第2章蛋白質(zhì)的構(gòu)件-氨基酸

第2章

蛋白質(zhì)的構(gòu)件-氨基酸(aminoacid)一、蛋白質(zhì)的化學(xué)組成和分類1.元素組成蛋白質(zhì)是一類含氮有機(jī)化合物，除含有碳、氫、氧外，還有氮和少量的硫。某些蛋白質(zhì)還含有其他一些元素，主要是磷、鐵、碘、鋅和銅等。碳和氮元素在蛋白質(zhì)中的組成百分比約為：碳：50%;氮：16%。2.蛋白質(zhì)的估算平均含氮量約為16%，所以，可以根據(jù)樣品中的含氮量來計算蛋白質(zhì)的大概含量：蛋白質(zhì)含量=蛋白氮×6.253.氨基酸組成蛋白質(zhì)是由20種L-型α氨基酸組成的長鏈分子4.蛋白質(zhì)的分類1）按組成：簡單蛋白質(zhì)（表2－1）：綴合蛋白質(zhì)（表2－1）：（注意輔基的組成）2）按生物學(xué)功能分：酶、運(yùn)輸?shù)鞍住I養(yǎng)和貯存蛋白、激素、受體蛋白、運(yùn)動蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、防御蛋白等。3）按形狀和溶解度：纖維狀蛋白質(zhì)：不溶于水,結(jié)構(gòu)作用；球狀蛋白質(zhì)：易溶于水，細(xì)胞中大多屬可溶性蛋白；膜蛋白質(zhì)：不溶于水,與細(xì)胞的各種膜系統(tǒng)結(jié)合。酸水解：H2SO4或HCI能使蛋白質(zhì)完全水解；不引起消旋作用，但色氨酸完全被破壞，天冬酰胺、谷胺酰胺脫酰胺基；堿水解：NaOH能使蛋白質(zhì)完全水解；色氨酸穩(wěn)定，但大多數(shù)氨基酸遭破壞并引起消旋現(xiàn)象；酶水解：部分水解；不產(chǎn)生消旋，不破壞氨基酸；主要用于蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)分析，如：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等。二、蛋白質(zhì)的水解

三、氨基酸的一般結(jié)構(gòu)

結(jié)構(gòu)通式：與羧基相連的Cα上都有一個氨基，氫原子和可變的R基。如圖aa結(jié)構(gòu)通式：除Gly外

,Cα是不對稱C：1.具有兩種立體異構(gòu)體[D-型和L-型]2.具有旋光性[左旋（-）或右旋（+）]四、氨基酸的分類（一）基本氨基酸：組成蛋白質(zhì)的常見氨基酸（有20種）。（二）不常見的蛋白質(zhì)氨基酸：不常見但在某些蛋白質(zhì)中存在。是多肽合成后由基本aa經(jīng)酶促修飾而來(約10種)。（三）非蛋白質(zhì)氨基酸：存在于生物體內(nèi)但不參與蛋白質(zhì)組成的氨基酸(約200多種)。按R基的化學(xué)結(jié)構(gòu)：中性氨基酸1.脂肪族氨基酸含羥基或硫的氨基酸酸性氨基酸及其酰氨堿性氨基酸2.芳香族氨基酸3.雜環(huán)族氨基酸（一）

常見的蛋白質(zhì)氨基酸（20種）（1）中性氨基酸（5種，甘丙纈亮異）R基均為中性烷基，R基對分子酸堿性影響很小。Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性。1.脂肪族氨基酸（2）R中含有羥基和硫的氨基酸（共4種，絲蘇半甲硫）Cys的R中含巰基（-SH），具有重要性質(zhì)：兩個Cys的巰基氧化生成二硫鍵，生成胱氨酸。Met在生物合成中是一種重要的甲基供體（★）。（3）酸性氨基酸及其酰胺基團(tuán)（各2種，天谷酸酰胺）Asp和Glu是唯一在生理條件下帶有負(fù)電荷的的兩個氨基酸；（4）堿性氨基酸（2種，賴精脂肪酸）Arg是堿性最強(qiáng)的氨基酸，是動物體內(nèi)尿素形成的中間物。

