第十四章免疫學(xué)檢測技術(shù)

第十四章免疫學(xué)檢測技術(shù)主要內(nèi)容一、Ag或Ab檢測二、細胞免疫檢測三、細胞因子檢測一、Ag或Ab檢測抗原-抗體反應(yīng)：指抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)、外發(fā)生高度特異性結(jié)合反應(yīng)。由于實驗所用的抗體存在于血清中，故又稱血清學(xué)反應(yīng)（serologicalreaction)應(yīng)用：用已知抗原檢測未知抗體；用已知抗體檢測未知抗原：定性或定量檢測體內(nèi)各種分子；用已知抗體檢測半抗原物質(zhì)。1.特異性和交叉反應(yīng)

特異性：一種抗原通常僅能與由它刺激所產(chǎn)生的抗體結(jié)合。分子基礎(chǔ)：抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間空間構(gòu)型的互補性。（一）抗原-抗體反應(yīng)的特點交叉反應(yīng)（crossreaction）性：若兩種抗原分子有一個或數(shù)個相同（或相似）的決定基，則針對一種抗原的抗血清可與另一種抗原發(fā)生反應(yīng)。結(jié)合價：天然抗原分子表面一般含多種抗原決定基，可與多個抗體分子結(jié)合，為多價。單體形式的抗體分子有兩個Fab段，能結(jié)合兩個相同的抗原決定基，為兩價。

2.比例性比例合適：若抗原、抗體的數(shù)量比例合適，抗體分子的兩個Fab段分別與兩個抗原決定基結(jié)合，相互交叉連接成網(wǎng)格狀復(fù)合體，則反應(yīng)體系中基本不存在游離的抗原或抗體，此時形成肉眼可見的反應(yīng)物（沉淀物或凝集物）。因此，確定反應(yīng)體系中抗原、抗體的最適比例十分重要。前帶現(xiàn)象（prozone）和后帶現(xiàn)象(postzone)

Ab過剩和Ag過?？乖涂贵w結(jié)合是否呈現(xiàn)可見的反應(yīng)現(xiàn)象，與兩者的濃度和比例密切相關(guān)前帶現(xiàn)象（prozone）和后帶現(xiàn)象(postzone)Ab過剩和Ag過剩網(wǎng)格學(xué)說（latticetheory）抗體過?？乖^?？贵w抗體比例合適抗原抗體抗原-抗體反應(yīng)為分子表面的非共價結(jié)合，結(jié)合雖穩(wěn)定但可逆。在一定條件下（如低pH、高濃度鹽、凍融等），抗原-抗體復(fù)合物可被解離。解離后的抗原和抗體仍保持原有理化特性和生物學(xué)活性。根據(jù)此特點，可借助親和層析法純化抗原或抗體。3.可逆性4.階段性抗原抗體反應(yīng)可分為兩個階段

特異性結(jié)合階段：反應(yīng)快，不可見。

可見的反應(yīng)階段：反應(yīng)慢，出現(xiàn)凝集、沉淀和細胞溶解等現(xiàn)象。

1.電解質(zhì)

抗原和抗體有對應(yīng)的極性基團，能相互吸附并由親水性變?yōu)槭杷?。電解質(zhì)的存在使抗原-抗體復(fù)合物失去電荷而凝聚，出現(xiàn)可見反應(yīng)，故免疫學(xué)試驗中多用生理鹽水稀釋抗原或抗體。（二）、抗原-抗體反應(yīng)的影響因素2.酸堿度抗原抗體反應(yīng)的最適pH是6-8。3.溫度最適溫度為37℃。有些例外，如冷凝集素在4℃左右與紅細胞結(jié)合最好，20℃以上反而解離。

4.抗原和抗體的性質(zhì)抗體的特異性和親和力是決定抗原-抗體反應(yīng)的關(guān)鍵因素。此外，抗原理化性質(zhì)、抗原決定基多寡和種類等均可影響抗原-抗體反應(yīng)。

抗體分子上一個抗原結(jié)合點與對應(yīng)的抗原決定基之間的結(jié)合能力親和力(affinity)

根據(jù)抗原的性質(zhì)、結(jié)合反應(yīng)的現(xiàn)象、參與反應(yīng)的成分等因素分類：

1.凝集反應(yīng)

2.沉淀反應(yīng)

3.補體參加的反應(yīng)

4.中和反應(yīng)

