食品毒理學(xué)基礎(chǔ)

食品毒理學(xué)基礎(chǔ)外推

毒理學(xué)實驗的基本原則在實驗動物中產(chǎn)生的作用，可以外推與人實驗動物必須暴露于高劑量成年的健康的（雄性和雌性未孕）實驗動物與人的暴露途徑相同1.外來化學(xué)物在實驗動物產(chǎn)生的作用，可以外推于人基本假設(shè)為：①人是最敏感的動物物種；②人和實驗動物的生物學(xué)過程包括化學(xué)物的代謝，與體重（或體表面積）相關(guān)。2.實驗動物必須暴露于高劑量(1)毒性試驗的設(shè)計并不是為了證明化學(xué)品的安全性，而是為了表征化學(xué)品可能產(chǎn)生的毒作用。(2)毒理學(xué)試驗中實驗?zāi)Ｐ退璧膭游锟偸沁h少于處于危險中的人群。3.成年的健康實驗動物成年的健康（雄性和雌性未孕）實驗動物作為一般人群的代表性實驗?zāi)Ｐ?。幼年和老年動物、妊娠的雌性動物、疾病狀態(tài)作為特殊情況另作研究。4.與人的暴露途徑相同毒理學(xué)試驗中染毒途徑的選擇，應(yīng)盡可能模擬人接觸該受試物的方式。毒理學(xué)試驗的局限性實驗動物和人的敏感性不同主觀感覺無法表述劑量設(shè)置過大動物數(shù)量有限毒理學(xué)試驗的基本目的受試物毒作用的表現(xiàn)和性質(zhì)劑量-反應(yīng)研究確定毒作用的靶器官確定損害的可逆性1.受試物毒作用的表現(xiàn)和性質(zhì)在急性和慢性毒性試驗中，觀察受試物對機體的有害作用，對有害作用的觀察應(yīng)該是對每個實驗動物進行全面的、逐項的觀察和記錄。發(fā)現(xiàn)有害作用是進行劑量-反應(yīng)(效應(yīng))研究的前提。Log[Dose]BiologicalResponseNOEL:NoObservableEffectLevelNOAEL:NoObservableAdverseEffectLevelLOEL:LowestObservableEffectLevelLOAEL:LowestObservableAdverseEffectLevelFEL:FrankEffectLevel2.劑量-反應(yīng)(效應(yīng))研究

動物實驗的職業(yè)道德給予人道主義的管理和處理使痛覺和不適減少到最低程度避免不必要的使用實驗動物3R原則替代（replacement)：應(yīng)用無知覺材料代替使用活的有知覺脊椎動物減少（reduction)：在能保證獲取一定數(shù)量與精確度的數(shù)據(jù)信息的前提下，減少動物的使用數(shù)量。優(yōu)化（refinement)：在必須使用動物時，要盡量減少非人道程序的影響范圍和程度。實驗動物物種的選擇在代謝、生物化學(xué)和毒理學(xué)特征與人最接近的物種易于飼養(yǎng)和試驗操作的物種自然壽命不太長的物種經(jīng)濟并易于獲得的物種經(jīng)驗性實驗動物選擇兩個物種：嚙齒類、非嚙齒類最常用的嚙齒類是大鼠和小鼠；非嚙齒類為犬豚鼠常用于皮膚刺激試驗和致敏試驗兔用于皮膚刺激試驗和眼部刺激試驗遺傳毒理學(xué)用小鼠；致癌用大鼠致畸用大鼠、小鼠、兔遲發(fā)神經(jīng)毒性常用母雞常用實驗動物生理學(xué)參數(shù)參數(shù)猴犬貓兔大鼠小鼠成體體重3.5143.33.70.450.035壽命(year)161514631.5斷乳體重4.45.830.1-1.50.0450.012妊娠期1686363312120生殖年齡54910632實驗動物品系的選擇品系（strain):用計劃交配的方法，獲得起源于共同祖先的一群動物。遺傳學(xué)分類：近交系、雜交群、封閉群、近交系、突變系動物、轉(zhuǎn)基因動物近交系動物（Inbredstrainanimals）又叫純系動物。是采用同胞兄妹或親子交配，連續(xù)繁殖20代以上所培育出來的遺傳上達到高度一致的動物群。

