?shù)摹翱瞻住弊x數(shù)相區(qū)別的待測(cè)物的最小量。方法是做空白平行試驗(yàn)（一般20次），以蒸餾水調(diào)零，讀取各次吸光度，計(jì)算均值（Ab）和標(biāo)準(zhǔn)差(S)。以Ab+3S表示與“空白”讀數(shù)相區(qū)別的最小吸光度，將其換算成濃度，作為該法的檢測(cè)低限。

臨床實(shí)驗(yàn)室以生物檢測(cè)限更為重要，需采用接近檢測(cè)低限的生物檢測(cè)限樣品來(lái)確定，能更真實(shí)地反映實(shí)際檢測(cè)限水平樣品測(cè)定的不確定度。

30系統(tǒng)誤差誤差分類(lèi)評(píng)價(jià)試驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)理想結(jié)果比例系統(tǒng)誤差回收試驗(yàn)Ea<1/2TEa恒定系統(tǒng)誤差干擾試驗(yàn)干擾值<1/2TEa比例系統(tǒng)誤差方法對(duì)比試驗(yàn)Y=a+bXXc-Yc<±1/2TEa隨機(jī)誤差重復(fù)性試驗(yàn)（批內(nèi)、批間、日間）、總不精密度總隨機(jī)誤差<1/3TEa四方法學(xué)性能判斷31臨床生化試劑盒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

一

二

三第三節(jié)臨床生化檢驗(yàn)試劑盒的性能評(píng)價(jià)

臨床生化檢驗(yàn)試劑盒的分類(lèi)

臨床生化試劑盒的性能指標(biāo)及評(píng)價(jià)

臨床生化試劑盒的發(fā)展趨勢(shì)

四32體外診斷試劑體外診斷試劑（invitrodiagnosisregengts）用于完成一個(gè)特定體外診斷檢驗(yàn)，而包裝在一起的一組組分。試劑盒組分可包括抗體、酶、緩沖液、稀釋液、校準(zhǔn)物、控制物或其它物品和材料。

醫(yī)療器械是指：?jiǎn)为?dú)或者組合使用于人體的儀器、設(shè)備、器具、材料或者其他物品。其使用目的是：疾病的預(yù)防、診斷、治療、監(jiān)護(hù)。33

一臨床生化試劑盒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)《臨床化學(xué)體外診斷試劑（盒）通用技術(shù)要求》2006《臨床化學(xué)體外診斷試劑(盒)產(chǎn)品技術(shù)審評(píng)規(guī)范》201134

單液體型

液體雙試劑

二臨床生化試劑盒的分類(lèi)單液體型特別適用于半自動(dòng)生化分析儀和小型自動(dòng)生化分析儀。穩(wěn)定性較差1.穩(wěn)定性能好2.可消除樣品自身空白3.提高抗干擾能力4．預(yù)反應(yīng)多項(xiàng)同測(cè)組合試劑濃縮試劑

351.試劑空白吸光度

2.試劑空白變化速率

3.分析靈敏度4.線(xiàn)性范圍5.重復(fù)性7.穩(wěn)定性

8.臨床試驗(yàn)

三試劑盒性能指標(biāo)和評(píng)價(jià)試劑盒6.準(zhǔn)確度36（一）試劑空白吸光度用蒸餾水做空白，用指定的空白液加入試劑作為樣品測(cè)試，在測(cè)試主波長(zhǎng)下，記錄測(cè)試啟動(dòng)時(shí)的吸光度（A1）和約5分鐘后的吸光度（A2），A2測(cè)試結(jié)果即為試劑空白吸光度測(cè)定值。是判定試劑質(zhì)量的一個(gè)有效指標(biāo)1.雙縮脲法測(cè)定總蛋白2.BCG法測(cè)定清蛋白3.改良賴(lài)氏法測(cè)定ALT4.NADH底物5.色素原底物

37（二）試劑空白變化速率對(duì)于速率法試劑盒，用指定的空白液加入試劑作為樣品測(cè)試時(shí)，在測(cè)試主波長(zhǎng)下，記錄測(cè)試啟動(dòng)時(shí)的吸光度（A1）和約5分鐘(T)后的吸光度（A2），計(jì)算試劑空白吸光度變化率（A/min）。測(cè)定試劑空白吸光度變化（ΔA/min），用來(lái)檢查試劑在工作狀態(tài)下的穩(wěn)定性。但事實(shí)上，試劑空白吸光度變化速率無(wú)法反映試劑盒的穩(wěn)定性，試劑空白吸光度變化速率主要反映干擾程度和儀器的穩(wěn)定性。

38（三）分析靈敏度用吸光度差值（ΔA）或吸光度變化（ΔA/min）來(lái)表示單位濃度的被測(cè)物反應(yīng)所引起的信號(hào)變化，其含義類(lèi)似摩爾消光系數(shù)。

分析靈敏度不是越高越好，以適合待測(cè)物檢測(cè)范圍為原則。分析靈敏度一般用于批間比較，較能反映制造商的配方、原料的一致性。

39（四）線(xiàn)性范圍取高濃度樣品和低濃度樣品按不同比例混合成5個(gè)濃度做線(xiàn)性試驗(yàn)。

試劑（盒）的線(xiàn)性范圍越寬，臨床復(fù)測(cè)幾率越小，但與樣品/試劑比例成反比

40（五）重復(fù)性1.批內(nèi)重復(fù)性在重復(fù)性條件下，用高、中、低三個(gè)水平濃度（高、低濃度應(yīng)超過(guò)參考區(qū)間20%～30%，中濃度水平在參考區(qū)間之內(nèi)）的控制血清或新鮮人血清測(cè)試試劑，重復(fù)測(cè)試至少10次。2.批間重復(fù)性用質(zhì)量控制血清測(cè)試3×3（3個(gè)批號(hào)，每個(gè)批號(hào)取3瓶）批間差，較能反映制造商的配方、原料的一致性。干粉或凍干試劑還需測(cè)定批內(nèi)瓶間差，測(cè)定同一批號(hào)的試劑20瓶，用變異系數(shù)（CV）來(lái)表示。

41（六）準(zhǔn)確度1.相對(duì)偏差直接用試劑盒測(cè)定參考物質(zhì)（平行3次），評(píng)價(jià)測(cè)定均值與靶值的偏離程度。也可用由參考方法定值的高、中、低三個(gè)濃度的人混合血清，用試劑盒平行測(cè)定3次，計(jì)算均值與定值的相對(duì)偏差。

2.比對(duì)試驗(yàn)既無(wú)參考物質(zhì)、參考血清，也無(wú)標(biāo)準(zhǔn)品，