酵母RNA 的提取、鑒定和定量測(cè)定實(shí)驗(yàn)十

綜合實(shí)驗(yàn)

酵母RNA的提純及其定性鑒定

與定量測(cè)定實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1、學(xué)習(xí)RNA提取的幾種常用方法并掌握濃鹽法提取RNA的原理和方法。

3、掌握幾種定性鑒定所得RNA的原理與方法。

4、掌握兩種定量測(cè)定所得RNA的原理和方法。

5、學(xué)習(xí)電泳技術(shù)的基本原理及其分類以及相關(guān)的應(yīng)用。

Ⅰ提純部分濃鹽法提取酵母RNAⅡ定性鑒定部分一、RNA基團(tuán)鑒定二、電泳分離鑒定三、光譜鑒定四、純度鑒定Ⅲ定量測(cè)定部分一、地衣酚法定量測(cè)定二、紫外吸收法定量測(cè)定實(shí)驗(yàn)內(nèi)容生物大分子物質(zhì)提取的基本原理與步驟一、材料選擇與處理二、細(xì)胞破碎三、細(xì)胞器分離四、提取五、純化六、濃縮、干燥七、樣品保存八、定性鑒定九、定量測(cè)定10、物質(zhì)的利用核酸的分布DNA：細(xì)胞核（95%）細(xì)胞器（5%）

RNA：細(xì)胞質(zhì)（75%)

細(xì)胞核(10%)

細(xì)胞器(15%)RNA以rRNA的數(shù)量最多（80％-85%)核酸提取的主要步驟破碎細(xì)胞去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子去除其它不需要的核酸分子沉淀核酸，去除鹽類，有機(jī)溶劑等雜質(zhì)核酸分離純化原則保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性排除其它分子的污染

簡(jiǎn)化操作，縮短時(shí)間，以減少各種有害因素對(duì)核酸的破壞減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解(pH4-10)減少物理因素對(duì)核酸的降解(機(jī)械剪切力、高溫)防止核酸的生物降解(DNA酶、RNA酶)

實(shí)驗(yàn)原理

由于RNA的來(lái)源和種類很多，因而提取制備方法也各異，一般有苯酚法、去污劑法和鹽酸胍法。其中苯酚法又是實(shí)驗(yàn)室最常用的。組織勻漿用苯酚處理并離心后，RNA即溶于上層被苯酚飽和的水相中，DNA和蛋白質(zhì)則留在苯酚層中，向水層加入乙醇后，RNA即以白色絮狀沉淀析出。此法能較好地除去DNA和蛋白質(zhì)，提取的RNA具有生物活性。

酵母細(xì)胞富含核酸，且核酸主要是RNA，含量為干菌體的2.67%-10.0%，而DNA含量較少，僅為0.03%-0.516%。為此提取RNA多以酵母為原料。工業(yè)上制備RNA多選用低成本、適于大規(guī)模操作的稀堿法或濃鹽法。這兩種方法所提取的核酸均為變性的RNA，主要用作制備單核苷酸的原料，其工藝比較簡(jiǎn)單。

稀堿法是用氫氧化鈉使酵母細(xì)胞壁變性、裂解，然后用酸中和，除去蛋白質(zhì)和菌體后的上清液用乙醇沉淀RNA或調(diào)pH2.5利用等電點(diǎn)沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。

濃鹽法是用高濃度鹽溶液處理，同時(shí)加熱，以改變細(xì)胞壁的通透性，使核酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái)。RNA提取方法方法與分類稀堿法(0.2%NaOH)濃鹽法(10%NaCl)苯酚法氯仿-異戊醇法去污劑法鹽酸胍法三、試劑和器材

1、試劑（1）干酵母粉（2）RNA標(biāo)準(zhǔn)溶液（100微克/毫升）（8）5%硝酸銀溶液（9）鉬酸銨試劑2克鉬酸銨溶解在100毫升10%硫酸中。（10）地衣酚試劑：100毫升濃鹽酸加入100毫克三氯化鐵，搖勻，貯存?zhèn)溆茫褂们凹尤?00毫克地衣酚。（11）NaCl（12）95%乙醇（13）6mol/lHCl（14）高氯酸（15）氯化鋰（16）硼酸緩沖液（pH-3.5）（17）磷酸緩沖液（pH-7.5）2、器材

（1）電子天平（2）電熱套（3）三角燒瓶（4）燒杯（5）高速冷凍離心機(jī)（6）滴管

（7）抽濾瓶（8）離心管（9）恒溫水浴箱

（10）吸量管（11）紫外分光光度計(jì)

（12）表面皿（13）量筒(14）容量瓶（15）擦鏡紙（16）比色皿（17）玻棒（18）定量濾紙（19）試管

（20）布氏漏斗（21）真空泵（22）電泳儀（23）紫外檢測(cè)儀（24）可見(jiàn)光分光光度計(jì)（25）托盤天平（26）電泳槽(27)0.5-5.0精密pH試紙