2.芳香族氨基酸（3種，苯丙色酪香）苯丙氨酸酪氨酸色氨酸

3.雜環(huán)氨基酸（2種，雜環(huán)帶組脯）Pro的α-亞氨基是環(huán)的一部分，因此具有特殊的剛性結(jié)構(gòu)，一般出現(xiàn)在兩段α-螺旋之間的轉(zhuǎn)角處，Pro殘基所在的位置必然發(fā)生骨架方向的變化；His帶有咪唑基，是在生理pH條件下唯一具有緩沖能力的氨基酸。His在酶的酸堿催化機(jī)制中起重要作用。按R基的極性性質(zhì)：1.非極性R基氨基酸8（丙、纈、亮、異亮、脯、苯丙、色、甲硫）

2.不帶電荷的極性R基氨基酸7（甘、絲、蘇、半胱、酪、谷氨酰胺、天冬酰胺）

3.帶正電荷的R基氨基酸3（賴、精、組）

4.帶負(fù)電荷的R基氨基酸2（谷、天冬）極性

1.非極性R基氨基酸（8種）在水中的溶解度小，且在維持蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)（蛋白質(zhì)的疏水核心）中起著重要作用。2.不帶電荷的極性R基氨基酸（7種）這類氨基酸的側(cè)鏈都能與水形成氫鍵，因此很容易溶于水。羥基巰基酰胺基

3.帶負(fù)電荷的R基氨基酸（酸性氨基酸，2種）這兩種氨基酸都含有兩個羧基，并且第二個羧基在pH7左右也完全解離，因此分子帶負(fù)電荷。

4.帶正電荷的R基氨基酸（堿性氨基酸，3種）膠原蛋白中的Lys側(cè)鏈氧化時能形成很強(qiáng)的分子間(內(nèi))交聯(lián)。Arg堿性很強(qiáng)，與NaOH相當(dāng)。His是天然的緩沖劑，它往往存在于許多酶的活性中心。

（二）不常見的蛋白質(zhì)氨基酸也稱修飾氨基酸，是在蛋白質(zhì)合成后，由基本氨基酸修飾而來。4-羥脯氨酸和5-羥賴氨酸，這兩種氨基酸主要存在于結(jié)締組織的纖維狀蛋白中。（三）非蛋白質(zhì)氨基酸不組成蛋白質(zhì)，但有生理功能。（2）D-型氨基酸D-Glu、D-Ala（肽聚糖中）、D-Phe（短桿菌肽S）（3）β-、γ-、δ-氨基酸β-Ala（泛素的前體）、γ-氨基丁酸（神經(jīng)遞質(zhì)）。（一）氨基酸的解離氨基酸在晶體和水溶液中主要以兼性離子形式存在。氨基酸在兩性離子時，氨基是以質(zhì)子化(－NH3+)形式存在，羧基是以離解狀態(tài)(－COO-)存在。兩性離子既有酸的作用，又有堿的作用。五、氨基酸的酸堿性質(zhì)氨基酸的分部解離陽離子兩性離子陰離子

正電荷負(fù)電荷PH>PIPH<PIPH>PI等電點（PI)正電荷負(fù)電荷（二）氨基酸的等電點等電點：當(dāng)溶液濃度為某一pH值時，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-數(shù)目正好相等，凈電荷為0。這一pH值即為氨基酸的等電點，簡稱pI。在等電點時，氨基酸既不向正極也不向負(fù)極移動，即氨基酸處于兩性離子狀態(tài)，少數(shù)離解成數(shù)目相等的陰、陽離子。pH=pI時，氨基酸凈電荷為零；pH>pI時，氨基酸帶負(fù)電荷，－COOH解離成－COO-，向正極移動；pH<pI時，氨基酸帶正電荷，－NH2解離成－NH3+，向負(fù)極移動。

氨基酸的等電點可依其分子中氨基、羧基和R基的解離常數(shù)pKa值求出。解離常數(shù)(pKa)是水溶液中具有一定離解度的溶質(zhì)的的極性參數(shù)。氨基酸等電點的計算公式可分為下列情況：1.非極性R基氨基酸和不帶電荷的極性R基氨基酸（半胱氨酸除外）：pI=(pKa1+pKa2)/2

