第六講病毒的檢測

病毒的檢測

內(nèi)容提要病毒的分離與鑒定病毒感染單位的測定病毒顆粒的檢測病毒的血清學(xué)檢測病毒核酸的檢測病毒的分離與鑒定病料的采集與準(zhǔn)備病毒的分離與培養(yǎng)病毒的理化特性測定病毒的血清學(xué)與分子生物學(xué)鑒定標(biāo)本采集殺滅雜菌（青鏈霉素）接種鑒定病毒種型易感動物出現(xiàn)病狀雞胚病變或死亡細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞病變?nèi)蠓椒ù蠖鄶?shù)革蘭氏陽性菌都對青霉素敏感（結(jié)核桿菌對青霉素不敏感）；而革蘭氏陰性菌則對青霉素不敏感（但奈瑟氏菌中的流行性腦膜炎雙球菌和淋病雙球菌對青霉素敏感），而對鏈霉素、氯霉素等敏感。所以首先區(qū)分病原菌是革蘭氏陽性菌還是陰性菌，在選擇抗生素方面意義重大。病料的采集與準(zhǔn)備病料采集部位需適當(dāng)一般可采集發(fā)病或死亡動物的組織病料、分泌物或糞便等，采樣因動物及病毒的種類而異。犬細(xì)小病毒或輪狀病毒腹瀉的幼犬或犢牛:糞便口蹄疫的豬或牛:水泡液及水泡皮流感病毒:拭子肺臟

病料采集后處理需適當(dāng)采集的器官或組織樣本如肺臟、腦、肝、脾、淋巴結(jié)等，可取一小塊進(jìn)行充分研磨，加入含青、鏈霉素的Hanks液，離心取上清液作為接種物；分泌物或滲出液、糞便拭子取樣鼻液、膿汁、乳液汁等分泌物或滲出液、糞便，應(yīng)加入高濃度的抗生素，充分混勻后，置4度冰箱內(nèi)處理2~4小時或過夜，離心后取上清作接種用；拭子在取樣后應(yīng)迅速將其浸泡入含有2%犢牛血清和一定濃度的青、鏈霉素的Hanks液中，充分涮洗棉拭子，反復(fù)凍融3~5次，離心后取上清液作為接種材料。病毒的分離與培養(yǎng)病毒是嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的生物，所以病毒的培養(yǎng)需要在活體內(nèi)進(jìn)行。細(xì)胞培養(yǎng)、雞胚和實驗動物原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞株和傳代細(xì)胞系細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)知識病毒嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生，培養(yǎng)病毒必須使用細(xì)胞。實驗動物、雞胚都擁有大量活的細(xì)胞，可用于病毒培養(yǎng)。尤其是SPF動物或SPF雞胚，目前仍然經(jīng)常供培養(yǎng)病毒之用，但是發(fā)展最快的技術(shù)是細(xì)胞培養(yǎng)。動物細(xì)胞培養(yǎng)一般流程原代細(xì)胞（primarycell）對病毒較易感，尤其是來源于胚胎或幼畜組織的細(xì)胞。二倍體細(xì)胞株（diploidcellstrain）將長成的原代細(xì)胞消化分散成單個細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)傳代，其細(xì)胞染色體數(shù)與原代細(xì)胞一樣，仍為二倍體。傳代細(xì)胞系（establishedcellline）來源于腫瘤組織或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，染色體數(shù)目不正常，為異倍體。HeLa（人子宮癌細(xì)胞）、Vero（非洲綠猴腎細(xì)胞）、BHK-21（乳倉鼠腎細(xì)胞）、PK-15（豬腎細(xì)胞）等，并有專門機構(gòu)負(fù)責(zé)鑒定和保管，如ATCC等細(xì)胞培養(yǎng)的類型細(xì)胞培養(yǎng)所需要的一般器材一般營養(yǎng)要求及培養(yǎng)條件培養(yǎng)基：狀態(tài):

液體培養(yǎng)液（動物細(xì)胞生活的液體環(huán)境）成分:

葡萄糖（滿足能量需求、作為細(xì)胞碳源）

氨基酸（合成蛋白質(zhì)）

無機鹽（重要的細(xì)胞組成物質(zhì)）

維生素、動物血清等（生長調(diào)節(jié)作用）條件:

恒溫（動物細(xì)胞生長溫度）

無菌條件（防止微生物污染）一般還需要一定濃度的二氧化碳血清的作用：

（1）提供有利于細(xì)胞生長增殖所需的激素、生長因子或提供合成培養(yǎng)基所缺乏的營養(yǎng)物質(zhì)。

（2）提供可識別金屬、激素、維生素和脂質(zhì)的結(jié)合蛋白，并通過與上述物質(zhì)的結(jié)合而起到穩(wěn)定和調(diào)節(jié)上述物質(zhì)的作用。此外結(jié)合蛋白還可消除某些毒素和金屬對細(xì)胞的毒性作用。

（3）提供貼壁細(xì)胞固著于適當(dāng)?shù)母街嫠璧馁N壁因子和擴(kuò)展因子。

（4）提供蛋白酶抑制劑，使細(xì)胞免受蛋白酶的損傷。

（5）提供PH緩沖物質(zhì)，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基PH。

（6）影響培養(yǎng)系統(tǒng)中的某些物理特性如：剪切力、黏度、滲透壓和氣體傳遞速度等。細(xì)胞培養(yǎng)的方法靜置培養(yǎng)（stationaryculture）封閉，靜置于恒溫箱內(nèi)，數(shù)天后細(xì)胞可生成貼壁的單層細(xì)胞。旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)（rollerculture）不同之處是要培養(yǎng)的細(xì)胞不是靜置，而是使之不斷緩慢旋轉(zhuǎn)（5~10r/h），經(jīng)過一段時間，細(xì)胞可在培養(yǎng)瓶（管）的四壁長滿單層。懸浮培養(yǎng)（suspensiveculture）通過攪拌使細(xì)胞處于懸浮狀態(tài)生長或維持存活。此法適用于某些不需要貼壁生長的細(xì)胞系，如NS-1（一種骨髓瘤細(xì)胞系），或作某種特殊研究之用。微載體培養(yǎng)（micro-carrierculture）是在懸浮培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，結(jié)合微載體的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。微載體是直徑100~35μm的微小顆粒，對細(xì)胞無毒性，細(xì)胞可貼附其上長成單層。由于微載體數(shù)量較大，所獲得的細(xì)胞數(shù)也比上述常規(guī)方法大為增加，對規(guī)?；募?xì)胞或疫苗生產(chǎn)很有吸引力，雖則增高了生產(chǎn)成本。細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用范疇（1）生產(chǎn)有重要價值的蛋白質(zhì)產(chǎn)品分泌性的蛋白質(zhì)產(chǎn)品（2）培養(yǎng)皮膚細(xì)胞用于移植形成組織（3）檢測有毒物質(zhì)致癌致畸引起染色體目和結(jié)構(gòu)改變

（4）理論研究:培養(yǎng)正?；虍惓＜?xì)胞用于生理、病理、藥理研究

(5)病毒的分離鑒定應(yīng)用舉例病毒對細(xì)胞的選擇性豬傳染性胃腸炎病毒初次分離最好用豬甲狀腺原代或二倍體細(xì)胞等培養(yǎng)。PRRSV僅在豬肺巨噬細(xì)胞、Marc-145細(xì)胞及非洲綠猴腎細(xì)胞系MA-104生長