基因純合程度可達99.8%。①

主要指嚙齒動物；可出現(xiàn)近親交配衰退。②

親子交配與兄妹交配不能混用。③

親子交配時必須采用年輕的雙親同其子女交配。④

較大動物純種培育很難獲得成功，因為世代間隔較長，費用較大，所以成功率低。⑤

禽類和兔的血緣關(guān)系達到80%以上（相當(dāng)于兄妹交配四代）時，即可稱為近交系。1基因位點純合性在人工控制下有系統(tǒng)地進行近親交配，使雜合型祖代基因逐代地基因分離，從而逐漸提高個體與群體的基因純合率，在通過連續(xù)20代兄妹交配的培育之后．近交系動物任何一個基因位點上的純合概率高達98．6％以上，品系內(nèi)各個體在遺傳上同屬一種基因類型，因而能繁殖出完全一致的純合子后代，并且動物群中不再攜帶未知的隱性基因，品系保留和表現(xiàn)所有的遺傳性狀，個體相互支配繁殖不會出現(xiàn)性狀分離。2遺傳組成的獨特性在一個近交品系內(nèi)，所有動物個體都可追溯到其原始的一對共同祖先。但它們只是從祖先的整個基因庫里獲得極少部分基因，這些基因的組合構(gòu)成了品系的遺傳組成。近交品系內(nèi)的所有個體在遺傳上完全相同，具有獨特的表型特征，而不同的近交系之間的差異又非常明顯，由于近交系的遺傳同源性，若對近交品系中的某一個體進行基因分析可得知整個品系的基因類型。3．長期遺傳穩(wěn)定性近交品系由于遺傳組成的高度純合性和同源性．使其具有長期遺傳的穩(wěn)定性。4．均一性近交品系內(nèi)個體間在表型上具有均一性．這是遺傳同源性的結(jié)果，尤其是那些由遺傳決定的生物學(xué)特征。雜交群動物及其特點雜交群動物：指兩個不同的近交系之間有目的進行交配，所產(chǎn)生的第一代動物。例如：C57BL/6J×DBA/2→B6D2F1B6為C57BL/6J的縮寫，D2為DBA/2的縮寫。1具有雜交優(yōu)勢雜種一代動物具行較強的生命力，對疾病的抵抗力強，壽命長，容易飼養(yǎng)，在很大程度亡克服了因近交繁殖引起的近交衰退現(xiàn)象，適合于進行各種長期慢性實驗。2遺傳和表現(xiàn)型上的均質(zhì)性雜交群動物與一般的F1代動物不同，它雖然為雜合體，但具有與近交系相似的個體均質(zhì)性，具有較高的一致性，不容易受環(huán)境因素變化的影響。3．具有雜合的遺傳組成F1代動物是雜合體．同時具有兩個親本品系的基因，個體之間的基因型又是同一的，因其具有兩個親本的特點，可接受兩個親本品系的細胞、組織、器官和腫瘤移植，適用于免疫學(xué)和發(fā)育生物學(xué)等領(lǐng)域的研究。封閉群動物及其特點封閉群：一個種群在5年以上不從外部引進新血緣，僅由同一品系的動物在固定場所隨機交配繁殖的動物群。封閉群又稱遠交群。封閉群動物的雜合性，避免了近交衰退的出現(xiàn)，因此具有較強的繁殖力和生活力；封閉群動物的遺傳組成具有很高的雜合性；封閉群動物常因基因突變而導(dǎo)致動物某些方面異常突變系概念及其特點突變系是指正常染色體的基因發(fā)生了突變，從而具有某種特殊性狀表型的各種遺傳缺陷的品系。突變系動物有助于認識生命的復(fù)雜性；突變系動物可以作為人類疾病的動物模型在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)中應(yīng)用。