生物芯片技術76706課件

生物芯片技術

(BIOCHIPTECHNOLOGY)

研究歷史(Researchhistory)1991Affymatrix公司StephenFodor:光刻與光化學技術、多肽和寡聚核苷酸微陣列。DNAChip概念Stanford大學Brown實驗室：預先合成，機械手陣列1995Schena等：基因表達譜1996Cheeetal：DNA測序1996Croninetal：突變檢測1996Sapolsley&Lipshutz：基因圖克隆1996Shalonetal：復雜DNA樣本分析1996Shoemakeretal：缺省突變定量表型分析第十章生物芯片技術生物芯片（biochip）的概念指采用光導原位合成或微量點樣等方法，將大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至組織切片、細胞等生物樣品有序地固化于支持物的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標記的待測生物樣品中的靶分子雜交，通過特定的儀器對雜交信號的強度進行快速、并行、高效地檢測分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。生物芯片（Biochip或Bioarray）是指包被在固相載體上的高密度DNA、抗原、抗體、細胞或組織的微點陣(microarray）。未來十年最具發(fā)展?jié)摿Φ募夹g。第十章生物芯片技術生物芯片的主要特點：高通量、微型化和自動化常用的生物芯片的分類：基因芯片、蛋白質芯片及芯片實驗室特點高度并行性：提高實驗進程、利于顯示圖譜的快速對照和閱讀。多樣性：可進行樣品的多方面分析，提高精確性，減少誤差。微型化：減少試劑用量和反應液體積，提高樣品濃度和反應速率。自動化：降低成本，保證質量。第十章生物芯片技術2.

蛋白質芯片(proteinchip)利用抗體與抗原特異性結合即免疫反應的原理，將蛋白質分子（抗原或抗體）結合到固相支持物上，形成蛋白質微陣列，即蛋白質芯片。第十章生物芯片技術芯片實驗室(labs-on-chip)高度集成化的集樣品制備、基因擴增、核酸標記及檢測為一體的便攜式生物分析系統(tǒng)。實現(xiàn)生化分析全過程集成在一片芯片上完成，從而使生物分析過程自動化、連續(xù)化和微縮化。芯片實驗室是生物芯片技術發(fā)展的最終目標。其他分類方法（根據(jù)應用）基因變異檢測芯片疾病檢測(如HIV、P53基因、結核桿菌)法醫(yī)鑒定(如DNA指紋圖譜)表達譜芯片腫瘤相關基因(正常與腫瘤組織表達差異)藥物篩選(培養(yǎng)細胞藥物刺激前后表達差異)發(fā)育(同一組織不同發(fā)育時期基因表達差異)組織發(fā)生(不同組織或器官的基因表達差異)2.DNA微矩陣法：成本低，易操作，點樣密度通常能滿足需要。芯片的載體需表面緊質、光滑的固體，如硅，陶，玻璃等，DNA微矩陣芯片常用玻片為載體。根據(jù)DNA成分寡聚核苷酸或DNA片段：約2025個核苷酸堿基，常用于基因類型的分析，如突變、正常變異（多態(tài)性）。全部或部分cDNA：約5005000個核苷酸堿基，通常用于兩種或以上樣本的相關基因表達分析。基因芯片的種類ScienceChip：生物分析和診斷NutriChip：食物分析、轉基因、污染檢測LeukoChip：血液分析、病毒分析、HLA分析AquaChip：水質分析SecureChip：含DNA的物質鑒定ChromoChip：基因分析和染色體序列ProkaryoChip：原核生物、獸醫(yī)、環(huán)保等第一節(jié)DNA芯片第一節(jié)DNA芯片DNA芯片技術包括四個主要步驟芯片的設計與制備樣品制備雜交反應和信號檢測結果分析生物芯片技術主要環(huán)節(jié)芯片制備：微點陣樣本制備：DNA提純、擴增、標記雜交：樣本與互補模板形成雙鏈檢測：共聚焦掃描，雙色激光數(shù)據(jù)處理：定量軟件，數(shù)據(jù)庫檢索，RNA印跡等。結果

