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原核誘導(dǎo)表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)一.目的:使本實(shí)驗(yàn)室工作人員了解誘導(dǎo)表達(dá)的操作過程,并能實(shí)際動(dòng)手進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá)一系列實(shí)驗(yàn)。二.適用范圍:本SOP適用于對(duì)新基因克隆的表達(dá),并針對(duì)新基因產(chǎn)生的可溶性蛋白。三.實(shí)驗(yàn)原理:E.coli的乳糖操縱子含Z、丫及A三個(gè)結(jié)構(gòu)基因,分別編碼半乳糖甘酶、透酶和乙?;D(zhuǎn)移酶,此外還有一個(gè)操縱序列O、一個(gè)啟動(dòng)序列P及一個(gè)調(diào)節(jié)基因I。I基因編碼一種阻遏蛋白,后者與O序列結(jié)合,使操縱子受阻遏而處于關(guān)閉狀態(tài)。在啟動(dòng)序列P上游還有一個(gè)代謝物基因激活蛋白(CAP)結(jié)合位點(diǎn)。由P序列、O序列和CAP結(jié)合位點(diǎn)共同構(gòu)成lac操縱子的調(diào)控區(qū),三個(gè)酶的編碼基因即由同一調(diào)控區(qū)調(diào)節(jié),實(shí)現(xiàn)基因產(chǎn)物的協(xié)調(diào)表達(dá)。在沒有乳糖存在時(shí),lac操縱子處于阻遏狀態(tài)。此時(shí),I序列在PI啟動(dòng)序列操縱下表達(dá)的Lac阻遏蛋白與O序列結(jié)合,阻礙RNA聚合酶與P序列結(jié)合,抑制轉(zhuǎn)錄起動(dòng)。當(dāng)有乳糖存在時(shí),lac操縱子即可被誘導(dǎo)。在這個(gè)操縱子體系中,真正的誘導(dǎo)劑并非乳糖本身。乳糖進(jìn)入細(xì)胞,經(jīng) b—半乳糖甘酶催化,轉(zhuǎn)變?yōu)榘肴樘?。后者作為一種誘導(dǎo)劑分子結(jié)合阻遏蛋白,使蛋白構(gòu)象變化,導(dǎo)致阻遏蛋白與O序列解離、發(fā)生轉(zhuǎn)錄。異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一種作用極強(qiáng)的誘導(dǎo)劑,不被細(xì)菌代謝而十分穩(wěn)定,因此被實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用。四、試劑準(zhǔn)備:(一)實(shí)驗(yàn)器材的滅菌:槍頭的滅菌:1mL,200gL,20ML的槍頭放入槍頭盒,用報(bào)紙包?。?層),放入高壓滅菌鍋中滅菌,121℃,20min。80℃烘箱中烘干,常溫放置。螺口管及離心管的滅菌:將螺口管和離心管分別放入鋁制飯盒中(蓋子要擰松,離心管的管蓋打開) ,放入高壓滅菌鍋中滅菌,121℃,20min。80℃烘箱中烘干,常溫放置。50mL離心管的滅菌:將50mL離心管用報(bào)紙包?。?層),放入高壓滅菌鍋中滅菌,121℃,20min。80℃烘箱中烘干,常溫放置。(二)LB培養(yǎng)基的配制液體LB培養(yǎng)基(1L):蛋白胨10g氯化鈉10g酵母提取物5g調(diào)PH值到7.5,高壓滅菌,4℃保存。固體LB培養(yǎng)基(1L):蛋白胨10g氯化鈉10g酵母提取物5g瓊脂粉15g高壓滅菌,不燙手的情況下加入抗性,抗性:培養(yǎng)基=1:1000(氨芐,卡那通常濃度),混勻。馬上在無菌操作臺(tái)中倒平板,并開大風(fēng)吹干。用封口膜封住,倒置放于4℃保存。(三)1MIPTG的配制:經(jīng)過計(jì)算,10gIPTG可以配42ml的1MIPTG。買來的粉末狀的IPTG一般全部配成1MIPTG。1、無菌操作臺(tái)紫外線照射,后通風(fēng)。2、用少量去離子水將IPTG溶解完全,并定容。3、在無菌操作臺(tái)中,用0.22^m的濾器將配好的IPTG濾入滅菌后的1.5ml離心管中,過濾除菌,-20℃保存。注意事項(xiàng):在用濾器將IPTG濾入離心管時(shí),先用針頭吸IPTG,然后將槍頭拔掉,排出氣體,濾頭加入IPTG液,在使針管與濾器相連,保證整個(gè)裝置無氣體進(jìn)入。濾的過程中,手不能碰濾頭。