PCV常用PK15細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)方法常用的有靜置培養(yǎng)和旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)產(chǎn)率更高大部分的病毒以靜置培養(yǎng)為主如輪狀病毒，初次分離時旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)成功率較靜置培養(yǎng)為高。SARS-CoVinvariouscelllinesRD293HeLaA:正常A72細(xì)胞(A72);B:CCV感染后，導(dǎo)致的合胞體細(xì)胞(a)及凋亡現(xiàn)象(b)AabB圖3426-1雞胚接種途徑示意圖（據(jù)Flint等）雞胚依據(jù)不同的病毒種類，選擇適當(dāng)?shù)慕臃N途徑，通常接種尿囊腔，如新城疫病毒等。特殊情況可接種包括卵黃囊、絨毛尿囊膜和羊膜腔等，如雞痘病毒接種絨尿膜。實驗動物病毒的理化特性測定

病毒核酸型鑒定是病毒理化特性測定的最主要指標(biāo)。代謝抑制法，即添加氟脫氧尿核苷（FUDR）病毒復(fù)制被抑制者，即為DNA病毒，否則為RNA病毒。DNA酶或RNA酶分別作用，以判定核酸的性質(zhì)。綠豆芽酶（Mungbeannuclease）可降解單股核酸，用它可進(jìn)一步鑒定核酸是單股或雙股。直接用純化的病毒核酸通過電子顯微鏡觀察PCR核酸測序技術(shù)脂溶性試驗用乙醚或氯仿處理待檢病毒液，而后與未處理者比較其TCID50的變化，以判斷是否敏感,從而判定是否為有囊膜病毒空斑試驗病毒樣本接種吸附于單層細(xì)胞細(xì)胞上覆蓋一層含營養(yǎng)液的瓊脂感染病毒的細(xì)胞及病毒擴(kuò)散的周圍細(xì)胞形成空斑或蝕斑（plaque）空斑形成單位（PFU）僅計數(shù)含20-100個空斑的培養(yǎng)板。VirusPlaques病毒的空斑（據(jù)Madigan等）病毒空斑單層細(xì)胞高稀釋度低稀釋度終點稀釋法終點稀釋法（Endpointdilutionassay）用于測定幾乎所有種類的病毒滴度，包括某些不能形成空斑的病毒，并可用以確定病毒對動物的毒力或毒價。使用細(xì)胞培養(yǎng)，可通過CPE來判定組織培養(yǎng)半數(shù)感染量（TCID50）。病毒顆粒的檢測電子顯微鏡技術(shù)

最直觀的方法是用電子顯微鏡（Electronmicroscopy，EM）觀察病毒顆粒。電子顯微鏡觀察法可放大數(shù)十萬倍，能觀察1nm的微粒。一些含毒量高的病毒樣本，如糞樣、鼻拭子浸液或組織勻漿液，可用EM檢出病毒?？捎昧祖u酸鹽等重金屬鹽直接作負(fù)染而后觀察，器官組織樣本則須作超薄切片后再作負(fù)染觀察。前者適用于觀察病毒的表面結(jié)構(gòu)如口瘡病毒等，后者則可觀察細(xì)胞內(nèi)的病毒結(jié)構(gòu)，如冠狀病毒、反錄病毒在組織中出芽的病毒顆粒等。血凝試驗（Hemagglutinationassay）許多動物病毒，如正黏病毒科、副黏病毒科、腺病毒科的成員，能夠凝集某些種類動物（如雞、小鼠、豚鼠、人）的紅細(xì)胞。這些病毒含有可與紅細(xì)胞結(jié)合的蛋白質(zhì)，如禽流感病毒的囊膜上有一種稱為血凝素的糖蛋白，可與紅細(xì)胞表面的N乙酰神經(jīng)氨酸糖蛋白結(jié)合，引起紅細(xì)胞凝集。利用這種特性，可作血凝試驗來檢測這些病毒的存在。一般將病毒液在血凝反應(yīng)板上作倍比稀釋，加入紅細(xì)胞未凝集的紅細(xì)胞呈圓點或紐扣狀沉于孔底