四、實(shí)驗(yàn)方法

RNA的提取的操作

3、RNA提取方法(濃鹽法)

提取方案：

①取12g活性干酵母,置150ml錐形瓶中，加入60ml蒸餾水，混勻；

②倒入7gNaCl，溶解后，沸水浴1h；

③3500rpm離心8min，將上清倒入50ml燒杯中，

4)用HCl調(diào)節(jié)pH，至2.0～2.5；

④將燒杯冰浴10min；⑤將燒杯中物質(zhì)（含沉淀）移入離心管中，3500rpm離心8min，棄上清，將沉淀移入10ml燒杯中，95%乙醇5～10ml洗滌⑥用布氏漏斗真空抽濾⑧干燥，稱重，計(jì)算提取率（并保存好RNA）思考題

1、簡(jiǎn)述生物大分子物質(zhì)提取和純化的一般步驟。2、RNA提取過(guò)程中的關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)有哪些？3、簡(jiǎn)述濃鹽法提取RNA過(guò)程中的關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)。RNA含量測(cè)定之一：地衣酚法

RNA的地衣酚法定量測(cè)定原理

RNA含量測(cè)定之一：地衣酚法測(cè)定。反應(yīng)原理：當(dāng)RNA與濃鹽酸共熱時(shí)，即發(fā)生降解，形成的核糖繼而轉(zhuǎn)變成糠醛，后者與3，5-二羥基甲苯（地衣酚

orcinol）反應(yīng)，在Fe3+或Cu2+催化下，生成鮮綠色復(fù)合物。反應(yīng)產(chǎn)物在670nm處有最大吸收。RNA濃度在20-250μg/ml范圍內(nèi)，光密度與RNA濃度成正比。λmax=670nmA、核糖鑒定：RNAH2SO4100℃（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取6支試管，7按下表編號(hào)及加入試劑，加畢混勻，置沸水浴中加熱45min，取出冷卻，于670nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值。

管號(hào)試劑012345標(biāo)準(zhǔn)RNA溶液（ml）(100g/ml)00.40.81.21.62.0蒸餾水（ml）2.01.61.20.80.40地衣酚試劑（ml）2.02.02.02.02.02.0（2）樣品的測(cè)定準(zhǔn)確稱取0.1g提取的酵母RNA，放入小燒杯中，加少量蒸餾水調(diào)成糊狀，溶解，若不溶，則滴入少量5%-6%氨水助溶，調(diào)pH至7.0，小心轉(zhuǎn)移到25ml容量瓶中，用蒸餾水定容到刻度，混勻。取1.0ml樣品液稀釋40倍后，分別取2份2.0ml的稀釋液，加入2.0ml的地衣酚試劑，混勻，與標(biāo)準(zhǔn)曲線的各管同時(shí)置沸水浴中加熱45分鐘，冷卻，測(cè)定O.D670。（3）RNA含量的計(jì)算根據(jù)測(cè)得的O.D值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相對(duì)應(yīng)的RNA含量，按下式計(jì)算出制品中RNA的百分含量：RNA%=RNA鑒定之一：組成基團(tuán)的鑒定RNA含有核糖、嘌呤堿、嘧啶堿和磷酸組分，加硫酸煮沸可使其水解，用硝酸銀、地衣酚和定磷試劑可分別鑒定嘌呤堿、核糖和磷酸組分。

A、嘌呤鑒定：嘌呤

嘌呤銀化物（白色或紅棕色）AgNO3RNAH2SO4100℃實(shí)驗(yàn)步驟:取適量0.05g提取的RNA，加10%硫酸液3ml，放在沸水浴中加熱5分鐘，制成RNA水解，做以下鑒定（1）嘌呤堿基的檢查

取水解液0.5ml，加氨水0.5ml及5%硝酸銀溶液0.3ml，觀察是否產(chǎn)生絮狀嘌呤銀化合物（有時(shí)絮狀物出現(xiàn)較慢，可放置十幾分鐘）。

（2）磷酸的檢查

取水解液0.5ml，加2滴濃硝酸酸化，再加入0.5ml鉬酸銨試劑，放在沸水浴中加熱10分鐘，冷卻靜置后觀察是否有黃色磷鉬酸銨沉淀產(chǎn)生。

（3）核糖的檢查

取水解液0.5ml，加地衣酚試劑0.5ml，放在沸水浴中加熱5分鐘，觀察溶液顏色變化。操作方法

用分析天平準(zhǔn)確稱取待測(cè)的樣品RNA0.150g，加入少量的蒸餾水調(diào)成糊狀，再加入少量的水稀釋。用5%---6%的氨水調(diào)至pH值為7.0，定容到10ml(RNA的鑒定三和四皆用該溶液,不過(guò)要稀釋200倍)。