(四)3xSDSloadingbuffer的配制:3XSDSloadingbuffer10ml1MTris-Hcl(PH6.8)1.5mlSDS0.6gBPB(澳酚藍(lán))30mg甘油(丙三醇)3ml去離子水5.5ml.將除BPB以外的藥品完全溶解。SDS常溫下很難溶解,可以在37℃水浴溶解。完全溶解后,再加入BPB,進(jìn)行溶解。.把溶好的buffer分裝到1.5ml的離心管中,1ml/管,常溫放置。.使用前,每管加入30ML巰基乙醇。注意事項(xiàng):巰基乙醇為危險(xiǎn)品,加入的過程在通風(fēng)櫥中完成,并且?guī)Ш檬痔?。(五?0XPBS的配制:0.1MPBS(10XPBS)1LNaH2PO4.2H2O2.83gNacl85gNa2HPO4.12H2O28.98g用去離子水將以上藥品進(jìn)行溶解。(溶解的非常慢,可能需要過夜)調(diào)PH值至U7.2,用0.4gm的濾膜過濾。常溫保存。工作時(shí)用的是1XPBS。(六)1.5MTris-Hcl(PH8.8)的配制:1.5MTris-Hcl250mlTris45.425g.用200ml去離子水將Tris溶解。.用濃鹽酸調(diào)PH值到8.8。.調(diào)好PH的Tris-Hcl定容到250ml。.0.4gm的濾膜過濾,常溫保存。注意事項(xiàng):Tris的緩沖能力很強(qiáng),調(diào)PH值時(shí),費(fèi)些時(shí)間,但不要調(diào)過。(七)1MTris-Hcl(PH6.8)的配制:1MTris-Hcl250mlTris30.275g.用200ml去離子水將Tris溶解。.用濃鹽酸調(diào)PH值到6.8.調(diào)好PH的Tris-Hcl定容到250ml。.0.4gm的濾膜過濾,常溫保存。(八)30%丙烯酰胺的配制:30%丙烯酰胺250ml丙烯酰胺72.5mlBIS甲叉丙烯酰胺2.5ml1.把藥品用去離子水溶解后定容到250ml。2.用濾紙過濾,放在棕色瓶子中,4c保存。注意事項(xiàng):兩種藥品有毒性,配制過程要帶手套和口罩。(九)10%SDS的配制:.1gSDS加入10ml去離子水進(jìn)行溶解。.分裝到1.5ml離心管中,-20℃保存。(十)10%過硫酸銨的配制:.1g過硫酸銨加入10ml去離子水進(jìn)行溶解。.分裝到1.5ml離心管中,-20℃保存。(十^一)5XSDS電泳緩沖液的配制:5XSDS電泳緩沖液1LTris15.1gGlycine(甘氨酸)94gSDS5g將以上藥品用去離子水溶解后定容到1L,常溫保存。工作時(shí)用的是1XSDS電泳緩沖液。(十二)考馬斯亮藍(lán)R-250染色液的配制:考馬斯亮藍(lán)R-250染色液1L.往1g考馬斯亮藍(lán)R-250中加入250ml異丙醇,在磁力攪拌器上攪拌六小時(shí)以上。.加入650ml去離子水,磁力攪拌器攪拌過夜。.再加入100ml冰醋酸進(jìn)行溶解,磁力攪拌器攪拌。.在通風(fēng)櫥內(nèi)用濾紙進(jìn)行過濾。常溫保存。染色液只能反復(fù)用兩次。注意事項(xiàng):在磁力攪拌器上攪拌時(shí),要把容器封口。(十三)脫色液的配制:脫色液1L醋酸(冰乙酸)100ml乙醇(無水乙醇)50ml去離子水850ml常溫保存。四.實(shí)驗(yàn)步驟:(一):質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化.使用無菌操作臺(tái)之前先用75%的酒精擦拭,然后將滅菌的培養(yǎng)基以及所有要用到的器具放到超凈臺(tái)上,在開紫外照射30min左右。操作之前,關(guān)掉紫外,打開通風(fēng)櫥,將手用酒精擦拭后開始操作。.從-80℃的冰箱中取出表達(dá)菌(BL21)的感受態(tài)細(xì)胞(每管100RL),在-80℃冰水中融化。.載體(PET32a等)與基因片段的連接后質(zhì)粒1gL,緩慢的加入到100rLBL21感受態(tài)中,冰置15min。(無菌操作).42℃下熱激90s,隨后在冰水中冰置5min。.涂板:先將涂布棒用酒精棉球擦,然后用酒精燈火焰燒,放置等它涼卻。把處理后的感受態(tài)點(diǎn)在含有抗性的固體培養(yǎng)基(氨芐或卡那等)上。用冷卻的涂布棒進(jìn)行涂布,左手把該蓋拿起,小指輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)基,右手來涂,涂到培養(yǎng)基表面快干。