凝集的紅細(xì)胞彌漫性格狀復(fù)蓋整個孔

血凝試驗血凝抑制試驗血清學(xué)檢測病毒中和試驗（Virusneutralization）針對病毒的一些蛋白質(zhì)抗原或抗原表位的抗體與病毒結(jié)合后可以中和病毒的感染性。病毒中和試驗可以在細(xì)胞培養(yǎng)、雞胚或動物上進(jìn)行，一般將抗體作稀釋，與一定量的病毒混合，然后檢測其在細(xì)胞培養(yǎng)、雞胚或動物上的殘余感染性。終點是以抑制細(xì)胞病變（細(xì)胞培養(yǎng)）或病毒復(fù)制（雞胚或動物）的抗體最高稀釋度來表示。中和試驗具有很強的特異性，是檢測病毒和新分離病毒毒株的鑒定最經(jīng)典的方法，也可用于檢測病毒感染動物血清中的抗體。補體結(jié)合試驗（Complementfixation）補體結(jié)合試驗可以用于檢測動物血清中的病毒抗體。病毒抗原與抗體的相互反應(yīng)可以引起補體結(jié)合，最終可導(dǎo)致膜溶解。在補體結(jié)合試驗中，利用紅細(xì)胞作為靶細(xì)胞，溶血系統(tǒng)作為指示系統(tǒng)，因紅細(xì)胞膜的溶解易于觀察到。如果存在抗體抗體結(jié)合反應(yīng)，補體結(jié)合將發(fā)生，后者利用加入結(jié)合紅細(xì)胞抗體（溶血素）的綿羊紅細(xì)胞可以檢測到。如果補體被病毒抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，則紅細(xì)胞仍然是完整的；相反，如果補體未被結(jié)合，紅細(xì)胞將在游離的補體的作用下被溶解。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）酶聯(lián)免疫吸附試驗可用于樣本中病毒的檢測和動物血清中病毒特異性抗體的檢測，檢測病毒抗原可采用夾心法和雙夾心法，檢測抗體可采用間接法。病毒核酸的檢測聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

原理:

設(shè)計PCR引物，檢測目的片段的大小，DNA測序，比對已知病毒序列。PCR可直接用于DNA病毒的檢測，如果是RNA病毒，則需在擴(kuò)增之前進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，即提取病毒RNA，加入反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA后，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，稱為RT-PCRM123465789101112131415161718192021bp750200010005001099RT-PCR主要適用于RNA病毒的檢測也可用于對DNA病毒等的轉(zhuǎn)錄水平的檢測核酸雜交

核酸雜交（Nucleicacidhybridization）包括DNA雜交和RNA雜交。前者即Southernblothybridization，用于檢測病毒DNA。RNA雜交即Northernblothybridization，用于病毒RNA的檢測，基本過程與DNA雜交相似。核酸雜交技術(shù)可用于細(xì)胞、組織中病毒基因組或轉(zhuǎn)錄本的定位檢測，即稱為原位雜交（insituhybridization）。標(biāo)本滴加硝酸纖維素膜加熱和堿處理變性標(biāo)記的核酸探針雜交放射自顯影或其他技術(shù)檢測DNA樣本經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化，凝膠電泳，變性，轉(zhuǎn)移到濾膜上，然后用放射性同位素標(biāo)記的病毒核酸序列探針檢測結(jié)合到固相濾膜上的DNA。目前放射性同位素標(biāo)記的核酸探針很少使用，而大多用非放射性標(biāo)記探針（如生物素標(biāo)記）進(jìn)行檢測。一種改良的方法，稱為斑點雜交，可用于樣本中病毒核酸的快速檢測。Southern和Northerin原理基本相同，都是利用DNA或RNA的復(fù)性過程，但過程上也有區(qū)別，主要是Southern是先電泳后變性，而Northern是先變性后電泳；Southern是堿變性，而Northern采用甲醛、乙二醛、二甲基亞砜等變性，因為采用堿變性會導(dǎo)致RNA水解。Southernblot是分析DNA的雜交技術(shù)，Northernblot是分析RNA的，而Westernblot是分析蛋白質(zhì)的。

SorthernBlot探針是一小段單鏈DNA或者RNA片段（大約是20到500bp），用于檢測與其互補的核酸序列。雙鏈DNA加熱變性成為單