裸鼠轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因動物是指以實驗方法導(dǎo)入的外源基因在動物染色體基因組內(nèi)穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的一類動物。實驗動物按微生物分類按微生物學(xué)控制標(biāo)推或微生物凈化程度，目前國際上一般將實驗動物分為四個等級，即無菌動物、悉生動物、無特定病原體動物和普通動物。無菌動物在自然界中并不存在，是在隔離器中經(jīng)人工取得仔體，用無菌母體代乳或人工哺乳，經(jīng)凈化培育得到。無特定病原體動物飼育在屏障或隔離系統(tǒng)中，通過無菌動物、悉生動物、無特定病原菌動物獲得的?；\具、飼料飲水要經(jīng)過特殊處理，并有嚴(yán)格的檢疫、消毒隔離制度。悉生動物又稱清潔動物，種系清楚，沒有該動物特有的病原菌。飼養(yǎng)在屏障系統(tǒng)中，空氣要經(jīng)過凈化、飼養(yǎng)室套保持正壓，進入室內(nèi)的一切物品要經(jīng)過消毒滅菌，工作人員進入要洗澡和穿滅菌工作服，動物飲滅菌水。普通動物是在微生物控制上要求最低的動物，飼養(yǎng)在開放系統(tǒng)，空氣未凈化，可飲自來水，房舍要求有通風(fēng)設(shè)施，人員進入要穿工作服專用鞋帽。實驗動物設(shè)施的分類開放系統(tǒng)：飼育環(huán)境與外界相同；有強力通風(fēng)設(shè)施、飼料飲水和墊料要求不被污染，應(yīng)防鼠和防昆蟲措施。屏蔽系統(tǒng)：潔凈度萬級，環(huán)境封閉，送入的空氣要過濾。飼料飲水和墊料要滅菌，飼養(yǎng)人員要經(jīng)過淋浴、穿無菌工作服，戴口罩手套。隔離系統(tǒng)：潔凈度百級，以隔離器為主體，送入的全新風(fēng)達百級以上，一切物品經(jīng)嚴(yán)格滅菌，飼養(yǎng)人員不得入內(nèi)。【上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司】【中國科學(xué)院上海實驗動物中心】【國家嚙齒類實驗動物種子中心上海分中心】實驗動物個體的選擇性別：一般雌雄各半，特殊？年齡和體重：急性毒性用成年，慢性用年幼或初斷乳的實驗動物。生理狀態(tài)：避免妊娠反應(yīng)，特殊？健康情況：將康在實驗前觀察5-7天實驗動物的管理動物的管理：接收、飼養(yǎng)、來源、鑒別等記錄環(huán)境條件控制：溫度、濕度、通風(fēng)、光照、噪音、墊料等設(shè)施管理：清潔衛(wèi)生、廢棄物管理等實驗動物的準(zhǔn)備實驗動物前的準(zhǔn)備：觀察、性別辨認實驗動物的抓取和固定實驗動物的編號實驗動物隨機分組實驗樣品的制備了解樣品的純度和雜質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)揮發(fā)性、溶解性、酸堿度、穩(wěn)定性所需樣品總量的計算總量=（A×B×C×D)×1.2A：每組動物數(shù)；B：各處理組的計量和C：染毒次數(shù)：