第一節(jié)DNA芯片二、樣品的制備三、雜交與結果分析四、基因芯片技術在醫(yī)學中的應用一、芯片制備一、芯片制備基因芯片制備主要包括兩個方面探針的設計：根據(jù)應用目的不同，設計不同的固定于芯片上的探針。探針在芯片上的布局：選擇合適的方式將探針排布在芯片上。一、芯片制備（二）DNA芯片的制備

（一）探針的設計一、芯片制備

圖10－2（二）DNA芯片的制備

1．載體選擇與預處理載體：用于連接、吸附或包埋各種生物分子并使其以固相化狀態(tài)進行反應的固相材料。載體材料：玻片、硅片、硝酸纖維素膜、尼龍膜和聚丙烯膜等。載體的化學處理：活化劑——多聚賴氨酸氨基硅烷偶聯(lián)劑一、芯片制備芯片制備原位合成法（insitusynthesis):又可分為原位光控合成法和原位標準試劑合成法。適用于寡核苷酸，使用光引導化學原位合成技術。是目前制造高密度寡核苷酸最為成功的方法。一、芯片制備

圖10－3合成后交聯(lián)（post-syntheticattachment):利用手工或自動點樣裝置將預先制備好的寡核苷酸或cDNA樣品點在經特殊處理過的玻片或其他材料上。主要用于診斷、檢測病原體及其他特殊要求的中、低密度芯片的制備。兩種制備方法比較原位合成：測序、查明點突變高密度、根據(jù)已知的DNA編制程序制作復雜、價格昂貴、不能測定未知DNA序列合成后交聯(lián)：比較分析制備方式直接和簡單，點樣的樣品可事先純化，交聯(lián)方式多樣，可設計和制備符合自己需要的芯片。中、低密度，樣品浪費較多且制備前需儲存大量樣品。二、樣品的制備樣品的制備過程包括核酸分子的純化、擴增和標記樣本制備制備高質量樣本是困難的但又是極其重要的。制備細胞、組織或整個器官樣本應特別小心。溫度、激素和營養(yǎng)環(huán)境、遺傳背景、組織成分等輕微改變都會使基因表達的結果發(fā)生明顯變化。用于基因類型分析的樣本是DNA，用于表達研究的樣本是cDNA。樣本制備后應進行標記，通常為酶標記、熒光標記和核素標記。三、雜交與結果分析（一）雜交反應：與傳統(tǒng)的雜交方法類似（二）雜交信號的檢測：最常用熒光法（三）數(shù)據(jù)分析：芯片雜交圖譜的處理與存儲由專門設計的軟件來完成。雜交是芯片技術中除方陣構建外最重要的一步液相中探針與DNA片段按堿基配對規(guī)則形成雙鏈反應。選擇雜交條件時，必須滿足檢測時的靈敏度和特異性。使能檢測到低豐度基因，且能保證每條探針都能與互補模板雜交。合適長度的DNA有利于與探針雜交。溫度、非特異性本底等均會影響雜交結果。最好在封閉循環(huán)條件下雜交，雜交爐。結果分析

芯片與標記的靶DNA或RNA雜交后，或與標記的靶抗原或抗體結合后，可采用下列方法分析處理數(shù)據(jù)：共聚焦掃描儀：應用最廣，重復性好但靈敏度較低。質譜法：快速、精確，可準確判斷是否存在基因突變和精確判斷突變基因的序列位置。探針合成較復雜?；瘜W發(fā)光、光導纖維、二極管方陣檢測、直接電荷變化檢測等。芯片掃讀裝置根據(jù)采用的光電偶合器件，分為光電倍增管型和CCD型。根據(jù)激光光源，可分為激光型和非激光。應用最為廣泛的是激光光源的共聚焦掃描裝置，分辨率、靈敏度極高，有良好的定位功能，可定量，應用廣泛。圖象分析復雜的雜交圖譜一般需由圖象分析軟件來完成。分析軟件的功能：鑒定每個點陣、最大限度消除本底熒光的干擾、解析多種顏色圖象、可標記或排除假陽性、識別和分析對照實驗是否成功、可將信號標準化等。圖象處理軟件必須具備提取基因庫和數(shù)據(jù)庫的能力。四、基因芯片技術在醫(yī)學中的應用基因表達分析