2.R基含有可解離基團(tuán)的氨基酸，其pI值也決定于兼性離子兩邊的pKa的算術(shù)平均值：

（1）酸性氨基酸：pI=(pKa1+pKR-COO-

)/2半胱氨酸（Cys)不屬酸性氨基酸，但其—SH具有弱酸性，在PH7.0時，Cys的—SH大約解離8%，故其PI按酸性氨基酸計算。

（2）堿性氨基酸：pI=(pKa2+pKR-NH2)/2例1：計算天冬氨酸的等電點pI解：根據(jù)等電點的定義，近似求出pI=（pKa1+pKR)/2=(2.09+3.86)/2=2.97例2：Glu的pKa1＝2.19，pKa2＝9.67，pKR-COOH＝4.25，則等電點為?(3.22)（一）α-羧基參加的反應(yīng)1.成酯反應(yīng)羧基被醇酯化后，形成相應(yīng)的酯。2.成酰氯反應(yīng)羧基可與五氯化磷或二氯亞砜反應(yīng)，生成酰氯，在多肽的人工合成中常用。3.成酰胺反應(yīng)六、氨基酸的化學(xué)反應(yīng)1.?；磻?yīng)

丹磺酰氯（5—二甲基氨基萘-1-磺酰氯，DNS-Cl）：常用于多肽鏈－NH2末端氨基酸的標(biāo)記和微量氨基酸的定量測定。（二）α-NH2參加的反應(yīng)

NGly—Ala—Ser—Leu—PheC

DNS—Gly—Ala—Ser—Leu—PheC水解產(chǎn)物：DNS—Gly、Ala、Ser、Leu、PheDNS-AA在紫外光激發(fā)后發(fā)黃色熒光。DNS

2.烴基化反應(yīng)

α-氨基中的氮是一個親核中心，能與烴基（包括環(huán)烴及其衍生物）發(fā)生親核取代反應(yīng)，如Edman反應(yīng)（可鑒定多肽的NH2末端氨基酸）。Edman反應(yīng)(苯異硫氰酸酯，PITC)產(chǎn)物：苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物（PTH-氨基酸），無色，可以用層析法分離鑒定。被Edman用來鑒定多肽的NH2末端氨基酸。（三）茚三酮反應(yīng)與茚三酮反應(yīng)（★）茚三酮在弱酸中與α-氨基酸共熱，引起氨基酸的氧化脫氨、脫羧反應(yīng)，最后，茚三酮與反應(yīng)產(chǎn)物——氨和還原茚三酮反應(yīng)，生成紫色物質(zhì)。氨基酸與茚三酮的反應(yīng)過程用紙層析和柱層析把各種氨基酸分開后，用茚三酮顯色可以定性鑒定，并在570nm定量測定各種氨基酸。Pro、Hy-Pro與茚三酮直接形成黃色化合物。（四）

側(cè)鏈官能團(tuán)的特異反應(yīng)—用于蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾氨基酸側(cè)鏈含有羥基、酚基、巰基、吲哚基、咪唑基、胍基、甲硫基等。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾：在溫和條件下，以可控制的方式使蛋白質(zhì)與某種試劑發(fā)生特異反應(yīng)，引起蛋白質(zhì)中個別氨基酸側(cè)鏈或功能團(tuán)發(fā)生共價化學(xué)改變。

Cys(－SH)鹵化烷（碘乙酸等）：保護(hù)巰基，防止重新被氧化；2—硝基苯甲酸：分光光度法定量測定巰基；易被氧化成胱氨酸胱氨酸的氧化（產(chǎn)物：磺基丙氨酸。氧化劑：過甲酸）胱氨酸的還原（產(chǎn)物：半胱氨酸。還原劑：巰基乙醇等）七、氨基酸的旋光性和光譜性質(zhì)（一）氨基酸的旋光性和立體化學(xué)1.氨基酸的構(gòu)型氨基酸構(gòu)型：L型、D型。除了蘇、異亮有四種光學(xué)異構(gòu)體,甘氨酸只為L型外，其余17種氨基酸有兩種光學(xué)異構(gòu)體：L型、D型。構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸均屬L-型。外消旋物：D-型和L-型的等摩爾混合物。L-蘇和D-蘇組成消旋物；L-別-蘇和D-別-蘇組成消旋物。2.氨基酸的旋光性氨基酸的旋光性（符號和大?。┤Q于它的R基的性質(zhì)，并與溶液的pH值有關(guān)。比旋是α－氨基酸的物理常數(shù)之一，蛋白質(zhì)中L型氨基酸的比旋光度見表2-3。Gly無手性C，無旋光性;

