Chapter 1緒論 and 2細(xì)胞破碎

生物分離工程

主講：張媛媛MPmail:zyy800928@本課程教材及參考書目孫彥第二版嚴(yán)?？涤峥√谋菊n程的主要內(nèi)容1緒論2細(xì)胞分離與破碎3初級分離4膜分離5萃取6吸附分離技術(shù)和理論7液相色譜8親和色譜9電泳和電色譜第一章緒論第一節(jié)生物技術(shù)與生物分離

生物技術(shù)（biotechnology)

有機(jī)體的操作和應(yīng)用有機(jī)體生產(chǎn)有用物質(zhì)、改善人類生存環(huán)境的技術(shù)

生物技術(shù)的主要目標(biāo)：生物物質(zhì)的高效生產(chǎn)生物加工過程（Bioprocess）？_____生物產(chǎn)物的生產(chǎn)過程生物加工過程上游技術(shù)：優(yōu)良生物物種選育,基因工程，細(xì)胞工程和生物反應(yīng)（酶反應(yīng)、微生物發(fā)酵、動植物細(xì)胞培養(yǎng)等）下游技術(shù)DownstreamProcessing

目標(biāo)產(chǎn)物的分離純化（目標(biāo)產(chǎn)物的提取、濃縮、純化及成品化）生物分離的基本概念

從生物材料、微生物的發(fā)酵液、生物反應(yīng)液或動植物細(xì)胞的培養(yǎng)液中分離并純化有關(guān)產(chǎn)品（如具有藥理活性作用的蛋白質(zhì)等）的過程，稱為生物分離，又稱下游加工過程。

生物分離（bioseparation)是生物技術(shù)的重要組成部分。生物下游加工在生物技術(shù)中的地位生物產(chǎn)品的特殊性、復(fù)雜性、和嚴(yán)格的質(zhì)量要求，導(dǎo)致下游加工過程的成本一般占整個生物加工過程成本的大部分。

例如：一般酶：占70％藥用酶：高達(dá)85％基因工程表達(dá)產(chǎn)物：85％-90％以上。

第二節(jié)生物物質(zhì)和生物分離生物物質(zhì)種類（按分子量大小分類）

小分子（Mass<1000D）：抗生素、有機(jī)酸、多肽類、脂類、氨基酸等

生物大分子（Mass>1000D）：酶、抗原、抗體、多肽、蛋白質(zhì)類

超大分子（Mass106-107）：病毒、質(zhì)粒DNA等

細(xì)胞及生物體組織：疫苗、菌苗、胎盤組織液生物物質(zhì)種類（按發(fā)酵時目的產(chǎn)物所在的位置分類）

cell內(nèi)產(chǎn)物：胰島素、白細(xì)胞介素、干擾素、重組蛋白質(zhì)（大腸桿菌表達(dá)）、胞內(nèi)酶

cell外產(chǎn)物：抗生素（青霉素、紅霉素）、胞外酶（α-淀粉酶）、重組蛋白（酵母菌、動物細(xì)胞表達(dá)）等

常見的生物產(chǎn)品氨基酸、酶類、多肽、蛋白質(zhì)、核酸、多糖、脂類、有機(jī)酸等生物物質(zhì)的用途

生物藥物、功能食品和添加劑、飼料、化妝品、精細(xì)生化產(chǎn)品、大宗生化產(chǎn)品、生物能源生物分離工程研究的重點(diǎn)生物產(chǎn)品的特點(diǎn)（1）目標(biāo)產(chǎn)物穩(wěn)定性差，易導(dǎo)致生物活性的降低甚至喪失（a

pH

,溫度;b酶作用，染菌）（2）生物材料組成復(fù)雜，目標(biāo)產(chǎn)物與其類似物常法難分離（3）原料液中目標(biāo)產(chǎn)物的濃度一般都很低，雜質(zhì)含量卻很高（4）對目標(biāo)產(chǎn)物的質(zhì)量要求高（藥品）原料液細(xì)胞分離(離心，過濾)細(xì)胞－胞內(nèi)產(chǎn)物路線一路線二細(xì)胞破碎碎片分離路線一A路線一B清液－胞外產(chǎn)物粗分離(沉淀分級、萃取、膜分離等純化(色譜、電泳、電色譜)脫鹽(凝膠過濾、超濾、離子交換濃縮(超濾)精制(結(jié)晶、干燥)包含體溶解(加鹽酸胍、脲)復(fù)性生物分離過程的一般流程：發(fā)酵法生產(chǎn)L-異亮氨酸工藝路線