D：動物的平均體重溶劑和助溶劑的要求無毒或?qū)嶋H無毒與樣品不起反應(yīng)不影響樣品的毒效無特殊刺激性氣味遺傳毒理學(xué)用小鼠；致癌用大鼠致畸用大鼠、小鼠、兔遲發(fā)神經(jīng)毒性常用母雞制備樣品制劑時的要點加熱樣品時不應(yīng)接近改變樣品化學(xué)性質(zhì)或物理性質(zhì)的溫度如樣品為固體評價其對皮膚的毒性時，應(yīng)保持其形狀和顆粒大小多成分的樣品應(yīng)按配方配制如可能，制劑pH應(yīng)為5-9不應(yīng)用酸或堿使樣品解離如應(yīng)用非胃腸道途徑，終溶液盡可能接近等滲染毒途徑靜脈注射、吸入、肌內(nèi)注射、腹腔注射、皮下注射、口服、皮內(nèi)注射、經(jīng)皮經(jīng)口染毒特點喂飼：動物自行攝入，一般最高含量<5%，營養(yǎng)成分可更高，不適宜于口感差，易揮發(fā)水解的樣品，實際染毒量計算需單籠飼養(yǎng)。灌胃：操作前禁食空腹，大鼠隔夜，小鼠4個小時，均不停飲水，灌胃后2-4小時提供飼料，經(jīng)口多次染毒一般不禁食。吞咽膠囊：適用于易揮發(fā)水解和有異味的樣品。操作要點喂飼：動物自行攝入，一般<5%,一些有營養(yǎng)價值的事物成分可更高，但應(yīng)注意不要造成營養(yǎng)成分失衡而影響動物的生長發(fā)育。不適于口感性差的樣品；易揮發(fā)或水解的樣品；若要計算實際染毒量需單籠飼養(yǎng)。灌喂：灌喂前應(yīng)禁食空腹，大鼠隔夜禁食，小鼠可禁食4小時，均不停飲水，灌喂2-3小時后提供飼料。若經(jīng)口多次染毒經(jīng)呼吸道染毒靜式吸入染毒：染毒時間一般為兩小時，要求樣品在10分鐘內(nèi)揮發(fā)完畢。動式吸入染毒：每天的染毒時間為6小時，保證氧氣的濃度為19%。氣管內(nèi)注入：建立急性中毒模型。注射染毒皮下注射：注射時以左手拇指和食指提起皮膚將注射器刺入皮下，注射部位一般為大腿外側(cè)小腹部、背部或耳根部。皮內(nèi)注射：需局部脫去背毛，消毒后用左手拇指和食指按住皮膚并使之繃緊在兩指之間緊貼皮膚表層刺入皮內(nèi)。肌內(nèi)注射：選肌肉發(fā)達無大血管通過的部位一般為臀部，注射時垂直迅速刺入肌肉。腹腔注射：注射時左手抓住動物，腹部向上右手于左下腹部刺入皮下。靜脈注射：一般采用尾靜脈還有耳部，犬可采用頭靜脈。染毒途徑與染毒量經(jīng)口20ml/kg（對空腹動物）；經(jīng)皮2ml/kg；靜脈1ml/kg；肌內(nèi)注射0.5ml/kg（每一部位）；每眼0.01ml/kg；吸入2mg/L;鼻孔0.1ml生物標(biāo)本采集血液采集尿液采集膽汁采集糞便采集血液采集終末取血：以動物死亡為實驗結(jié)束非終末取血：麻醉或清醒的實驗動物身上單次或多次采血。血液總量取決于物種、性別、年齡、健康及營養(yǎng)狀況，一般總循環(huán)血量為55-77ml/kg體重。單次取血量低于動物總血量的15%，取血量在15~20%血壓降低30%，30~40%引起缺血性休克，40%時引起50%實驗動物死亡。單次采血不超過動物總血量的15%，可在3~4周后重復(fù)采血。多次采血每24h不應(yīng)超過總血量的1%，取血量不超過0.1ml時，可通過尾尖取血，也可以通過眼眶取血。不贊成在無麻醉條件下取血。尿液糞便采集可用代謝籠下部有糞尿分離器，取糞便分析時剔去表層，取內(nèi)層分析。麻醉麻醉分為四個時期：痛覺喪失期、興奮期、耐受期、窒息期。痛覺喪失期：從藥效開始發(fā)揮到意識喪失興奮期：從意識喪失開始出現(xiàn)到規(guī)則呼吸結(jié)束，呼吸不規(guī)則，瞳孔擴大，運動反射增強，眼球震顫耐受期：從規(guī)則呼吸開始到自主呼吸結(jié)束，分為四段（1）規(guī)則呼吸，瞳孔縮?。?）骨骼肌松弛，瞳孔縮小，呼吸平穩(wěn)，痛覺缺失，是進行手術(shù)的最佳時期（3）只有角膜反射，呼吸困難，瞳孔擴大（4）呼吸平穩(wěn)，瞳孔擴大窒息期：沒有反射沒有呼吸，瀕臨死亡，需立即用解毒劑防止死亡意識喪失，痛覺喪失，肌肉松弛是手術(shù)的最佳時期，將麻藥分為長效（長于120min）、中效（120min）、短效（30min）。麻醉時和麻醉后必須檢查動物的體溫，體溫降低時需使用加熱燈、加熱墊麻醉終止后動物要經(jīng)歷和麻醉過程相同但順序相反的幾個時期。常用的麻醉藥物短效：對嚙齒類多用乙醚，大動物用硫噴妥鈉10~25mg/kg靜脈或腹腔注射中效：推薦用賽拉嗪+氯胺酮肌內(nèi)注射長效：常用戊巴比妥鈉靜脈或腹腔注射安死術(shù)具有保證動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)立即達到失去痛覺的早期抑制作用，應(yīng)是無痛苦、不引起興奮，能快速導(dǎo)致一時喪失和死亡。推薦的安樂死方法小鼠：斷頭、脫頸伴放血、80%的二氧化碳、適宜揮發(fā)性麻醉劑、戊巴比妥鈉伴放血。大鼠：撞擊，脫頸、斷頭、80%的二氧化碳、適宜揮發(fā)性麻醉劑、戊巴比妥鈉伴放血。兔子：猛擊，并用腦定位打擊、撞擊伴放血、戊巴比妥鈉伴放血1.對照原則在動物實驗中，要求相比較的各組間動物的種類、性別、年齡、體重等盡可能地一致。對照組與實驗組同等重要，兩組的動物數(shù)應(yīng)相等。(1)空白對照：又稱正常對照(2)標(biāo)準(zhǔn)對照：又稱有效對照或陽性對照(3)組間對照：(4)自身對照：科研設(shè)計遵循的三原則2.重復(fù)原則(1)足夠的實驗樣本數(shù)：