5.免疫標記技術(shù)（三）、Ag-Ab反應(yīng)的基本檢測方法

反應(yīng)類型實驗技術(shù)非標記凝集反應(yīng)直接凝集試驗、間接凝集試驗、間接抑制凝集試驗、協(xié)同凝集試驗沉淀反應(yīng)液相內(nèi)凝集試驗、凝膠內(nèi)凝集試驗補體參與的反應(yīng)補體溶血試驗、補體結(jié)合試驗中和反應(yīng)病毒中和試驗、毒素中和試驗標記標記免疫反應(yīng)熒光免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù)金免疫技術(shù)顆粒性抗原（細菌或細胞等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下，出現(xiàn)肉眼可見的凝集物，稱為凝集反應(yīng)(agglutination)

。用于凝集反應(yīng)中的抗原稱凝集原(agglutinogen)。用于凝集反應(yīng)中的抗體稱凝集素（agglutinin)。

凝集反應(yīng)（AgglutinationTests）1．直接凝集（directagglutination)

：

細菌或紅細胞與相應(yīng)抗體直接反應(yīng)，可出現(xiàn)細菌或紅細胞凝集現(xiàn)象。2．間接凝集（indirectorpassiveagglutination)：檢測針對可溶性Ag的Ab3．間接凝集抑制試驗

(directagglutinationinhibitiontest)4.協(xié)同凝集試驗（co-agglutinationtest）妊娠免疫診斷試驗

孕婦尿中，絨毛膜促性腺激素（HCG）含量明顯增高。（HCG是可溶性抗原）反之，非孕婦尿中HCG含量甚微，不足以消耗掉抗HCG抗體。Definition:可溶性抗原（血清蛋白、外毒素、細菌濾液等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下，形成出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物的現(xiàn)象稱為沉淀反應(yīng)。沉淀反應(yīng)（PrecipitationTests）

用于沉淀反應(yīng)中的抗原稱沉淀原(precipitonogen)。用于沉淀反應(yīng)中的抗體稱沉淀素（precipitin)。

大多沉淀反應(yīng)多用半固體瓊脂凝膠作為介質(zhì)進行瓊脂擴散或免疫擴散，即可溶性抗原與抗體在凝膠中擴散，在比例合適處相遇即形成可見的白色沉淀。1．單向免疫擴散(singleimmunodiffusion)2．雙向免疫擴散(doubleimmunodiffusion)3．免疫電泳(immunoelectrophoresis)4．免疫比濁(immunonephelometry)沉淀反應(yīng)單向免疫擴散

(SingleImmunodiffusion)是將一定量已知抗體混于瓊脂凝膠中制瓊脂板，在適當位置打孔后將抗原加入孔中擴散?？乖跀U散過程中與凝膠中的抗體相遇，形成以抗原孔為中心的沉淀環(huán)，環(huán)的直徑與抗原含量成正比相關(guān)。本法常用于測定血清IgG、IgM、IgA

和C3等的含量。含抗體的凝膠沉淀環(huán)雙向免疫擴散

（DoubleImmunodiffusion)是將抗原與抗體分別加入瓊脂凝膠的小孔中，二者自由向周圍擴散并相遇，在比例合適處形成沉淀線。如果反應(yīng)體系中含兩種以上的抗原抗體系統(tǒng)，則小孔間可出現(xiàn)兩條以上的沉淀線。本法常用于抗原或抗體的定性、組成和兩種抗原相關(guān)性分析的檢測。免疫電泳

（Immunoelectrophoresis)

免疫電泳技術(shù)是電泳分析與沉淀反應(yīng)的結(jié)合產(chǎn)物。兩大優(yōu)點：一是加快了沉淀反應(yīng)的速度，二是將某些蛋白組分利用其帶電荷的不同而將其分開，再分別與抗體反應(yīng)，以此作更細微的分析。免疫電泳包括:血清免疫電泳、對流免疫電泳、火箭電泳、免疫印跡等免疫電泳

（Immunoelectrophoresis)是先將待側(cè)血清標本作瓊脂凝膠電泳，血清中各蛋白組分被分成不同的區(qū)帶，然后與電泳方向平行挖一小槽，加入相應(yīng)的抗血清，把分成區(qū)帶的蛋白抗原成分作雙向免疫擴散，在各區(qū)帶相應(yīng)的位置形成沉淀弧。該法常用于血清蛋白種類分析，以觀察Ig的異常增多或缺失。免疫電泳原理圖解火箭電泳（RocketElectrophoresis)

火箭電泳也稱單向電泳擴散免疫沉淀試驗，是把單向免疫擴散同電泳結(jié)合在一起的方法?？乖诤卸靠贵w的瓊脂中泳動，兩者比例適宜時，在較短時間內(nèi)生成錐形的沉淀峰。在一定濃度范圍內(nèi)，沉淀峰的高度與抗原含量成正比。此法的特點是需時較短，故可用于快速沉淀標本中抗原的含量。火箭電泳示意圖沉淀線的高度與抗原量成正比補體結(jié)合試驗（ComplementFixationtest,CFT)