(無菌操作).放在37℃培養(yǎng)箱中,倒置培養(yǎng)過夜。注意事項(xiàng):.質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化時(shí),質(zhì)粒是凍在-20℃的冰箱中,等它完全化了在進(jìn)行吸取,往感受態(tài)中加入質(zhì)粒時(shí),一定要緩慢,因?yàn)楦惺軕B(tài)非常脆弱,防止感受態(tài)受傷。.質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化時(shí),熱激的時(shí)間90s,一定要控制好時(shí)間。.質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化時(shí),涂布棒在涂布前,一定要晾涼涂布棒。防止感受態(tài)被燙死,或固體培養(yǎng)基的損壞。(二):挑菌與接菌:.無菌操作臺(tái)紫外線照射,后通風(fēng)。將轉(zhuǎn)化后的平板取出。.在無菌操作臺(tái)中,把消毒后的螺口管(一般一個(gè)基因取四個(gè)螺口管,進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn))取出,在酒精燈的外焰上灼燒螺口管管口。.滅菌后的LB培養(yǎng)基從冰箱中取出,在酒精燈的外焰上燒一下培養(yǎng)基瓶口。吸取LB培養(yǎng)基(一般5.5mL)加入螺口管中,后加入抗性(氨芐霉素、卡那等)。氨芐霉素(卡那):LB培養(yǎng)基=1:1000(5.5rL),抗性由載體決定。.鑷子用酒精棉球擦拭,并在酒精燈的外焰上灼燒,將鑷子晾涼。用晾涼的鑷子,夾取20^L小槍頭,在轉(zhuǎn)化后的平板上挑取單菌落,扔到培養(yǎng)基中。.接好菌的螺口管,進(jìn)行搖菌。37℃,180rpm。搖到菌的對(duì)數(shù)期(OD60d直0.4-0.6),時(shí)間大概2-3h。可以模糊看到手即可。(注意不要搖過).用完的平板用封口膜封住,倒置放于4c保存。.若直接用菌液進(jìn)行接菌,接菌比例為,菌液: LB培養(yǎng)基=1:100。注意事項(xiàng):.接菌吸培養(yǎng)基時(shí),把放置培養(yǎng)基的三角瓶?jī)A斜才吸取培養(yǎng)基,移液槍盡量不要插進(jìn)三角瓶中。.接菌時(shí)一定要加入抗性,挑菌落時(shí),要挑單個(gè)的菌落,且不要把培養(yǎng)基也扣起來。.搖菌不要過了它的對(duì)數(shù)期,2小時(shí)后隨時(shí)注意其生長(zhǎng)狀態(tài)。(三)小量保菌:.無菌操作臺(tái)紫外線照射,后通風(fēng)。.將搖到標(biāo)準(zhǔn)OD值的菌液進(jìn)行小量保菌,先在酒精燈的外焰上灼燒螺口管管口。.保菌:從滅菌的飯盒中取出4個(gè)1.5ml的滅菌的離心管,加入50gL的滅菌后的80%的甘油,并分別加入相應(yīng)的350ML菌液。一個(gè)基因的四個(gè)平行實(shí)驗(yàn)菌都要進(jìn)行保菌。(若不保菌,實(shí)驗(yàn)不能進(jìn)行重復(fù),只能從頭做).標(biāo)清保菌的類別,名稱,時(shí)間,如“BL21PET32aVAV1號(hào)2010.7.14”,其中的1號(hào)是平行對(duì)照中它排幾號(hào)。.混勻,-20℃保存。注意事項(xiàng):.在小量保菌中,一個(gè)基因的四個(gè)平行對(duì)照都要保菌,否則得重新摸條件。.在小量保菌中,菌液與甘油一定要混勻在保存,否則菌會(huì)被凍死。(四)蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件摸索.無菌操作臺(tái)紫外線照射,后通風(fēng)。.小量保菌后的四個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組,分別加入不同終濃度的IPTG,在不同的溫度條件下進(jìn)行誘導(dǎo)(如下圖):對(duì)照編號(hào)IPTG終濃度誘導(dǎo)溫度誘導(dǎo)溫度1號(hào)1mmol/L3h37℃2號(hào)0.1mmol/L3h37℃3號(hào)1mmol/L3h30℃4號(hào)0.1mmol/L3h30℃(五)小量收菌.