（1）活性：須設(shè)計(jì)合理的分離過程和操作條件，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的快速分離純化，獲得高活性目標(biāo)產(chǎn)品；

（2）安全性：須除去有害人類健康的物質(zhì)（如熱原及具有免疫原性的異體蛋白等）并防止其從外界混入；

（3）純度：須優(yōu)化設(shè)計(jì)分離過程和各分離操作，采用高效分離純化技術(shù)，以除去難分離雜質(zhì)（包括目標(biāo)產(chǎn)物類似物及其異構(gòu)體）；

（4）濃度：需對原料液進(jìn)行高度濃縮，以致下游加工過程的成本顯著增大。第三節(jié)生物分離過程的特點(diǎn)

第四節(jié)生物分離技術(shù)和原理溶質(zhì)分離的本質(zhì)：有效識別混合物中不同溶質(zhì)間物理、化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)的差別，利用能夠識別這些差別的分離介質(zhì)和（或）擴(kuò)大這些差別的分離設(shè)備實(shí)現(xiàn)溶質(zhì)間的分離或目標(biāo)組分的純化。物質(zhì)的性質(zhì)包括以下幾個方面：物理學(xué)性質(zhì)1)力學(xué)性質(zhì)：密度、大小、形狀（重力沉降、離心、過濾、膜分離）2)熱力學(xué)性質(zhì)：溶解度、揮發(fā)度、表面活性、相間分配平衡（萃取、結(jié)晶、沉淀、泡沫分離、吸附和離子交換）3）傳質(zhì)性質(zhì)：粘度、分子擴(kuò)散和熱擴(kuò)散（應(yīng)用少）4）電磁性質(zhì)：荷電性質(zhì)、電荷分布、等電點(diǎn)、磁性（電泳、電滲析、離子交換、電色譜）化學(xué)性質(zhì)

利用化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行分離（化學(xué)吸附和化學(xué)吸收）生物學(xué)性質(zhì)（生物分離特有的）生物分子間的分子識別作用、立體選擇性（親和色譜、手性分子的修飾）生物分離技術(shù)的分類平衡分離差速分離分離操作平衡分離（擴(kuò)散分離）差速分離原理：利用外力驅(qū)動溶質(zhì)遷移產(chǎn)生的速度差異傳質(zhì)推動力：有壓力差、重力、離心力、電位梯度和磁場梯度等；分離方法：超濾、反滲透、電滲析、電泳、機(jī)械分離法（過濾、重力沉降和離心沉降）原理：溶質(zhì)在兩相（氣液、氣固、液液、液固）間分配平衡的差異傳質(zhì)推動力：溶質(zhì)偏離平衡態(tài)的濃度差方法：萃取、結(jié)晶（沉淀）、吸附和離子交換等生物分離操作的策略1)需利用基于不同原理的多步分離操作的串聯(lián)或組合2)平衡分離技術(shù)（萃取、沉淀等）多采用多級分離操作提高分離效率。（差速分離如膜分離亦可）3)需根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物性質(zhì)和共存雜質(zhì)的性質(zhì)選擇最佳分離方法（高純度、高收率、低成本）第五節(jié)