RNA的定量分析之二：

紫外吸收法測(cè)定核酸濃度

取兩支離心管，向第一支管中加入2ml樣品溶液和2ml蒸餾水。第二支管中加入2ml樣品溶液和2ml沉淀劑?；靹颉Ｔ诒≈蟹胖?0分鐘，然后離心10分鐘，3000轉(zhuǎn)/分鐘。從各管中取出0.25ml上清液，用蒸餾水定容到25ml。于260nm處測(cè)定其光吸收值（OD1、OD2）將樣品放于紫外分光光度計(jì)上測(cè)定260nm,

計(jì)算核酸濃度。

OD1—OD2

RNA%=

0.022

×100

樣品濃度

式中：OD260為260nm波長(zhǎng)處光密度讀數(shù)；L為比色杯的厚度；0.022為每毫升溶液內(nèi)含

1微克RNA的光密度。RNA的鑒定三：提取的RNA吸收光譜測(cè)定

核酸在240~290nm的紫外波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，最大吸收值在260nm附近。不同的核酸有不同的吸收特征。所以可以用紫外分光光度計(jì)加以定性和定量。

操作:取RNA的定量分析之二所配溶液0.5ml,稀釋200倍,取3ml測(cè)定不同波長(zhǎng)(230、240、250260、270、280、290、300、310nm)下的OD值,以不同波長(zhǎng)為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo)繪制RNA吸收光譜曲線。RNA的鑒定四：提取的RNA純度的判斷

純DNA的OD260/OD280應(yīng)大于1.8，而純RNA的OD260/OD280應(yīng)達(dá)到2.0。如果樣品中含又雜蛋白、苯酚，則OD260/OD280的比值會(huì)明顯降低。所以我們通過(guò)測(cè)定OD260/OD280的比值來(lái)檢測(cè)RNA的純度。

操作:

取RNA的定量分析之二所配溶液0.5ml,稀釋200倍,取3ml于比色皿中分別在260nm、280nm處測(cè)定其光吸收值（OD1、OD2）根據(jù)測(cè)得的OD值判斷提取的RNA的純度。

劑i]

1、推入黑體遮光預(yù)熱2、在“T”位置調(diào)“0”3、在“T”位置調(diào)

“100”4、按到“A”位置測(cè)定UV-2000

RNA的鑒定之二：

醋酸纖維素薄膜電泳分離鑒定

1、RNA的堿水解：稱取0.15克RNA，溶于5mL0.3mol/L氫氧化鉀溶液中，使RNA的濃度達(dá)到20-30mg/ml。沸水浴30min

或者在37℃水解18個(gè)小時(shí)。將水解液轉(zhuǎn)移到椎形瓶中。冰浴中用高氯酸溶液將水解液滴定到pH3.5。2000r/min離心10min，上清液即是樣品液。２、準(zhǔn)備與點(diǎn)樣(1)將薄膜切成2.5cm×8cm的小片。在薄膜無(wú)光澤面(正面)的一端約2cm處用硬鉛筆劃一點(diǎn)樣線。(2)將薄膜無(wú)光澤面向下，置PH3.5,0.02mol/L的檸檬酸緩沖液中浸濕。(3)將充分浸透的膜條取出，用濾紙吸去多余的緩沖液，把膜條置潔凈玻璃板上，無(wú)光澤面朝上。用點(diǎn)樣器在距膜條一端2-3cm處點(diǎn)樣。醋酸纖維薄膜電泳裝置示意圖1.濾紙橋2.電泳槽3.醋酸纖維素薄膜4.電泳槽膜支架5.電極室中央隔板3．電泳

將點(diǎn)樣后的膜條置于電泳槽架上，放置時(shí)，無(wú)光澤面(即點(diǎn)樣面)向下，點(diǎn)樣端置于負(fù)極，槽架上以雙層濾紙作橋墊，濾紙的一端與支架的前沿對(duì)齊，另一端浸入電極槽的緩沖液中。用緩沖液將濾紙全部浸潤(rùn)并驅(qū)除氣泡。膜條與濾紙需貼緊，待平衡5min后通電，電壓為160V，電流為0.4～0.7mA/cm，通電30分鐘左右關(guān)閉電源。4．記錄結(jié)果通電完畢后用鑷子將薄膜取出，于紫外燈下觀察，用鉛筆將吸收紫外光的暗斑圈出。

在實(shí)驗(yàn)報(bào)告上繪出RNA水解液的醋酸纖維素薄膜電泳圖譜，并分析確定各斑點(diǎn)代表那種核苷酸。注意事項(xiàng)（1）市售醋酸纖維素薄膜均為干膜片，薄膜的浸潤(rùn)與選膜是電泳成敗的關(guān)鍵之一。若飄浮于