將誘導(dǎo)完成的四個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組菌液,分別取出1mL,對(duì)應(yīng)裝于4個(gè)不同的1.5ml離心管中并做好標(biāo)記。剩余的平行實(shí)驗(yàn)組菌液放入4c保存。.離心7000rpm,2min,使菌沉淀。.把上層培養(yǎng)基倒掉,用1ml1XPBS把表達(dá)菌重懸,再次離心7000rpm,2min,使菌沉淀。.把上層1XPBS倒掉,再次離心同步驟3。.用80gL1XPBS把表達(dá)菌體重懸。.在四個(gè)平行的重懸液中,分別加入 80國(guó)3XSDSloadingbuffer。(把3XSDSloadingbuffer當(dāng)成2xSDSloadingbuffer用).煮樣8min。(打開鍋蓋煮).離心13000rpm,10min。吸上清。.進(jìn)行SDS電泳。注意事項(xiàng):在煮樣時(shí)要打開鍋蓋煮,防止小樣進(jìn)水,若樣進(jìn)水,則不能再用。(六)SDS膠的配制.分離膠的配制(1)找出配套的膠板,用擦鏡紙擦干凈,并固定在配膠器上。隨后用去離子水試漏。(2)若膠板不漏水,就進(jìn)行分離膠的配制。 依次將水、30%丙烯酰胺、1.5MTris-Hcl(PH8.8)、10%SDS、10%過硫酸銨加到干凈的小燒杯中(如下圖),混勻。(1mm的膠板,一般配一塊膠用5ml。所配的膠濃度一般為12%,但濃度也要視情況而定。蛋白越小,膠的濃度越大。)

SDS分離膠配方表各種里份名稱各種麋臟體積所對(duì)應(yīng)的各科里情的四樣做5ml10ml15ml20ml25ml30ml40ml50ml5%GelHsO2.65.37.910.613.215.921.226.530%Acrylamide1.02.03.04.06.06.08.010.01.5MTris-HCI(pH8.8)1.32.63.85.06.37.610.012.510%SDS0.050.10.160.20.250.30.40.510%過施藁錢0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0040.0080.0120.0160.020.0240.0320.04B%GelH2O2.34.66.99.311.513.918.523.230%Aerylamida1.32.74.05.36.78.010.713.31.5MTris-HCI(pH8.8)1.32.53.85.06.37.510.012.510%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%過肥毒銃0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0030.0060.0090.0120.0150.0180.0240.0310%GelHsO1.94.05.97.99.911.915.9W.B30%Acrylamide1.7.3.35.06.78.310.01.3.316.71.5MTris-HCI(pH8.S)1.32.53.B5.06.37.510.012.510%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%過施藁銃0.050.10.160.20.250.30.40.5TEMED口儂0.0040.0060.0080.010.0120.0160.0212%GelH2O11.63.34.96.68.29.913.2116.530%Acrylamide2.04.06.08.0110.012.016.020.01.5MTris-HCI(pH8.8)1.32.53.85.06.37.510.012.510%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%過流謔鍍0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.0215%GelH2OL12.33.44.65.76.99.211.530%Acrylamide2.55.07.510.012.515.020.025.01.5MTris-HCI(pH8.S)1.32.53.85.06.37.510.012.510%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%過能量錢0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.01160.02(3)將膠板中的水倒掉,并用濾紙吸干水分(不要將濾紙塞到膠板底部) 。