生物分離效率分離效率可從兩個方面來評價：分離方法和設(shè)備分離過程和產(chǎn)品對分離方法和設(shè)備的評價指標(biāo)（針對特定分離方法或設(shè)備：離心、膜分離、萃取、色譜）分離容量（capacity)單位體積的分離設(shè)備（或分離介質(zhì)）處理料液或目標(biāo)產(chǎn)物的體積或質(zhì)量分離速度(speed)單批次分離所需時間，或連續(xù)分離過程的進(jìn)料速度，批次時間越短，分離速度越快分辨率(resolution)目標(biāo)產(chǎn)品的純化效果或雜質(zhì)的去除能力具體要求：高容量、高速度、高分辨率對分離過程和產(chǎn)品的評價指標(biāo)濃縮程度分離純化程度回收率濃縮程度用濃縮率（m）表達(dá)，是評價以濃縮為目的的分離過程的最重要指標(biāo)CTP產(chǎn)品中目標(biāo)產(chǎn)物的濃度CTC原料中目標(biāo)產(chǎn)物的濃度X表示雜質(zhì)T表示目標(biāo)產(chǎn)物意義：1）如mT>1，則目標(biāo)產(chǎn)物得到富積；2）如mT=mX，則目標(biāo)產(chǎn)物未得到分離純化。分離純化程度用分離因子（seperationfactor)

表達(dá),又稱分離系數(shù)。適用于蒸餾、萃取等平衡分離過程適用于連續(xù)穩(wěn)態(tài)分離對于具有生物活性的蛋白質(zhì)或酶，常常用分離純化前后目標(biāo)產(chǎn)物的比活A(yù)[U/mg]之比表示目標(biāo)產(chǎn)物的分離純化程度，意義：A、目標(biāo)產(chǎn)物濃度，雜質(zhì)濃度，則分離因子大，分離效率；B、=1時，則目標(biāo)產(chǎn)物未得到分離純化回收率：目標(biāo)產(chǎn)物回收的比例連續(xù)操作間歇操作生物分離工程研究的根本任務(wù)1）分離方法、分離介質(zhì)和設(shè)備2）設(shè)計(jì)和優(yōu)化分離過程，提高分離效率，減少分離步驟，縮短分離時間，實(shí)現(xiàn)高純度，高收率，低成本的分離目標(biāo)第二章細(xì)胞分離與破碎一、重力沉降球形粒子的Stokes沉降速度（流體流動處于滯留區(qū)）其中：Re為雷諾準(zhǔn)數(shù)；為阻力系數(shù)；d為顆粒粒徑；L為液體粘度；s和L分別表示顆粒密度和液體密度。第一節(jié)細(xì)胞分離（2.6）菌體細(xì)胞重力沉降速度符合式（2.6）單一粒子的沉降速度顆粒濃度較大時的沉降速度（2.6）（2.6a）菌體和動植物細(xì)胞的重力沉降特點(diǎn)：菌體細(xì)胞體積小，沉降速度慢。提高沉降速度的方法：凝聚：加入中性鹽（降低菌體表面雙電層排斥電位，使菌體凝聚）絮凝：加入高分子絮凝劑：如聚丙烯酰胺或聚乙烯亞胺（使菌體間產(chǎn)生架橋作用，形成較大凝聚顆粒）發(fā)酵液預(yù)處理的方法（補(bǔ)充）凝聚技術(shù)：指在電解質(zhì)作用下，由于膠粒之間雙電層電排斥作用降低，電位下降，而使膠體體系不穩(wěn)定的現(xiàn)象

常用凝聚劑：Al2(SO4)3.18H2O(明礬)，AlCl3.6H2O，F(xiàn)eCl3，ZnSO4，MgCO3絮凝技術(shù)：指在某些高分子絮凝劑存在下，基于橋架作用，使膠粒形成較大絮凝團(tuán)的過程。

常用絮凝劑：

a.聚丙烯酰胺（Polyacrylamide）b.苯乙烯類衍生物及其無機(jī)高分子聚合物絮凝劑c.天然有機(jī)高分子絮凝劑(明膠、海藻酸鈉、甲殼素、右旋糖苷)實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)生產(chǎn)中最廣泛應(yīng)用的非均相分離手段適用于菌體和細(xì)胞的回收或除去用于血球、胞內(nèi)細(xì)胞器、病毒以及蛋白質(zhì)的分離也廣泛用于液液相分離二、離心沉降離心沉降速度其中：r為離心半徑；為旋轉(zhuǎn)角速度；N為離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)；Zg離心加速度；S為沉降系數(shù)，是溶劑物性的函數(shù)。離心分離法差速離心分級（Differentialcentrifugation)定義：采用不同的離心速度和離心時間，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法。主要用于分離沉降系數(shù)差異較大的顆粒。應(yīng)用：生化工業(yè)中常用的離心方法，可用于收集或除去菌體細(xì)胞、沉淀的分離關(guān)鍵參數(shù)：離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)和時間區(qū)帶離心（Zonalcentrifugation)定義：在離心前于離心管內(nèi)先裝入密度梯度介質(zhì)（如蔗糖溶液等），樣品加于密度梯度之上，在一定離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上,形成不同區(qū)帶的分離方法主要用于分離沉降系數(shù)較接近的物質(zhì)也稱為密度梯度離心可用于蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的分離純化，但處理量小，一般僅限于實(shí)驗(yàn)室水平

