血紅蛋白的提取和分離(上課用)介紹講課講稿

血紅蛋白的提取和分離(上課用)介紹1.分離生物大分子的基本思路：

選用一定的物理或化學(xué)的方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。2.蛋白質(zhì)分離和提取的原理：

根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等等，可以用來分離不同種類的蛋白質(zhì)。基礎(chǔ)知識(shí)基礎(chǔ)知識(shí)（一）凝膠色譜法（分配色譜法）2.凝膠：

大多數(shù)凝膠是由多糖類化合物（如葡聚糖或瓊脂糖）構(gòu)成的多孔小球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道。

根據(jù)被分離的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，來進(jìn)行分離。1.概念：3.凝膠色譜法的原理分子量大小直徑大小大于凝膠顆?？障吨睆?，被阻擋在顆粒的外面小于凝膠顆?？障吨睆?，可以進(jìn)入顆粒內(nèi)部運(yùn)動(dòng)方式垂直向下移動(dòng)垂直向下移動(dòng)，無規(guī)則擴(kuò)散進(jìn)入顆粒內(nèi)部運(yùn)動(dòng)速度較快較慢運(yùn)動(dòng)路徑較短較長(zhǎng)洗脫次序先從凝膠柱洗脫出來后從凝膠柱洗脫出來一、基礎(chǔ)知識(shí)---蛋白質(zhì)分離和提取的原理4.具體過程凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)過程的動(dòng)畫演示

用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時(shí)，分子量大的蛋白質(zhì)A．路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢B．路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較快C．路程較短，移動(dòng)速度較慢D．路程較短，移動(dòng)速度較快D

（二）緩沖溶液

1.概念:在一定的范圍內(nèi)，凡是能夠抵制外加少量強(qiáng)酸或強(qiáng)堿的影響使原來溶液PH值基本保持不變的混合溶液。

能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液PH值的影響，維持PH基本不變。2.作用:3.緩沖溶液的配制:通常由1－2種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PH范圍內(nèi)使用的緩沖液。

4.提問：在本課題中使用的緩沖液是:__________,其目的是:磷酸緩沖液利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察(紅色)和科學(xué)研究(活性)思考：說出人體血液中緩沖液

NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3（三）電泳：1.概念：帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過程。2.原理：

電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。3.類型:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙稀酰胺凝膠電泳SDS——聚丙稀酰胺凝膠電泳(十二烷基磺酸鈉)

蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：（1）樣品處理：包括洗滌紅細(xì)胞；血紅蛋白稀釋；離心等操作收集到的血紅蛋白溶液。（2）粗分離：透析除去分子較小的雜質(zhì)。（3）純化：通過凝膠色譜法將分子量較大的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去。（4）純度鑒定：通過聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。

二、實(shí)驗(yàn)操作樣品處理粗分離純化純度鑒定血液組成成分

1.洗滌紅細(xì)胞

2.釋放血紅蛋白

3.分離血紅蛋白

4.透析血紅蛋白

二、實(shí)驗(yàn)操作血液血漿水分其他物質(zhì)：血漿蛋白、無機(jī)鹽、磷脂、葡萄糖等血細(xì)胞白細(xì)胞血小板紅細(xì)胞（最多）血紅蛋白（90％）兩個(gè)α－肽鏈兩個(gè)β一肽鏈四個(gè)亞鐵紅素基團(tuán)2.血液有哪些成分？1.用雞的紅細(xì)胞提取DNA，用哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什么？雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有DNA，便于進(jìn)行DNA的提??；人的紅細(xì)胞無細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，血紅蛋白含量豐富，便于提取血紅蛋白。血紅蛋白知識(shí)回顧血紅蛋白兩個(gè)α－肽鏈兩個(gè)β一肽鏈四個(gè)亞鐵紅素基團(tuán)每個(gè)肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。血紅蛋白的特點(diǎn)：返回

二、實(shí)驗(yàn)操作1、紅細(xì)胞的洗滌閱讀思考：洗滌的目的是什么？（P69：操作提示）洗滌過程：血液100mL低速離心2min紅細(xì)胞血漿紅細(xì)胞攪拌10min重復(fù)洗滌3次，直至上清液沒有黃色3g檸檬酸鈉吸出血漿5倍體積生理鹽水初次離心后的結(jié)果3次洗滌后的結(jié)果返回2、血紅蛋白的釋放