(4)小燒杯中再加入TEMED,混勻。(TEMED可使膠凝固,所以最后加)(5)灌膠:混勻的分離膠沿著膠板邊緣輕輕灌下,防止產(chǎn)生氣泡。(6)用水將分離膠壓平。(用水灌滿,同時(shí)加水時(shí)要緩慢加入,防止把膠吹起)2.濃縮膠的配制(1)待分離膠與水中間形成明顯的橫線,即分離膠凝固。隨后進(jìn)行濃縮膠的配制,依次將水、30%丙烯酰胺、1.0MTris-Hcl(PH6.8)、10%SDS、10%過硫酸銨加到干凈的小燒杯中(如下圖)SDS濃縮膠(5%Acrylamide)配方表各種組份名稱春種凝腔體積所對(duì)應(yīng)的各種組材的取樣■1ml2ml3ml4ml5ml6iniBml10ml0.681.42.12.73.44.15.56.830%Acrylamide0.170.330.50.670.8311.011.311.71.0MTris-HCI(pH6.8}0.130.250.3B0.50.630.751.011.2510%白口30.010.020.030.040.050.06O.OB0.11喔過硫酸顯0.010.020.030.040.050.060.0B0.1TEMED0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0000.01(2)將分離膠上層的水倒掉,并用濾紙吸干水分。(盡量不要把濾紙插入)(3)小燒杯中再加入TEMED,混勻。(4)灌膠。然后插入梳子。(5)把制膠器倒過來,膠仍然不會(huì)往外流,或可以明顯看出梳子中兩個(gè)齒之間的膠面明顯凹下去,說明濃縮膠凝固。將凝固的膠板裝入電泳槽內(nèi),并在電泳槽內(nèi)加入SDS電泳緩沖液,把膠浸泡一段時(shí)間,時(shí)間越長(zhǎng)越好。 (防止梳子與膠相連,

或膠因濕度不夠而萎縮)(6)點(diǎn)樣時(shí),再把梳子拔出來,拔時(shí)動(dòng)作要輕,防止膠齒被拔斷。(七)未誘導(dǎo)和空載的制備在誘導(dǎo)表達(dá)中,有兩個(gè)重要的對(duì)照組,即空載誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)。1.未誘導(dǎo)的制備(1)未誘導(dǎo)是我們所做一個(gè)基因除了四個(gè)平行實(shí)驗(yàn)外,再做的一個(gè)對(duì)照組菌,唯一不同的是它不進(jìn)行誘導(dǎo)(接菌步驟如上),在37℃下,進(jìn)行搖菌,不加IPTG,搖起來即可。(和表達(dá)完的菌濃度差不多即可)(2)未誘導(dǎo)的菌進(jìn)行小量處理,見上面的小量收菌。2.空載誘導(dǎo)的制備(1)空載的轉(zhuǎn)化:將不連基因片段的空載體質(zhì)粒,轉(zhuǎn)入表達(dá)菌(和前面的試驗(yàn)用一個(gè)表達(dá)菌),如“BL21-PET32a-VAV質(zhì)粒”轉(zhuǎn)入“8121表達(dá)菌”,其空載應(yīng)當(dāng)是“8121?£132屋轉(zhuǎn)入“8121表達(dá)菌”。轉(zhuǎn)化步驟同上。(2)空載接一個(gè)菌(實(shí)驗(yàn)組),并搖菌搖到對(duì)數(shù)期(步驟同上)。(3)空載的誘導(dǎo):空載的誘導(dǎo)條件固定為溫度37℃,時(shí)間3h.,IPTG終濃度為1mmol/L。(誘導(dǎo)步驟如上)。(4)空載的菌進(jìn)行小量處理,見上面的小量收菌。(八)蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件摸索的SDS電泳.拔掉SDS膠上的梳子,并用小針調(diào)整齒的位置(使它們都平行)。.點(diǎn)樣。用20ML的小槍頭,吸煮過的樣品10^L,對(duì)準(zhǔn)膠孔點(diǎn)樣,注意不要把樣品點(diǎn)在外面。我們用的marker是低分子量蛋白marker。一般的點(diǎn)樣順序是:1234567空載未誘導(dǎo)樣品1號(hào)樣品2號(hào)樣品3號(hào)樣品4號(hào)marker3.開始電泳,電泳儀正負(fù)極接好,打開電源。濃縮膠:電壓low100V分離膠:電壓high150V。4.卸膠染色。等膠內(nèi)的所有的藍(lán)色都跑出去,電泳停止,一般時(shí)間為1小時(shí)45分。