敏感性和特異性均較高，但該試驗影響因素較多，現(xiàn)在已有被其它新方法取代的趨勢。補體結(jié)合試驗(complementfixationtest，CFT)

將免疫溶血作為指示系統(tǒng)，用以檢測另一反應(yīng)系統(tǒng)中抗原或抗體的傳統(tǒng)方法。試驗原理作用原理：利用補體的溶細胞作用進行各種物理狀態(tài)的抗原抗體測定5種成分，3個系統(tǒng)反應(yīng)系統(tǒng)（溶菌系統(tǒng)）：已知抗原（或抗體）與待測抗體（或抗原）補體系統(tǒng)：指示系統(tǒng)（溶血系統(tǒng)）：SRBC與相應(yīng)溶血素。試驗時常將其預(yù)先結(jié)合，成為致敏綿羊紅細胞（sensitizedsheepredbloodcell,SRBCS）。溶菌系統(tǒng)反應(yīng)分兩步進行

第一步:反應(yīng)系統(tǒng)與補體的作用

第二步:指示系統(tǒng)利用剩余補體的反應(yīng)不溶血為補體結(jié)合試驗陽性，而溶血為試驗陰性已知抗原加入血清（檢測抗體）加入標準量補體加入包被抗體的紅細胞檢測紅細胞溶解情況AgYYPatient’sserum

YYYYYYYYAbNoAbAg用熒光素、酶、放射性核素或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等標記抗體或抗原，進行抗原-抗體反應(yīng)的檢測，是目前應(yīng)用最為廣泛的免疫學(xué)檢測技術(shù)。標記物與抗體或抗原連接后并不改變抗原抗體的免疫特性，具有靈敏度高、快速、可定性、定量、定位等優(yōu)點。免疫標記技術(shù)（Immunolabellingtechnique）

用熒光素與抗體連接成熒光抗體，再與待檢標本中抗原反應(yīng)，置熒光顯微鏡下觀察，抗原-抗體復(fù)合物散發(fā)熒光，借此對抗原進行定性或定位。

1．免疫熒光法(immunofluorescence,IF)（1）直接熒光法：熒光素直接標記抗體，對標本進行檢測。該法優(yōu)點是特異性高，缺點是檢查任一抗原均須制備相應(yīng)熒光抗體。（2）間接熒光法：用一抗與標本中抗原結(jié)合，再用熒光素標記的二抗進行檢測。該法優(yōu)點是敏感度比直接法高，制備一種熒光素標記的二抗即可用于多種抗原的檢測,但非特異性反應(yīng)亦增強。免疫熒光法分類免疫熒光法圖示

此法將抗原-抗體反應(yīng)的特異性與酶催化作用的高效性相結(jié)合，借助酶作用于底物的顯色反應(yīng)判定結(jié)果。應(yīng)用酶標測定儀測定光密度（OD）值可反映抗原含量，靈敏度達ng/ml甚至pg/ml水平。常見的標記物為：辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）

２．酶免疫測定(enzymeimmunoassay,EIA)常用的方法如下：（1）酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)（2）免疫細胞或組織化學(xué)（immunocytochemistryorimmunohistochemistry,ICCorIHC)1）ELISA是酶免疫測定中應(yīng)用最廣的技術(shù)，用于測定可溶性抗原或抗體。優(yōu)點：靈敏度高、操作簡便、穩(wěn)定性強，可自動化檢測，從而被廣泛用于檢測多種病原體抗原或抗體、血液及其他體液中微量蛋白成分、細胞因子等。雙抗體夾心法：用于檢測特異性抗原。該試驗所用的包被抗體與酶標抗體應(yīng)分別針對不同抗原決定基，或其中之一用多克隆抗體，且相互間應(yīng)無交叉反應(yīng)。間接法：用于檢測特異性抗體。用已知抗原包被固相，加入待檢血清標本，再加酶標記的二抗，加底物觀察顯色反應(yīng)。ELISA分類應(yīng)用酶標記的抗體與組織或細胞抗原發(fā)生反應(yīng)，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，對組織或細胞表面抗原進行定性、定量、定位。2）免疫細胞或免疫組化技術(shù)ICCIHC乃用放射性核素標記抗原或抗體進行免疫學(xué)檢測。該法兼有放射性核素的高靈敏度和抗原-抗體反應(yīng)的特異性，檢測靈敏度達pg水平。常用于標記的放射性核素為125I和131I，分為液相和固相兩種方法。該法常用于測定微量物質(zhì)，如胰島素、生長激素、甲狀腺素、孕酮等激素，嗎啡、地高辛、IgE等。3．放射免疫測定法(radioimmunoassay,RIA)４．化學(xué)發(fā)光免疫分析將發(fā)光物質(zhì)（如吖啶酯、魯米諾等）標記抗原或抗體，發(fā)光物質(zhì)在反應(yīng)劑（如過氧化陰離子）激發(fā)下發(fā)射光子，通過自動發(fā)光分析儀測定光子產(chǎn)量，可反映待檢樣品中抗體或抗原含量。該法靈敏度高，常用于檢測血清超微量活性物質(zhì)（甲狀腺素等激素）。