根據(jù)分離原理，區(qū)帶離心分為：差速區(qū)帶離心和平衡區(qū)帶離心差速區(qū)帶離心：介質(zhì)密度梯度中的最大密度小于待分離目標(biāo)產(chǎn)物的密度，離心操作中，料液中的各個組份在密度梯度中以不同的速度沉降，根據(jù)各組份沉降系數(shù)的差別，形成各自的區(qū)帶。密度梯度介質(zhì)：蔗糖，CsCl（核酸的分離）和NaBr（脂蛋白的分離）等。平衡區(qū)帶離心（等密度梯度離心）：介質(zhì)的密度梯度包含待分離樣品中所有組分的密度，離心過程中各組分將逐步移至與其自身密度相等的溶劑密度處形成穩(wěn)定的區(qū)帶。

差速區(qū)帶離心與平衡區(qū)帶離心的區(qū)別

1、依據(jù)的原理不同差速區(qū)帶離心依據(jù)各組分沉降速率差異被分離；平衡區(qū)帶離心依據(jù)組分本身的密度差異被分離。2、介質(zhì)的密度梯度范圍不同差速區(qū)帶離心介質(zhì)的最大密度小于樣品中目標(biāo)產(chǎn)物的密度；平衡區(qū)帶離心介質(zhì)密度包含樣品各組分的密度。3、時間效應(yīng)不同差速區(qū)帶離心不能長時間離心；平衡區(qū)帶離心長時間離心將各組分停留在等密度位置形成穩(wěn)定區(qū)帶。離心分離設(shè)備分類據(jù)操作是否連續(xù)可分為：間歇式、連續(xù)式根據(jù)形式可分為：立式、臥式根據(jù)操作溫度可分為：常溫離心、冷凍離心機(jī)等根據(jù)離心力的大小可分為：低速（<8000rpm)、高速（1-2.5萬rpm）和超速離心機(jī)（2.5萬-12萬rpm）。

根據(jù)適用范圍：實(shí)驗(yàn)室用離心機(jī)（離心管式轉(zhuǎn)子離心機(jī)）和工業(yè)離心機(jī)（管式和碟片式離心機(jī)）大容量冷凍離心機(jī)臺式離心機(jī)高速冷凍離心機(jī)超速冷凍離心機(jī)離心機(jī)的種類和適用范圍項(xiàng)目低速高速超離轉(zhuǎn)速(×103rpm)2-610-2630-120離心力(×103g)2-78-80100-600適用范圍細(xì)胞適用適用適用細(xì)胞核適用適用適用細(xì)胞器－適用適用蛋白質(zhì)－－適用工業(yè)離心設(shè)備管式離心機(jī)（tubularbowlcentrifuge)碟片式離心機(jī)(disc-typebowlcentrifuge)管式離心機(jī)（圓筒式離心機(jī)）優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)速可達(dá)2萬r/min以上，離心力較大.可間歇操作，也可連續(xù)操作缺點(diǎn)：沉降面積小，處理能力較低管式離心機(jī)的處理能力為：其中：稱為離心沉降面積，是離心機(jī)結(jié)構(gòu)和操作條件的函數(shù)；