把膠板從電泳儀上卸下,用刀片把膠板撬開,膠的濃縮膠部分割除,放入考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中進(jìn)行常溫過夜染色。.脫色。將過夜染色的SDS膠放入脫色液中進(jìn)行脫色,直到背景發(fā)白。(九)四個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組菌液的選擇.將脫好的膠拿出進(jìn)行觀察,看四個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組菌液是否進(jìn)行了蛋白表達(dá)。一般來說,未誘導(dǎo)沒有過量的蛋白表達(dá),而空載有一處蛋白的過量表達(dá)(大小由表達(dá)載體決定),四個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組也有一處蛋白的過量表達(dá),它比空載表達(dá)的蛋白要大,大出的那一部分即我們的目的蛋白。.若平行實(shí)驗(yàn)組中無過量蛋白表達(dá),尤其是37℃,1mmol/L,3h無過量蛋白表達(dá),則說明蛋白無表達(dá)。.若平行實(shí)驗(yàn)組中有過量蛋白表達(dá),但它的大小與空載的大小相同。這說明蛋白進(jìn)行了漏表達(dá)。.若蛋白表達(dá)正常,則選擇誘導(dǎo)溫度最低,IPTG濃度最低的實(shí)驗(yàn)組(30℃,0.1mmol/L,3h),進(jìn)行下面的小量超聲實(shí)驗(yàn)。(十)表達(dá)菌的小量超聲實(shí)驗(yàn).把以上做的四個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組菌液從4c中拿出。.將最有條件的實(shí)驗(yàn)菌全部收集在1.5ml的小離心管中。(其他平行實(shí)驗(yàn)組的菌進(jìn)行滅菌).離心7000rpm,2min,使菌沉淀。.把上層培養(yǎng)基倒掉,用1ml1XPBS把表達(dá)菌重懸,再次離心7000rpm,2min,使菌沉淀。.把上層1XPBS倒掉,再次離心同步驟3。.用500gL1XPBS把表達(dá)菌重懸。.將菌液放入小玻璃管中,準(zhǔn)備進(jìn)行超聲。.將超聲儀打開預(yù)熱20min,并準(zhǔn)備冰盒。.將呈菌液的小玻璃管放入冰盒進(jìn)行超聲,超聲效率為30—50HZ,超聲3s,停5s。直到菌液超澄清(透明呈現(xiàn)雞蛋清色)。.將超開的菌液進(jìn)行離心,13000rpm,10min。.離心產(chǎn)物上清取出100^1,加入100pL3xSDSloadingbuffer。.上清倒掉,沉淀用1ml1XPBS把表達(dá)菌重懸,再次離心13000rpm,10min。.重復(fù)11步。.上清倒掉,用100pL將沉淀懸起,加入100rL3xSDSloadingbuffer。.上清和沉淀都進(jìn)行煮樣,開鍋蓋,8min。.離心13000rpm,10min。吸上清。.進(jìn)行SDS電泳。注意事項(xiàng):.小樣超聲時(shí),要超徹底,一般超4—5分鐘即澄清。若仍然不澄清,則可能是包涵體。超的過程中不要超糊。.在洗超聲離心物的沉淀時(shí),要洗干凈。(十^一)破菌超聲的SDS電泳1.配膠、點(diǎn)樣、電泳的步驟如上。破菌超聲的點(diǎn)樣順序一般為:123456marker未誘導(dǎo)空載全菌破面上清破菌沉淀未誘導(dǎo),空載,全菌為摸索表達(dá)條件時(shí)所用的樣品。注:我們破的幾號(hào)菌,就上幾號(hào)的全菌樣。2.若破菌上清表達(dá)的蛋白與全菌的蛋白分子量一致(目的蛋白)且破菌沉淀中沒有,這說明蛋白可溶;若破菌沉淀中有目的蛋白,而破菌上清中沒有,說明蛋白為包涵體。(十二)目的蛋白的大量表達(dá)(1L).配制培養(yǎng)基1L,每大瓶500ml,高壓滅菌4℃保存。.一級(jí)接菌:摸索完條件的表達(dá)菌進(jìn)行接菌3管,每管5ml??剐裕号囵B(yǎng)基=1:1000,菌液:培養(yǎng)基=1:100。(菌液為針對(duì)可溶條件的小量保菌液)步驟如上。37℃,120rpm,過夜搖菌。.標(biāo)準(zhǔn)保菌:100gL滅菌甘油加入700gL過夜菌?;靹?,-20℃保存。(寫好名稱日期,如上,放入表達(dá)菌的庫中).