液相色譜應(yīng)用案例2

液相色譜應(yīng)用案例（二）廖杰liaojie301@163.com液相色譜應(yīng)用案例在藥物研究開發(fā)中的應(yīng)用質(zhì)量研究藥物代謝在生物標(biāo)志物研究與分析中的應(yīng)用DHPLC與基因診斷體液中氨基酸分析體液中兒茶酚胺的測(cè)定其它應(yīng)用蛋白質(zhì)組研究中的色譜預(yù)分離藥物研究開發(fā)過程中的液相色譜靶標(biāo)鑒定/確認(rèn)生物標(biāo)志物的分離/鑒定藥物發(fā)現(xiàn)藥物開發(fā)臨床研究生產(chǎn)銷售藥物設(shè)計(jì)/合成/鑒定/篩選/毒性評(píng)價(jià)確定候選藥物原料和制劑的臨床前研究藥學(xué)/藥理毒理純化/鑒定代謝組學(xué)研究確證結(jié)構(gòu)/質(zhì)量研究/制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)/穩(wěn)定性研究/動(dòng)物體內(nèi)藥代申報(bào)檢驗(yàn)療效和毒性質(zhì)量控制療效/毒性長(zhǎng)期研究人體藥代/長(zhǎng)期穩(wěn)定性研究/臨床用藥的質(zhì)量控制QA/QC批準(zhǔn)上市疾病研究20年抗放藥物研究的基本情況———————————————————————

研究項(xiàng)目數(shù)量(X)(Xx100)/7000x%———————————————————————————

在小鼠上試驗(yàn)過的化合物7000100.0

對(duì)小鼠有抗放作用的化合物>2303.3

在狗上試驗(yàn)過的化合物>701.0

對(duì)狗有效的化合物>300.43

能上人進(jìn)行研究的化合物140.2

臨床上進(jìn)行擴(kuò)大研究的藥物40.057———————————————————————應(yīng)用實(shí)例：新型COX-2抑制劑的研制COX抑制劑NSAIDsCOX（環(huán)氧化酶）COX-1COX-2PGs合成調(diào)節(jié)外周血管阻力保護(hù)胃腸道粘膜調(diào)節(jié)血小板聚集PGs合成促進(jìn)炎癥反應(yīng)和組織損傷COX-2抑制劑AA→PGs化合物設(shè)計(jì)系列化合物合成化合物純化/鑒定活性篩選，確定候選藥物質(zhì)量研究，制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)影響因素試驗(yàn)，加速試驗(yàn)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性考察藥理毒理實(shí)驗(yàn)制劑研究毒性實(shí)驗(yàn)藥代動(dòng)力學(xué)研究臨床前申報(bào)批準(zhǔn)后進(jìn)行I期、II期和III期臨床試驗(yàn)毒性評(píng)價(jià)建立HPLC分析方法——確定應(yīng)用目的純度檢查/質(zhì)量控制（鑒別/有關(guān)物質(zhì)檢查/含量測(cè)定）/代謝研究分離對(duì)象——原料/制劑/體液/組織定量分析/定性分析常量/痕量主成分/相關(guān)雜質(zhì)常規(guī)質(zhì)控/實(shí)驗(yàn)室研究建立HPLC分析方法——了解中間體和副產(chǎn)物合成路線（略）建立HPLC分析方法——初步建立方法選擇色譜分離條件