L為管長；r2為轉(zhuǎn)筒內(nèi)徑。碟片式離心機(jī)(分離板式離心機(jī))特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)復(fù)雜，離心轉(zhuǎn)速一般較管式離心機(jī)低，約1萬r/min。碟片的作用是縮短固體顆粒（或液滴）的沉降距離、擴(kuò)大轉(zhuǎn)鼓的沉降面積，提高處理能力。三、過濾（filtration)定義：利用多孔介質(zhì)（如濾布）截留固液懸浮液中的固體粒子，進(jìn)行固液分離的方法。過濾速度濾液的透過阻力來自兩個方面：（1）過濾介質(zhì)（2）濾餅濾餅阻力是主要因素過濾操作以壓力差為透過推動力其中：A為過濾面積；p為操作壓力；Q為濾液體積；L為濾液粘度；Rm和Rc分別為介質(zhì)和濾餅的阻力；濾液的透過速度：濾餅阻力是影響過濾操作的主要因素為濾餅的平均比阻；W為濾餅干重。不可壓縮性濾餅：為常數(shù)；可壓縮性濾餅：＝kpmm為可壓縮性濾餅的壓縮指數(shù)；助濾劑可使m減小濾餅阻力濾餅的特性微生物助濾劑（v/v,%)m面包酵母大腸桿菌0105000.450.340.280.79乳膠粒子00壓力

濾餅的平均比阻＝kpm過濾操作中非常敏感和重要的操作參數(shù)，特別是可壓縮性強(qiáng)（m值大）的濾餅，一般需緩慢增大操作壓力，最終壓力不超過0.3-0.4MPa減小濾餅阻力的措施

在過濾操作前，須對料液作以下處理：1）絮凝(高分子聚電解質(zhì)：聚丙烯酰胺類和聚乙烯亞胺）或凝聚劑（鋁、鐵的鹽類或石灰等)2）助濾劑（如硅藻土）

目的：改變料液性質(zhì)、降低濾餅阻力、提高過濾速度工業(yè)過濾設(shè)備

板框過濾機(jī)

加壓葉濾機(jī)

回轉(zhuǎn)真空過濾機(jī)

適用范圍廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)基制備的過濾及多種發(fā)酵液的固液分離。適合于固體含量1-10%的懸浮液的分離。優(yōu)點(diǎn)：過濾面積大，結(jié)構(gòu)簡單，價格低，動力消耗少，對不同過濾特性的發(fā)酵液適應(yīng)性強(qiáng)。缺點(diǎn)：不能連續(xù)操作，設(shè)備笨重，勞動強(qiáng)度大，衛(wèi)生條件差，非過濾的輔助時間較長。板框過濾機(jī)板框過濾機(jī)板框組合示意圖濾布濾框?yàn)V板濾布濾板與濾框之間加濾布，借手動螺桿或液壓機(jī)構(gòu)將其壓緊，兩相鄰濾布之間的框間為過濾空間回轉(zhuǎn)真空過濾機(jī)水平回轉(zhuǎn)真空過濾機(jī)特點(diǎn)：能自動連續(xù)操作、節(jié)省人力，過濾的適應(yīng)性好，能處理粘性、具可壓縮性濾餅及容易堵塞濾布的物料，但真空度受到熱液體或揮發(fā)性液體的蒸汽壓的限制，推動力小。設(shè)備費(fèi)用較貴。轉(zhuǎn)鼓真空過濾機(jī)加壓液濾機(jī)特點(diǎn)：在密封條件下過濾，適于無菌操作，機(jī)體裝卸簡單，洗滌容易。缺點(diǎn)：造價較高，過濾介質(zhì)更換復(fù)雜。高效密閉管袋式加壓過濾機(jī)第二節(jié)細(xì)胞破碎胞外產(chǎn)物：某些微生物在代謝過程中將產(chǎn)物分泌到細(xì)胞之外的液相中（稱胞外酶），如胰島素、某些細(xì)胞因子和疫苗亞單位成分等。胞內(nèi)產(chǎn)物某些微生物在代謝過程中產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)（胞內(nèi)酶）或重組DNA產(chǎn)品（非分泌型），需要應(yīng)用細(xì)胞破碎技術(shù)破碎細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物釋放到液相中真核細(xì)胞一、細(xì)胞的結(jié)構(gòu)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含豐富的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)簡單，無細(xì)胞核，一般由細(xì)胞質(zhì)和核糖體細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)原核和真核細(xì)胞細(xì)胞膜組成相同，均由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)構(gòu)成植物細(xì)胞植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞有細(xì)胞壁，破碎困難，需用強(qiáng)烈的破碎方法動物細(xì)胞動物細(xì)胞沒有細(xì)胞壁，只有細(xì)胞膜，易于破碎G+的細(xì)胞壁較厚，比G-陰性菌堅(jiān)固，較難破碎酵母的細(xì)胞壁比G+菌的細(xì)胞壁厚，更難破碎。不同種類的細(xì)胞破碎的難易程度：