二級(jí)接菌:對(duì)大瓶進(jìn)行接菌,抗性:培養(yǎng)基1:1000,菌液:培養(yǎng)基=1:100。即每瓶5ml。.搖菌:37℃,180rpm,搖到對(duì)數(shù)期,搖到菌的對(duì)數(shù)期(OD600值0.4-0.6),時(shí)間大概2-3h??梢阅:目吹绞旨纯?。(注意在搖過程中隨時(shí)觀察狀態(tài),不要搖過).誘導(dǎo):依據(jù)摸索好的條件進(jìn)行誘導(dǎo)。(十三)大量誘導(dǎo)的收菌:.50ml離心管滅菌烘干,待用。.找出兩個(gè)50ml離心管,管蓋和管壁上做標(biāo)記,并稱重。.6個(gè)50ml離心管(包括稱重的兩個(gè)),倒入菌液(40—45ml)。配平,離心7000rpm,10min。.倒掉上清,用1xPBS把菌重懸,離心7000rpm,10min。.重復(fù)4。.倒掉上清,稱菌體的重量。.懸菌。1g菌體加入35ml的純化時(shí)用的上樣緩沖液懸起。-20℃保存。(十四)大量表達(dá)菌的超聲.把表達(dá)菌從-20℃拿出,在流水中融化。.把完全融化的表達(dá)菌,放入小燒杯中準(zhǔn)備超聲。.將超聲儀打開預(yù)熱20min,并準(zhǔn)備冰盒。.將呈菌液的小燒杯放入冰盒進(jìn)行超聲,超聲效率為 30—50HZ,超聲3s,停5s。直到菌液超澄清,呈現(xiàn)雞蛋清色。(一般超20-30min,注意不要吵時(shí)間太長(zhǎng),使菌超糊).將超開的菌液進(jìn)行離心,13000rpm,10min。.將上清收集在滅菌的50ml離心管中,進(jìn)行純化。五.促進(jìn)原核表達(dá)的蛋白可溶的方法:一般來說,人們認(rèn)為包涵體的形成是因?yàn)樾律嚯逆湶荒茉谡_位置形成二硫鍵,二硫鍵錯(cuò)配,進(jìn)而錯(cuò)誤折疊的結(jié)果。而IPTG濃度越低,溫度越低,一般蛋白的可溶性越大,因?yàn)檫@樣的條件下,可以減慢蛋白的形成,減少蛋白的二硫鍵錯(cuò)配,從而促進(jìn)蛋白的可溶。.使蛋白可溶的條件并不是固定的,一般來說,以上條件就可是蛋白可溶(有時(shí)2/4條件可以把IPTG濃度提的高一點(diǎn))。但如果仍不可溶的話,可以試一下0.025mmol/L,常溫,過夜誘導(dǎo)。這種條件是IPTG使用量的最小濃度,可以使包涵體部分可溶。.180rpm搖菌搖對(duì)數(shù)時(shí),不要搖過。對(duì)數(shù)期時(shí),是表達(dá)菌產(chǎn)蛋白的最佳時(shí)期。表達(dá)菌濃度太大,對(duì)菌中蛋白的可溶性影響會(huì)很大。所以在搖菌到 2h后,一定密切關(guān)注菌的濃度,隨時(shí)用分光光度計(jì)測(cè)od600值。這就意味著在接菌時(shí),多接一些菌(由實(shí)際情況而定)。.蛋白的可溶與表達(dá)菌也有關(guān)系。菌株內(nèi)源的蛋白酶過多,可能會(huì)造成外源表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定,所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成為理想的起始表達(dá)菌株??胺Q經(jīng)典的 BL21系列就是lon和ompT10蛋白酶缺陷型,也是我們非常熟悉的表達(dá)菌株。大名鼎鼎的 BL21①E3)融源菌則是添加T7聚合酶基因,為T7表達(dá)系統(tǒng)而設(shè)計(jì)。BL21(DE3)即我們做表達(dá)是常用的表達(dá)菌。真核細(xì)胞偏愛的密碼子和原核系統(tǒng)有不同,因此,在用原核系統(tǒng)表達(dá)真核基因的時(shí)候,真核基因中的一些密碼子對(duì)于原核細(xì)胞來說可能是稀有密碼子,從而導(dǎo)致表達(dá)效率和表達(dá)水平很低。改造基因是比較麻煩的做法, Rosetta2系列就是更好的選擇一一這種攜帶pRARE2質(zhì)粒的BL21衍生菌,補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的七種(AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA及CGG)稀有密碼子對(duì)應(yīng)的tRNA,提高外源基因、尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平。