基因型、基因突變和多態(tài)性分析疾病診斷：遺傳性、感染性、腫瘤藥物篩選指導用藥及治療方案預防醫(yī)學四、基因芯片技術在醫(yī)學中的應用生物芯片分析原則1、測定過程應包括五個基本步驟：需解決的生物學問題樣本制備生物化學反應檢測數(shù)據(jù)分析2、生物學系統(tǒng)控制必須精確地與檢測目的相匹配。

3、生物學樣本必須精確地與生物學種類相匹配。

4、所有基因分析必須平行處理。

5、基因分析技術必須適合微型化和自動化。

6、平行格式必須精確的依據(jù)生物學樣本的次序。

7、檢測系統(tǒng)必須能精確地獲得數(shù)據(jù)。

8、檢測系統(tǒng)獲得的數(shù)據(jù)必須能被精確地控制和重復。9、兩種或以上平行數(shù)據(jù)組比較應受到單

個實驗所固有特性的限制。

10、絕對比例關系只存在于組合實驗的平

行數(shù)據(jù)組內。

11、平行格式包括內在和外部的整個系統(tǒng)

誤差的分析因素。

12、在每個系統(tǒng)模塊中采集到該系統(tǒng)所有

變量的四維數(shù)據(jù)時，才能稱為完成生

物系統(tǒng)平行基因分析。

生物芯片技術的12條原則只是一個基本框架。其術語的詳細定義和有關理論可參見

質量控制實驗對照：體外轉錄從cDNA合成mRNA，參入標本中作為對照。此mRNA不與點陣的核酸雜交。將不同濃度的不同基因參入標本中，可作為標本間標準化的參照。用兩種不同吸收光譜的熒光素同時分析兩個標本，如果兩種熒光強度一致，可排除標本間變異因素。用單一堿基錯配的寡核苷酸做對照可排除交叉雜交。

結果有效性的證實在表達矩陣上，有時難于區(qū)分極其相似的序列，如基因族成員，亞類或異類的存在。比較兩種不同DNA序列表達水平時，有些參數(shù)如核苷酸的成分、二級結構的存在和矩陣上DNA的長度都會影響雜交。證實矩陣分析的結果可用RT-PCR(區(qū)別基因族成員,比較不同DNA種系表達,證實基因變異或突變和精確測定DNA表達水平)、NorthernBlot(證實某一基因的相對表達水平)、WesternBlot(RNA表達是否達到細胞中的蛋白水平)、質譜儀(證實矩陣結果是否在蛋白水平)等。第二節(jié)蛋白質芯片第二節(jié)蛋白質芯片蛋白質芯片（proteinchip）,又稱蛋白質微陣列，是指以蛋白質或多肽作為配基,將其有序地固定在固相載體的表面形成微陣列；用標記了熒光的蛋白質或其它分子與之作用，洗去未結合的成分，經熒光掃描等檢測方式測定芯片上各點的熒光強度，來分析蛋白質之間或蛋白質與其它分子之間的相互作用關系。

第二節(jié)蛋白質芯片根據(jù)制作方法和應用的不同，蛋白質芯片分為兩種蛋白質功能芯片細胞中的每一種蛋白質占據(jù)芯片上一個確定的點，主要是高度平行地檢測天然蛋白質活性。蛋白質檢測芯片將能夠識別復雜生物溶液（如細胞提取液）中靶多肽的高度特異性配體進行點陣。這種芯片能夠高度并行的檢測生物樣品中的蛋白質。第二節(jié)蛋白質芯片第二節(jié)蛋白質芯片蛋白質芯片技術在醫(yī)學中的應用特異性抗原抗體的檢測生化反應的檢測疾病診斷對疾病分子機制的研究藥物篩選及新藥的研制開發(fā)抗體和蛋白質陣列技術蛋白質組學(protiomics)的興起，促進了抗體和蛋白質陣列技術的發(fā)展。PareickBrown使用特異性抗體微矩陣，測定了細胞和體液樣本中數(shù)千種不同的蛋白質。Leuking等采用蛋白質微陣列技術，測定了10pg的微量蛋白質，并證實假陽性極低。乳腺癌基因芯片Stanford乳腺癌微矩陣(Perouetal.1999)每種基因的數(shù)據(jù)以行表示，每個實驗用列表示。顏色強度表示對照和實驗cDNA的比率。比率相同時為1。結果為紅色表示mRNA增加，綠色表示減少，灰白色表示缺乏。兩種基因的相似性用Pearson相關公式或Euclidian測距公式計算。DNA微矩陣分析軟組織肉瘤表達