植物細(xì)胞＞真菌（如酵母菌）＞革蘭氏陽性菌＞革蘭氏陰性菌＞動物細(xì)胞（由難到易）生物產(chǎn)物的胞內(nèi)位置細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等細(xì)胞器中。破碎細(xì)胞的目的：

使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜受到不同程度的破壞或破碎，釋放其中的目標(biāo)產(chǎn)物。二、細(xì)胞破碎原理機(jī)械破碎的原理

細(xì)胞在機(jī)械作用力下受到壓縮和剪切而破碎。細(xì)胞越小，所需壓縮或剪切力越大，越難破碎?；瘜W(xué)破碎的原理

又稱化學(xué)滲透，其原理是利用化學(xué)或生化試劑（酶）改變細(xì)胞壁或細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，增大胞內(nèi)物質(zhì)的溶出速率；或者完全溶解細(xì)胞壁，形成原生質(zhì)體后，在滲透壓作用下使細(xì)胞膜破裂而釋放胞內(nèi)物質(zhì)。細(xì)胞破碎機(jī)理示意圖細(xì)胞的破碎率：一般用目標(biāo)產(chǎn)物的釋放（溶解）速率價率影響破碎率的因素：破碎方法、細(xì)胞種類、目標(biāo)產(chǎn)物的胞內(nèi)位置三、細(xì)胞破碎技術(shù)機(jī)械破碎法1）高壓勻漿(High-pressurehomogenization)破碎原理：細(xì)胞懸液在高壓作用下從閥座與閥之間的環(huán)隙高速噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細(xì)胞受高速撞擊后，急劇釋放到低壓環(huán)境，從而在液相剪切力和撞擊力等綜合作用下破碎。各種形式的高壓勻漿器其中：S為細(xì)胞破碎率；p為操作壓力；N為循環(huán)操作次數(shù)；k為破碎速率常數(shù)，與細(xì)胞種類和操作溫度有關(guān)。主要影響因素：壓力、循環(huán)操作次數(shù)和溫度。高壓勻漿器的操作壓力一般為：50－70MPa高壓勻漿法的特點(diǎn)：適用于酵母和大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞的破碎。團(tuán)狀和絲狀菌易造成高壓勻漿器的堵塞，不宜使用此法。較小的G＋菌以及有些亞細(xì)胞器，質(zhì)地堅(jiān)硬，易損傷勻漿閥，也不適合用該法處理。

料液細(xì)胞濃度可達(dá)到200g/L左右。操作溫度上升約２-３℃/10MPa,需要對料液作冷卻處理,以保護(hù)目標(biāo)產(chǎn)物的生物活性2）珠磨破碎破碎原理：在攪拌漿的高速攪拌下，微珠高速運(yùn)動，細(xì)胞和微珠（玻璃小珠、石英砂或氧化鋁等）之間相互磨擦碰撞而破碎。(固相剪切力和撞擊力）主要影響因素：攪拌速度、細(xì)胞濃度、微球粒徑、密度、填充率和接觸時間等。其中：S為細(xì)胞破碎率；k為破碎速率常數(shù)，與微球粒徑、密度、填充率以及細(xì)胞濃度、攪拌速度和攪拌槳形狀等有關(guān)；t在間歇操作時為破碎操作時間，連續(xù)操作時t=V/Q(V為破碎室有效體積；Q為細(xì)胞懸液的流量）。珠膜的細(xì)胞破碎率隨細(xì)胞種類而異，但均隨攪拌速度和懸浮停留時間的增大而增大；對于一定的細(xì)胞，存在適宜的微珠粒徑，使細(xì)胞破碎率最高；細(xì)胞懸浮液濃度：60-120g/L(細(xì)菌），140-180g/L(酵母）破碎效果較理想。珠磨破碎的特點(diǎn)：適用于絕大多數(shù)微生物細(xì)胞的破碎，較高壓勻漿法適用范圍廣；有效能量利用率很低(1%)，設(shè)計(jì)操作時應(yīng)充分考慮冷卻系統(tǒng)的熱交換能力；影響破碎率的操作參數(shù)較多（球粒徑、密度、填充率以及細(xì)胞濃度、攪拌速度和攪拌槳形狀），過程優(yōu)化設(shè)計(jì)較復(fù)雜。3）噴霧撞擊破碎破碎原理：細(xì)胞懸液以噴霧狀高速冷凍后成為易于破碎的剛性球體，高速撞擊固定的撞擊板使其破碎。噴霧撞擊破碎的特點(diǎn)