H2N—Cα—HCOOHH（二)氨基酸的光譜性質(zhì)氨基酸的光吸收性20種基本氨基酸在可見光區(qū)都沒有光吸收，在紅外區(qū)和遠(yuǎn)紫外區(qū)有光吸收。在近紫外區(qū)（200-400nm）只有芳香族氨基酸（Tyr、Phe、Trp的R基含有共軛雙鍵）有光吸收。λ（nm）εTyr2751.4×103Phe2572.0×102Trp2805.6×103

蛋白質(zhì)在280nm有最大紫外吸收光吸收，分光光度法鑒定。核磁共振（NMR）：在aa和Pro化學(xué)表征方面起重要作用。知識鏈接核磁共振(NMR)是電磁波（無線電波）與原子核自旋相互作用的一種基本物理現(xiàn)象。NMR波譜學(xué)具有最高的頻率分辨率。NMR曾經(jīng)使物理學(xué)家為之神魂顛倒，近二十年來越來越多的化學(xué)家、生物學(xué)家和醫(yī)學(xué)家也涉足其中。目前生物NMR波譜學(xué)研究的前沿領(lǐng)域包括：1.生物分子三維結(jié)構(gòu)的NMR測定方法和應(yīng)用2.生物分子相互作用、動力學(xué)及其與功能的關(guān)系研究方法和應(yīng)用3.基于NMR的代謝組學(xué)研究方法和應(yīng)用4.生物組織的高分辨NMR分析方法和應(yīng)用中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院核磁共振波譜實驗室：主要用多維核磁共振波譜及計算生物學(xué)研究與重大疾病或重要生理功能相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),動力學(xué)與功能關(guān)系,以及蛋白質(zhì)相互作用。蛋白質(zhì)因含有這些氨基酸，所以也有紫外吸收能力，一般在280nm波長處有最大光吸收，因此能利用紫外吸收法鑒定并測定樣品中蛋白質(zhì)的含量。分配原理固定相和流動相；混合物在層析系統(tǒng)中的分離決定于該混合物組分在兩相中的分配情況；分配系數(shù)；固—液、液—液、氣—液；（一）分配層析法：

分配系數(shù)Kd=CACBCA：一種物質(zhì)在A相（流動相）中的濃度

CB：一種物質(zhì)在B相（固定相）中的濃度八、氨基酸混合物的分離和分析原理：主要根據(jù)被分析的樣品（如aa混合物）在兩種互不相溶的溶劑中分配系數(shù)的不同而達(dá)到分離的目的。固定相和流動相基于分配系數(shù)差異的分離方法—分配層析1.柱層析2.紙層析3.薄層層析1、柱層析

層析柱中的填充劑或支持劑表面附著一層結(jié)合水作為固定相，沿固定相流過的與它互不相溶的溶劑是流動相。當(dāng)用洗脫劑洗脫時，柱上端的氨基酸混合物在兩相之間會按不同的分配系數(shù)以不同的速度向下移動。分部收集層析柱下端的洗脫液，然后分別用茚三酮顯色定量，以氨基酸量對洗脫液體積作圖得洗脫曲線，曲線中的每個峰相當(dāng)于某一種氨基酸。加洗脫劑氨基酸樣品支持劑層析柱分部收集1.00.50.1光吸收值

20406080100120流出液（毫升）2、紙層析

固定相：濾紙纖維素上吸附的水流動相：展層用的溶劑層析時，混合氨基酸在這兩相中不斷分配，使它們分布在濾紙的不同位置上?；静襟E：點樣、展層、顯色、定性（定量）層析時，將樣品點在濾紙的一個角上，稱為原點。然后將其放入一個密閉的容器中，用一種溶劑系統(tǒng)進(jìn)行展層，層析后烘干濾紙，再將其旋轉(zhuǎn)90度采用第二種溶劑系統(tǒng)進(jìn)行第二相展層。由于各種氨基