確定檢測(cè)波長(zhǎng)254nm

色譜圖（略）建立HPLC分析方法——方法優(yōu)化與驗(yàn)證有關(guān)物質(zhì)檢查檢測(cè)波長(zhǎng)的確定面積歸一化法/自身對(duì)照法（<0.5%）系統(tǒng)適用性試驗(yàn)——理論塔板數(shù)、主峰與相鄰雜質(zhì)的分離度供試品溶液的穩(wěn)定性方法驗(yàn)證——專屬性、精密度、最低檢出限色譜圖（略）主成分及相鄰雜質(zhì)的MS1圖（略）主要雜質(zhì)的LC-離子阱質(zhì)譜鑒定主成分及相鄰雜質(zhì)的MS2圖譜（略）建立HPLC分析方法——方法優(yōu)化與驗(yàn)證原料與制劑的含量測(cè)定確定定量方法/含量限度系統(tǒng)適用性試驗(yàn)——理論塔板數(shù)、主峰與相鄰雜質(zhì)的分離度供試品溶液的穩(wěn)定性方法驗(yàn)證——專屬性、線性、精密度、回收率、耐用性各三批供試品測(cè)定批號(hào)￥￥￥片劑的溶出曲線建立HPLC分析方法——方法優(yōu)化/驗(yàn)證/實(shí)施片劑溶出度的測(cè)定專屬性精密度線性回收率方法的耐用性與UV法比較建立HPLC分析方法——方法優(yōu)化與驗(yàn)證強(qiáng)酸破壞強(qiáng)堿破壞氧化劑破壞原料和制劑穩(wěn)定性研究高溫/高濕/光照試驗(yàn)加速試驗(yàn)長(zhǎng)期留樣品色譜圖（略）建立HPLC分析方法

——?jiǎng)游矬w內(nèi)代謝的研究選擇內(nèi)標(biāo)化合物預(yù)處理方法的確定建立色譜分離和檢測(cè)方法分析方法的確證與實(shí)施主要代謝產(chǎn)物的鑒定血漿藥物濃度測(cè)定方法——內(nèi)標(biāo)的選擇內(nèi)標(biāo)的選擇：結(jié)構(gòu)類似；非內(nèi)源性物質(zhì)；穩(wěn)定性好目標(biāo)化合物及內(nèi)標(biāo)的結(jié)構(gòu)式（略）血漿藥物濃度測(cè)定方法——預(yù)處理方法血漿藥物濃度測(cè)定方法——分離檢測(cè)方法12色譜條件（略）熒光檢測(cè)紫外檢測(cè)ABCABC方法的專屬性——內(nèi)源性物質(zhì)、代謝產(chǎn)物不干擾分離線性——……定量限——……日內(nèi)和日間精密度——三個(gè)濃度（……

）準(zhǔn)確度穩(wěn)定性——血漿室溫放置24hr、-20℃和室溫反復(fù)凍融血漿藥物濃度測(cè)定方法——方法的確證日期截距（×10-3）斜率(×10-3)相關(guān)系數(shù)r2005-5-238.426.360.99882005-6-4-1.417.290.99832005-7-2511.876.630.99812005-8-1614.267.020.99762005-8-1911.608.290.99632005-8-2023.847.610.9991血漿藥物濃度測(cè)定方法——實(shí)際樣品測(cè)定每一分析批建立一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)攜帶QC樣品，分散在整個(gè)待測(cè)樣品分析過程的前、中、后進(jìn)行測(cè)定，以保證每個(gè)分析批的準(zhǔn)確性比格犬口服片劑顆粒血漿藥物濃度隨時(shí)間的變化血漿藥物濃度測(cè)定方法——實(shí)際樣品測(cè)定體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化研究——代謝物分離色譜圖（略）樣品前處理：……體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化研究——代謝物制備色譜條件：……1234色譜圖（略）體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化研究——代謝物鑒定ESI-MSn分析條件：電噴霧離子源（ESI），正離子方式檢測(cè)，噴射電壓6KV；毛細(xì)管溫度250℃；毛細(xì)管電壓21V；管透鏡補(bǔ)償電壓55V；碰撞氣為He；鞘氣（N2）流速為25流量單位（a.u.）；輔助氣（N2）流速為35流量單位（a.u.）；注射泵進(jìn)樣速度5L·min-1；采集范圍：m/z50~800。M1M2M4化學(xué)結(jié)構(gòu)（略）BiomarkerAnalysis蛋白質(zhì)組研究中的色譜預(yù)分離蛋白質(zhì)組(proteome=protein

+

genome):

一種細(xì)胞、組織或生物體完整基因組所對(duì)應(yīng)的全套蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)組學(xué)proteomics——研究細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的組成及其活動(dòng)規(guī)律的科學(xué)對(duì)照樣品疾病樣品疾病特異蛋白圖象處理蛋白質(zhì)分析蛋白質(zhì)切割酶切質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索疾病相關(guān)蛋白質(zhì)組研究流程圖溶液或膠上酶切溶液酶切全溶液酶切蛋白質(zhì)提取液超聲破碎、離心SDS-PGGE多肽混合物膠上酶切cLC-MS/MS2DE膠上酶切多肽混合物MSorcLC-MS/MS2DLC多肽混合物細(xì)胞、組織或體液cLC-MS/MSorMUPIT多肽混合物cLC-MS/MSorMUPITHPLC/ALIEFSDS/RPLCcLC-MS/MSorMUPIT生物信息學(xué)分析