該法又稱Western印跡法，其結(jié)合凝膠電泳與固相免疫技術(shù)，將借助電泳所區(qū)分的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至固相載體，再應(yīng)用酶免疫、放射免疫等技術(shù)進行檢測。該法能對分子大小不同的蛋白質(zhì)進行分離并確定其分子量，常用于檢測多種病毒抗體或抗原。５．免疫印跡法(immunoblotting)免疫印跡法示意圖原理：病毒、細菌、毒素與相應(yīng)抗體特異結(jié)合后，喪失生物活性。用途：1.用已知血清鑒定病毒、細菌、毒素、獸藥殘留等。2.用已知病毒、細菌檢測血清抗體——測定抗體免疫血清效價（中和價）。中和試驗（病毒、毒素）二、免疫細胞的檢測

檢測各群體淋巴細胞的數(shù)量與功能是觀察機體免疫狀態(tài)的重要手段。外周血是病人主要的檢測標本，但僅代表再循環(huán)的淋巴細胞。實驗動物還可取胸腺、脾、淋巴結(jié)等作為標本進行檢查。（一）淋巴細胞及亞群的分離外周血單個核細胞(PBMC)的分離：葡聚糖－泛影葡胺（即淋巴細胞分離液）密度梯度離心法包含淋巴細胞、單核細胞樹突狀細胞和其它少量細胞（造血干細胞等）。

密度梯度離心法原理：外周血各種血細胞的密度不盡相同，利用淋巴細胞分層液（Ficoll）作密度梯度離心，使一定比重的細胞群按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細胞加以分離。為此利用一種密度介于1.075～1.092之間而近于等滲的溶液（分層液）做密度梯度離心，使一定密度的細胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細胞加以分離。常用的分層液有Ficoll和Percoll兩種。(1)抗凝靜脈血(2)加等量NS(4)密度梯度離心血漿分離液RBCPBMCPMN(3)混勻后，緩慢加于分離液上外周血紅細胞粒細胞單個核細胞血小板淋巴細胞單核細胞1.0931.030~1.0351.075~1.090Ficoll：1.077±0.001

1.092密度分類（PBMC）淋巴細胞亞群的分離

淋巴細胞為不均一的群體，可借助其表面標志及功能差異而分為不同的群和亞群。

1．尼龍棉分離法

2．E花環(huán)分離法

3．洗淘法

4．流式細胞術(shù)(flowcytometry，F(xiàn)CM)

5．磁珠分離技術(shù)(1)E花環(huán)分離法原理：人類T細胞表面上有能與綿羊紅細胞相結(jié)合的受體（E受體，CD2）,能與經(jīng)溴化二氨基異硫基異硫脲氰化物（AET）處理的綿羊紅細胞結(jié)合，形成穩(wěn)定的、細胞體積和比重較大的E花環(huán)。方法：淋巴細胞+SRBC懸液→加入分層液→T細胞形成E花環(huán)而沉于管底→懸液中為B細胞。E花環(huán)E花環(huán)實驗（2）尼龍纖維分離法原理：B細胞在37℃時易粘附于尼龍棉（聚酰胺）纖維上，而T細胞不具此能力。方法：淋巴細胞→通過聚酰胺纖維管→洗脫下來的是T細胞。（3）流式細胞術(shù)又叫熒光激活細胞分離儀(nuorescenceactivatedcellsorter,FACS)法

原理：

細胞經(jīng)熒光染色后，通過高速流動系統(tǒng)，細胞排成單行，逐個流經(jīng)檢測區(qū)進行測定。當細胞從流動室噴嘴處流出時，超聲振蕩動液流，使液流斷裂成一連串的均勻小滴(4000個/s)，每小滴內(nèi)最多含一個細胞，細胞經(jīng)激光束照射產(chǎn)生熒光和散射光，由光電倍增管接收，轉(zhuǎn)換成脈沖信號，數(shù)據(jù)經(jīng)電腦處理，分辨細胞的類型。