細(xì)胞破碎均勻，避免過度破碎；可通過調(diào)節(jié)載氣壓力控制細(xì)胞破碎程度，避免細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，適用于細(xì)胞器（如線粒體、葉綠體）的回收；適用于大多數(shù)微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞的破碎；可處理的細(xì)胞懸浮液濃度為100-200g/L

4）超聲波破碎（ultrasonicdisruption)破碎原理：超聲波作用下液體發(fā)生空化作用，產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細(xì)胞破碎。影響因素：細(xì)胞種類、濃度和超聲波的能量等。特點(diǎn)：強(qiáng)烈的破碎方法，適用于多數(shù)微生物的破碎；操作過程產(chǎn)生大量的熱，需在冰水或外部冷卻的容器中進(jìn)行。對冷卻的要求相當(dāng)苛刻，不易放大，多在實(shí)驗(yàn)室使用?；瘜W(xué)和生物化學(xué)破碎法

1）酸堿處理調(diào)節(jié)PH值，改變蛋白質(zhì)的荷電性質(zhì)，使蛋白間或蛋白與其它物質(zhì)間的相互作用力降低，提高目標(biāo)產(chǎn)物的溶解度

2）化學(xué)試劑處理破碎原理：用表面活性劑、螯合劑、鹽或有機(jī)溶劑、等處理細(xì)胞，增大細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的通透性，或者用變性劑（脲或鹽酸胍等）降低胞內(nèi)物質(zhì)間相互作用，使目的產(chǎn)物易于釋放。3）酶溶

原理：利用溶解細(xì)胞壁的酶（如溶菌酶、纖維素酶）處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁部分或完全破壞，釋放胞內(nèi)產(chǎn)物。

自溶：通過調(diào)節(jié)溫度、PH值或添加有機(jī)溶劑，誘使細(xì)胞產(chǎn)生溶解自身的酶。（利用生物體自身產(chǎn)生的酶來溶胞，無需外加其他酶）。

酶試劑的選擇：不同的菌體細(xì)胞由于細(xì)胞壁化學(xué)組成不同應(yīng)選用不同的酶處理：細(xì)菌：溶菌酶；酵母細(xì)胞：-1,6-葡聚糖酶或甘露糖酶；植物細(xì)胞：纖維素酶。酶溶法的特點(diǎn)發(fā)生酶解的條件溫和能選擇性地釋放產(chǎn)物胞內(nèi)核酸等泄出量少，細(xì)胞外形較完整，便于后步分離酶水解價格高，故小規(guī)模應(yīng)用較廣機(jī)械破碎法與化學(xué)破碎法的比較機(jī)械破碎法優(yōu)點(diǎn)：處理量大、破碎效率高、速度快，適用于工業(yè)規(guī)模的細(xì)胞破碎。缺點(diǎn)：操作條件較劇烈，易造成細(xì)胞的過度破碎，不利于后處理?；瘜W(xué)破碎法優(yōu)點(diǎn)：選擇性高，胞內(nèi)產(chǎn)物的總釋放率低，料液粘度小，有利于后處理。缺點(diǎn)：適用范圍小，通用性差，破碎速度慢，處理時間長，破碎效率低，不適于大規(guī)模細(xì)胞破碎操作。將機(jī)械破碎法和化學(xué)破碎法結(jié)合，可大大提高破碎效率。

物理滲透法1）滲透壓沖擊法破碎原理：細(xì)胞在高滲透壓介質(zhì)（如一定濃度的甘