(2)實驗結(jié)果的可重復(fù)性：3.隨機原則

為了減少個體差異這種非處理因素的干攏，應(yīng)于實驗前將實驗動物依統(tǒng)計學(xué)原則進行隨機分組，以此達到盡可能降低非處理因素的混雜效應(yīng)，從而提高每組動物間均衡性的目的。隨機分組方法：①隨機數(shù)字表法；②計算機軟件（如SPSS、SAS、Excel等）三、毒理學(xué)動物實驗設(shè)計內(nèi)容1.實驗動物選擇：2.實驗動物分組與劑量選擇、實驗期限：Log[Dose]BiologicalResponse低劑量組：NOAEL中劑量組：LOAEL高劑量組3.實驗觀察指標(biāo)選擇：實驗指標(biāo)（觀測指標(biāo)）是指在實驗觀察中用于反映研究對象中某些可被檢測儀器或研究者感知的特征或現(xiàn)象標(biāo)志。特異性客觀性

靈敏度

精確度可行性

認可性

實驗指標(biāo)選擇的基本條件

實驗指標(biāo)選擇依據(jù)根據(jù)實驗的目的、任務(wù)和內(nèi)容選擇指標(biāo)。根據(jù)化學(xué)物的種類和用途來選擇國家標(biāo)準(zhǔn)、部委和各級政府發(fā)布的法規(guī)、規(guī)定和行業(yè)規(guī)范中相應(yīng)的程序中的實驗方法要求來選擇指標(biāo)。4.統(tǒng)計學(xué)處理方法數(shù)據(jù)類別和統(tǒng)計學(xué)要求統(tǒng)計學(xué)方法1．“有或無”數(shù)據(jù)：動物間的比較個別組的比較Fisher精確分布檢驗(不分層的數(shù)據(jù))2×2校正的卡方檢驗(分層或不分層的數(shù)據(jù))非均勻性2×K卡方檢驗(分層或不分層的數(shù)據(jù))與劑量相關(guān)的趨勢Armitage檢驗(分層或不分層的數(shù)據(jù))動物內(nèi)部比較個別組的比較McWemar檢驗或符號檢驗非均勻性Cochran檢驗變量問的相關(guān)性Fisher精確分布檢驗2X2校正的卡方檢驗2．分級數(shù)據(jù)：動物間的比較個別組的比較MannWhitneyu檢驗非均勻性Kruskal—Wallis單向方差檢驗與劑量相關(guān)的趨勢非參數(shù)趨勢檢驗動物內(nèi)部的比較個別組的比較Wilcoxon配對符號秩和檢驗