激發(fā)系統(tǒng)細胞分選系統(tǒng)熒光激活細胞分離儀分離法

檢測與訊號處理系統(tǒng)細胞流動系統(tǒng)及氣壓流速控制系統(tǒng)流式細胞分析儀通過流式細胞儀檢測：檢測T細胞總數(shù):抗CD3檢測CD4+/CD8+T細胞:抗CD4/CD8檢測B細胞:抗SmIg（4）磁珠分離術(shù)

磁珠分離術(shù)是將磁性材料顆粒表面進行外理，微球的核心為小金屬顆粒，核心處包裹高分子材料（聚苯乙烯），可結(jié)合不同的生物大分子物質(zhì)（抗原、抗體、核酸等），若微球表面包被有免疫物質(zhì)則稱為免疫磁珠，其兼有免疫配基的性質(zhì)和磁響應(yīng)性質(zhì)，即在磁場中顯示磁性，移出磁場時磁性消除。

目前商品出售的磁珠有直徑為1～5um等不同的規(guī)格，表面活性基團有氨基（－NH2）、羧基（－COOH）和羥基（－OH）等。

包被的免疫物質(zhì)有：一抗、二抗等。方法：

將包被有關(guān)抗體的磁珠與待分離細胞充分作用，這樣借助于抗體磁珠，將與相應(yīng)的細胞結(jié)合成：細胞－抗體－磁珠復(fù)合物，該細胞在磁場中運動與其他細胞產(chǎn)生明顯差別。

如采用層析的方法，將層析柱放于強磁場中，與磁珠結(jié)合的細胞運動將受限，而未與磁珠結(jié)合的細胞將先被洗脫下出來。

再將該柱移出磁場，與磁珠結(jié)合的細胞也將被洗脫下來，達到分離目的。單克隆抗體CD3羊抗鼠修飾磁球Biomag抗CD3磁球磁球結(jié)合T細胞加入B和T細胞中負向選擇正向選擇磁架進行分離直接法對細胞進行分類間接法對T細胞進行分離免疫磁珠法細胞分選過程免疫磁珠細胞分選裝置（5）親和板結(jié)合分離法原理：各種淋巴細胞亞群具有不同的抗性。①分離CD4+或CD8+細胞，可用抗CD4或CD8單克隆抗體吸附。②分離B細胞用抗Ig抗體。③分離有C3受體的細胞用活化的C3包被。將相應(yīng)抗體結(jié)合于塑料平板上抗原陽性的細胞與相應(yīng)抗體結(jié)合二、免疫細胞功能的測定

（一）T細胞功能測定：1.細胞增殖(轉(zhuǎn)化)試驗：

可分為非特異性絲裂原和特異性抗原兩類。*絲裂原主要有PHA、ConA和PWM；*抗原刺激物有破傷風(fēng)類毒素、PPD和白色念珠菌等；淋巴細胞增殖實驗淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗（形態(tài)學(xué)示意圖）原理：人T細胞表面有PHA或ConA受體，T細胞在體外受PHA或ConA的刺激后能轉(zhuǎn)化為體積較大、代謝旺盛、且能進行分裂的淋巴細胞，以此測定T細胞的功能。

PHA刺激48-72小時淋巴細胞增殖—3H-TdR摻入法原理：將單個核細胞中加入PHA共同培養(yǎng)，在終止培養(yǎng)前8~15小時加入氚標記的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR),經(jīng)β-液體閃爍儀檢測淋巴細胞DNA的3H-TdR摻入量，推測淋巴細胞增殖的程度。MTT(四甲基偶氮唑鹽）法原理：在細胞培養(yǎng)終止前數(shù)小時加入MTT，活細胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶分解MTT產(chǎn)生藍色甲攢（Formazan)沉積于細胞內(nèi)或細胞周圍，形成甲攢的量與細胞增殖程度成正相關(guān)。(2)T細胞介導(dǎo)的細胞毒試驗：CTLTc和NK對其靶細胞有直接的細胞毒作用。方法：51Cr(鉻)釋放法乳酸脫氫酶釋放法凋亡細胞檢測法

(1)B細胞增殖(轉(zhuǎn)化)試驗

(2)溶血空斑形成試驗(3)酶聯(lián)免疫斑點法(ELISPOT):

（二）B細胞功能測定1.B細胞增殖試驗

B細胞受有絲分裂原刺激后分裂增殖，溫育一定時間后檢查抗體形成細胞的數(shù)目。小鼠B細胞可用細菌脂多糖為刺激物，人B細胞則用