(已經(jīng)攜帶有氯霉素抗性質(zhì)粒)當(dāng)要表達(dá)的蛋白質(zhì)需要形成二硫鍵以形成正確的折疊時(shí),可以選擇 K-12衍生菌Origami2系列,thioredoxinreductase(trxB)和glutathionereductase(gor)兩條主要還原途徑雙突變菌株,顯著提高細(xì)胞質(zhì)中二硫鍵形成幾率,促進(jìn)蛋白可溶性及活性表達(dá)。(卡那霉素敏感)Rosetta-gami?2則是綜合上述兩類菌株的優(yōu)點(diǎn),既補(bǔ)充7種稀有密碼子,又能夠促進(jìn)二硫鍵的形成,幫助表達(dá)需要借助二硫鍵形成正確折疊構(gòu)象的真核蛋白。(卡那霉素敏感)OrigamiB是衍生自lacZY突變的BL21菌株,這個(gè)突變能根據(jù)IPTG的濃度精確調(diào)節(jié)表達(dá)產(chǎn)物,使得表達(dá)產(chǎn)物量呈現(xiàn) IPTG濃度依賴性。(四環(huán)素敏感)在決定試用這些名字古怪的菌株時(shí),有幾個(gè)小Tips是要注意的,一個(gè)是不同菌株有時(shí)已經(jīng)攜帶某個(gè)質(zhì)?;蛘咭呀?jīng)具有某種抗生素抗性,要注意自己的表達(dá)質(zhì)粒是否能與之兼容。比如Rosetta2已經(jīng)攜帶有氯霉素抗性質(zhì)粒,不能再用氯霉素篩選等等?,F(xiàn)象可能原因改進(jìn)方案建議菌株無蛋白表達(dá)E.coli的密碼子偏移性補(bǔ)充稀有密碼子的tRNA;將稀有密碼子突變?yōu)槠胀ù竽c桿菌密碼子Rosetta2Rosetta-gami2Rosetta-gamiBRosettaBlue出現(xiàn)截短蛋白包涵體二硫鍵形成困難降低宿主胞質(zhì)的還原性;利用促進(jìn)二硫鍵形成的各種載體標(biāo)簽Origami2Rosetta-gami2Rosetta-gamiB表達(dá)過快,表達(dá)量過高控制優(yōu)化表達(dá)水平:降溫,IPTG濃度優(yōu)化TunerRosetta-gamiB蛋白無活性蛋白錯(cuò)誤折疊降低宿主胞質(zhì)的還原性;利用促進(jìn)二硫鍵形成的各種載體標(biāo)簽Origami2Rosetta-gami2Rosetta-gamiB控制優(yōu)化表達(dá)水平:降溫,IPTG濃度優(yōu)化更嚴(yán)格的本底表達(dá)控制TunerRosetta-gamiBpLysS菌株細(xì)胞死亡,生長(zhǎng)極困難毒性蛋白無克隆生長(zhǎng)過高本底表達(dá)更嚴(yán)格的本底表達(dá)控制pLysS、pLysE菌株4.若實(shí)在不可溶,只能把蛋白截短,這樣可溶性會(huì)明顯增加。11六.SDS的相關(guān)技巧:1.SDS電泳的原理:SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn) SDS(十二烷基硫酸鈉),SDS會(huì)與變性的多肽,并使蛋白帶負(fù)電荷,由于多肽結(jié)合 SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無關(guān),因此 SDS多肽復(fù)合物在丙稀酰胺凝膠電泳中的遷移率只與多肽的大小有關(guān),在達(dá)到飽和的狀態(tài)下,每克多肽可與 1.4g去污劑結(jié)合。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí),蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系,符合下式:logMW=K-bX,式中:MW為分子量,X為遷移率,k、b均為常數(shù),若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖, 可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線,未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳,根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。SDS電泳遇到的相關(guān)問題及解答。(1

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