蛋白質(zhì)組研究技術(shù)路線流程圖LoadingPump1or2EnrichmentColumnsWasteNanoLCPumpInjectorNanoboreColumnIonTrapanalysisSCXColumnSaltasgradientorsteps01020304050607080Time[min]20mMHCOONH440mMHCOONH460mMHCOONH480mMHCOONH4100mMHCOONH4150mMHCOONH4250mMHCOONH4CapillaryornanoLCPumpInjectorSCXColumnSaltgradientCollectedfractionsLoadingPumpInjector1or2EnrichmentColumnsWasteNanoLCPumpNanoboreColumnIonTrapanalysis1990’s2000FutureGene

DiscoveryDiscovery

of

VariationsVariationLinkage

toDiseaseDiagnostics

and

PharmacogeneticsDHPLC與基因診斷SubstitutionsACCGTCAAC...GCGACCTTGGCAGTTG…CGCTGGTACCGTCCAC...GCGACCTTGGCAGGTG…CGCTGGTTransversion:exchangeofapurineforapyrimidineA->CPurine->PyrimidineInsertions5’ACCGTCAACGACCT3’3’TGGCAGTTGCTGGT5’TCGGATAGCCTA5’ACCGTTCGGATCAACGACCT3’3’TGGCAAGCCTAGTTGCTGGT5’Deletions5’ACCGTCAAC...GCGACCT3’3’TGGCAGTTG…CGCTGGT5’5’ACCGTCAACGACCT3’3’TGGCAGTTGCTGGT5’C…GG…CDHPLC分離原理DHPLC的分離模式Nondenaturing:50C

(SizeDependent,SequenceIndependent)

High-Resolution

dsDNAFragmentSeparations

bp587458434298257+26717410280Partiallydenaturing:52-78C

(SizeandSequenceDependent)

dsDNAMutationDetectionbydHPLCPartiallydenaturing:52-78C

(SizeandSequenceDependent)

SNPDetectionEightdifferentpolymorphismsincludingadeletion,insertionandahomozygouschangeinoneamplicon.Heterozygous

7(SNP)Heterozygous

6(SNP)Heterozygous

5(1bpinsertion)Heterozygous

4(SNP)Heterozygous

3(1bpdeletion)Heterozygous

2(SNP)Heterozygous

1(SNP)WildtypemixedwithhomozygousmutantWild

type體液中氨基酸分析體液中游離氨基酸水平反映了機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)和代謝狀態(tài)，氨基酸的水平及改變，與某些疾病，如肝病、肝性腦病、腎病，以及某些先天性、代謝性疾病有關(guān)。特別是必需氨基酸與非必需氨基酸比值、支鏈氨基酸與芳香氨基酸比值的測(cè)定，在臨床上具有一定的診斷和判斷預(yù)后的意義。TheAminoAcidsCode氨基酸分析方法柱后衍生離子交換色譜-茚三酮-570nm/440nm柱前衍生衍生-反相色譜-熒光檢測(cè)或UV檢測(cè)色譜柱：WatersNovPakODS柱（3.9mmx150mm）及保護(hù)柱流動(dòng)相：A0.05mol/L醋酸鹽緩沖液，pH6.8，含8%乙腈；B乙腈梯度洗脫熒光檢測(cè)：激發(fā)波長(zhǎng)335nm，發(fā)射波長(zhǎng)455nm樣品前處理：血漿—加入內(nèi)標(biāo)（磺基同型半胱氨酸）—沉淀蛋白—衍生化血漿同型半胱氨酸

血漿中游離Hcy大約占總量的<2%以下。Hcy值可以作為一種疾病預(yù)警指標(biāo)，即血液中同型半胱氨酸含量升高，標(biāo)志著動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，是動(dòng)脈血栓形成的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。尿中三甲基組氨酸