二、實(shí)驗(yàn)操作閱讀思考：釋放血紅蛋白過程中，在洗滌好的紅細(xì)胞加入了哪些物質(zhì)？為了加速釋放過程，采取了什么措施？目的分析：①蒸餾水的作用是______________________________。②加入甲苯的作用是____________________________。③充分?jǐn)嚢璧哪康氖莀___________________________。使紅細(xì)胞大量吸水脹裂溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜加速紅細(xì)胞的破裂磁力攪拌器返回3、分離血紅蛋白溶液①過程：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10min。②試管中溶液層次：第1層（最上層）：甲苯層（無色透明）；第2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色薄層固體）；第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）；第4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）。③分離：用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。紅細(xì)胞混合液高速離心10min濾紙過濾燒杯離心管分離過程甲苯層（無色透明）白色薄層固體紅色透明液體雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）試管中溶液層次返回

記住樣品處理中的血紅蛋白溶液離心后分層順序自上而下是：有機(jī)溶劑-----脂類物質(zhì)-----血紅蛋白溶液------紅細(xì)胞破碎物沉淀4、透析

①過程：取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/l的磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12小時(shí)。②透析目的：除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)。

二、實(shí)驗(yàn)操作原理：透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而大分子保留在袋內(nèi)。20mmol/L磷酸緩沖液1mL1mL透析過程動(dòng)畫演示利用透析袋透析返回純化－－凝膠色譜操作1.凝膠色譜柱的制作2.凝膠色譜柱的裝填教材圖5－193.樣品的加入和洗脫二、實(shí)驗(yàn)操作凝膠色譜操作:1、凝膠色譜柱的制作

①取長(zhǎng)40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。注意事項(xiàng)：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。③頂塞的制作：打孔→安裝玻璃管。④組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。⑤安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。2、凝膠色譜柱的裝填①凝膠的選擇：A、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。B、代表意義：“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍。75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.5克。②凝膠的前處理：配置凝膠懸浮液：計(jì)算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。③凝膠色譜柱的裝填方法：A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。2、裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在：因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。裝配好的凝膠柱

④洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時(shí)。注意：1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。2、凝膠色譜柱的裝填50cm高3、樣品加入與洗脫

①調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。

②滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。

③樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。

④洗脫：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進(jìn)行洗脫。⑤收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)，說明色譜柱制作成功）⑥注意：正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。3.樣品的加入和洗脫（3）樣品加入與洗脫注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。收集得到的純化后的蛋白注意事項(xiàng)1.紅細(xì)胞的洗滌：

洗滌次數(shù)不能過少；低速、短時(shí)離心。2.凝膠的預(yù)處理：

沸水浴法時(shí)間短，還能除去微生物和氣泡3.色譜柱的裝填：裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無氣泡；洗脫液不能斷流。4.色譜柱成功標(biāo)志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng)。思考下面的問題：讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，維持結(jié)構(gòu)和功能。

1、在血紅蛋白的整個(gè)過程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么？

2、與其他真核細(xì)胞相比，紅細(xì)胞有什么特點(diǎn)？這一特點(diǎn)對(duì)你進(jìn)行蛋白質(zhì)得分離有什么意義？

血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過觀察顏色來判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。3、你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎？

血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即:樣品的處理；再經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；然后通過凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白除去，即:樣品的純化；最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。

觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見教科書圖5-18），如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評(píng)價(jià)

1、你是否完成了對(duì)血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？

由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍(lán)色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動(dòng)的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時(shí)要重新裝柱。

如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。3、你能觀察到蛋白質(zhì)的分離過程中，紅色區(qū)帶的移動(dòng)嗎？請(qǐng)描述紅色區(qū)帶的移動(dòng)情況，并據(jù)此判斷分離效果？三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評(píng)價(jià)總結(jié)以下幾個(gè)問題1.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的的原理是怎樣的?2.什么是緩沖溶液?它的作用是什么?3.電泳的作用及其原理是什么?4.你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎?5.與其他真核細(xì)胞相比,紅細(xì)胞有什么特點(diǎn)?這一特點(diǎn)對(duì)你進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離有什么意義?血紅蛋白的取和分