KavineMaillardetal(1999)cDNAs進行DNA表達矩陣，PCR產物包被在經賴氨酸處理的玻片上，用Cys3-和Cys5-標記的cDNA進行雜交，洗滌后用Scanarray3000掃描儀測定矩陣，表達數(shù)據(jù)儲存在ACeDB數(shù)據(jù)庫中，根據(jù)數(shù)據(jù)表達類型區(qū)分不同的基因。微矩陣分析DNA和蛋白表達

HolgerEickhoffetal.(1999)根據(jù)已有的序列數(shù)據(jù)，組合800000人類EST序列，已重矩陣了38000克隆用于RNA表達分析，克隆經PCR擴增后共價結合于玻片上，每張玻片固定19200個基因片段，標記人組織RNAs與被選的38000人基因片段的矩陣進行雜交，比較健康與疾病組織的圖象，用軟件分析點識別和點定量。使用寡聚核苷酸鑒定新的cDNA克隆，和進入表達載體，使相應蛋白能直接表達，矩陣后可分析蛋白-蛋白和蛋白-DNA的關系。生物芯片相關儀器點陣儀：制備芯片。點樣針分為實心和空心兩種，點樣方式有非接觸噴點和接觸點樣兩種。雜交儀：全自動完成調節(jié)、加探針、漂洗和熱循環(huán)的雜交過程。掃描儀：激光共聚焦或CCD直接成像分析結果。微矩陣儀器介紹QBotQPixQArrayQPetQSoft2000QBot超高解析基因篩選暨排列分析儀?；蚓浜Y選(ColonyPicking)：3500/h基因排列打點(Gridding)：100000/h基因復制(Replication)：9696,96384基因重新排列(Re-Arraying)：正確的基因置復制盤基因微矩陣排列(Micro-Arraying)：20000/片全自動液體分注系統(tǒng)(LiquidHandling):96針，注液量1200l，適合PCR產物。分析軟件：分析、質控、上網。環(huán)境控制：紫外線照射、空氣濾網、陽極處理鋁板QPix半敞開式基因篩選暨排列分析儀(經濟型)基因菌落篩選(ColonyPicking)：3500/h基因排列打點(Gridding)：100000/h基因復制(Replication)：9696,96384基因重新排列(Re-Arraying)：正確的基因置復制盤基因微矩陣排列(Micro-Arraying)：20000/片分析軟件：分析、質控、上網環(huán)境控制：紫外線照射、空氣濾網、陽極處理鋁板QArray第三代半敞開式基因微矩陣排列儀?；蛭⒕仃嚺帕?Microarrying)：同時處理84片玻片，每一打點玻片分4個區(qū)域，可安排不同的矩陣排列?？蛇x16或24針座。儀器容量：玻片84片，玻片架6個，384孔板5盤。分析軟件：分析、質控、上網。環(huán)境控制：紫外線照射、空氣濾網、陽極處理鋁板。自動液體處理系統(tǒng)。雜交儀Affymetrix640雜交儀：溫度范圍：0100C探針用量：l流速：10ml/min樣本區(qū)：2.46.4cm掃描儀GenearrayTM掃描儀：激光：氬離子,488nm適用染料：熒光素、藻紅素單掃描時間：<4分鐘分辨率：3、6、9或24微米生物芯片技術的發(fā)展發(fā)展趨勢微型化：DNA矩陣越來越小。集成化：矩陣上的基因組越來越大。多樣化：測定范圍越來越廣。微量化：測定所需樣本越來越少。全自動化：樣品制備到結果顯示全部