3-甲基組氨酸是骨骼肌肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白的降解產(chǎn)物，測(cè)定尿中3-甲基組氨酸的排泄量，有助于了解肌組織收縮蛋白的降解情況，從而掌握肌肉所承受的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷。色譜柱：Shim-ODS(4.6mmx250mm)柱，5μｍHypersil-C18流動(dòng)相：A四氫呋喃：甲醇：磷酸鹽緩沖液5：95：900；B甲醇，梯度洗脫熒光檢測(cè)：激發(fā)波長(zhǎng)260nm，發(fā)射波長(zhǎng)455nm樣品前處理：收集尿液—加入內(nèi)標(biāo)（乙醇胺）—衍生化LC/MS/MS用于氨基酸代謝紊亂的篩查PKU——一種常見的遺傳性氨基酸代謝疾病，因患者體內(nèi)缺乏苯丙氨酸羥化酶，苯丙氨酸不能正常代謝。中國(guó)PKU的發(fā)病率是1：11180MSUD——一種染色體隱性遺傳性疾病，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸這三種支鏈氨基酸的代謝受阻，導(dǎo)致BCAA及其衍生物α-酮酸在體內(nèi)聚積，對(duì)腦組織產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用。體液中兒茶酚胺的測(cè)定內(nèi)源性生物胺，由腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞中β-羥化酶催化合成，同時(shí)受多種酶活性的影響尿——原發(fā)性高血壓/嗜鉻細(xì)胞瘤血漿——帕金森病、心臟病、神經(jīng)脊瘤、甲亢腦脊液——研究生物胺在神經(jīng)系統(tǒng)的生理病理?xiàng)l件的作用樣品前處理：血漿—加入內(nèi)標(biāo)（3，4-二羥基芐胺）—過氧化鋁柱提取—沉淀蛋白色譜柱：

Hypersil-C184.6mmx250mm，5μｍ流動(dòng)相：0.1mmol/L磷酸二氫鈉水溶液（含辛烷磺酸鈉0.85mmol/L，0.5mmol/LEDTANa2）：甲醇89：11（用磷酸調(diào)pH至3.25）電化學(xué)檢測(cè)：工作電壓+0.85mV1去甲腎上腺素2腎上腺素3DHBA4多巴胺

血漿中兒茶酚胺最低檢出限：E:0.25ng；NE:0.3ng；DA:0.20ng樣品前處理：血漿—加入內(nèi)標(biāo)（3，4-二羥基芐胺）—過氧化鋁柱提取—沉淀蛋白色譜柱：

Hypersil-C184.6mmx250mm，5μｍ流動(dòng)相：0.1mmol/L磷酸二氫鈉水溶液（含辛烷磺酸鈉0.85mmol/L，0.5mmol/LEDTANa2）：甲醇89：11（用磷酸調(diào)pH至3.25）電化學(xué)檢測(cè)：工作電壓+0.85mV1去甲腎上腺素2腎上腺素3DHBA4多巴胺

血漿中兒茶酚胺最低檢出限：E:0.25ng；NE:0.3ng；DA:0.20ng樣品前處理：尿液（稀釋/過濾）—加入內(nèi)標(biāo)（5-羥基吲哚-乙酰胺）—衍生化色譜柱：

Cosmosil5C18

4.6mmx250mm，5μｍ流動(dòng)相：乙腈：10mmol/L醋酸緩沖液（pH6.0）35：65熒光檢測(cè)：λex345nm，λem480nm15-羥基吲哚胺2腎上腺素35-羥吲哚45-羥色胺5內(nèi)標(biāo)尿中兒茶酚胺(熒光衍生化)最低檢出限：腎上腺素5.6fmol去甲腎上腺素4.8fmol5-羥色胺18.0fmol組織中腺嘌呤核苷酸的測(cè)定樣品前處理：組織—液氮凍結(jié)—高氯酸冰浴勻漿—調(diào)pH色譜柱：

ZorbaxSB-C184.6mmx150mm，5μｍ流動(dòng)相：50mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH5.8）/甲醇：76/24（含離子對(duì)試劑A5mmol/L）紫外檢測(cè)：259nm腺嘌呤核苷酸（ATP、ADP、AMP）是生物