磁共振示蹤技術(shù)檢測膠質(zhì)瘤給藥過程,腫瘤學(xué)論文

磁共振示蹤技術(shù)檢測膠質(zhì)瘤給藥過程,腫瘤學(xué)論文膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性腦腫瘤，占惡性腦腫瘤的81%。膠質(zhì)瘤通常會導(dǎo)致顯著的致殘率和死亡率。在過去的幾十年中，治療方式方法不斷改良。當(dāng)前，放療聯(lián)合化療是手術(shù)后的一線輔助治療。然而，幾乎所有的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者在7～10個月無進(jìn)展生存期中位期后都會出現(xiàn)病情進(jìn)展。因而，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤總體上難治且預(yù)后差。實(shí)際上大多數(shù)化療藥物不能通過血腦屏障，因此藥物到達(dá)腫瘤靶點(diǎn)的效率低下。研究人員相繼發(fā)明了眾多新的治療策略，華而不實(shí)局部給藥能夠直接繞過血腦屏障。局部給藥詳細(xì)包括，局部注射、對流加強(qiáng)給藥和各種埋置多聚物。局部給藥能夠?qū)⒏呱锢枚鹊闹苿┲苯幼饔糜诎悬c(diǎn)，而且?guī)缀鯖]有藥物損耗。然而，溶液回流和水腫等多種副作用阻礙了對流加強(qiáng)給藥(CED)發(fā)展成一個用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療系統(tǒng)．為克制上述缺陷，人們建立了一種磁共振實(shí)時成像的方式方法來監(jiān)測給藥經(jīng)過，但卻沒有定量計算局部擴(kuò)散和去除參數(shù)。本課題組首先應(yīng)用磁共振示蹤技術(shù)定量測量了正常大鼠腦尾狀核、丘腦、枕葉皮質(zhì)和黑質(zhì)的擴(kuò)散和去除參數(shù)。本研究初次應(yīng)用磁共振示蹤技術(shù)定量比擬了C6膠質(zhì)瘤10d模型和20d模型擴(kuò)散和去除參數(shù)的差異，并且對影響擴(kuò)散和去除的細(xì)胞外基質(zhì)成分進(jìn)行了免疫組化和蛋白質(zhì)印跡分析比擬。1材料和方式方法1.1溶液制備和實(shí)驗(yàn)動物用雙蒸水稀釋釓二乙三胺五乙酸(Gd-DTPA，馬根維顯，拜耳先靈制藥，德國)至10mmol/L。本研究方案獲得了北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物倫理委員會的批準(zhǔn)(批號No．LA2020-016)。16只成年雄性SD大鼠，清潔級，體重(250～300)g，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2018-0012。實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號:SYXK(字)2018－0039。隨機(jī)分為兩組:10d膠質(zhì)瘤組(n=8)和20d膠質(zhì)瘤組(n=8)。C6大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(ATCCNo．CCL107)培養(yǎng)如以往報道。大鼠(n=8)經(jīng)腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉、乙醇、水合氯醛、硫酸鎂和丙二醇混合物(3mL/kg)麻醉后，固定于立體定位儀(Stoelting，美國)。在頭皮沿矢狀縫從兩耳間區(qū)域至兩眼間區(qū)域做正中切口，小心分離腦膜暴露前囟。右側(cè)顱骨外表定位鉆孔(前囟前，1mm;右旁開，3.5mm)。C6細(xì)胞懸液(5106cellsin10L)經(jīng)顱骨孔緩慢注入(10min)右側(cè)尾狀核(前囟前，1mm;右旁開，3.5mm;深，5.0mm)。微量進(jìn)樣器停針5min。顱骨孔用骨蠟封閉，頭皮縫合。1.2MRI示蹤法示蹤大鼠C6膠質(zhì)瘤模型細(xì)胞外間隙擴(kuò)散大鼠麻醉如前所述，實(shí)驗(yàn)經(jīng)過中適時追加保持麻醉狀態(tài)(約為0.7mL/kg/h)。大鼠置于加熱墊(380.5)C上保持體溫。預(yù)掃描將大鼠置于西門子磁共振成像(MagnetomTrio，Germany)系統(tǒng)腕線圈中，用T1加權(quán)三維磁化準(zhǔn)備快速采集梯度回波序列(T13DMP-RAGE)掃描。獲得用于圖像后處理的預(yù)掃描圖像并用于確定穿刺位點(diǎn)。大鼠顱頂備皮，碘伏消毒。沿矢狀縫從兩耳間區(qū)域至兩眼間區(qū)域開始皮，小心分離腦膜暴露前囟。將大鼠置于立體定位儀上，根據(jù)MRI預(yù)掃描結(jié)果顯示的腫瘤生長情況在顱骨外表重新定位鉆孔，向腫瘤中心區(qū)域微量注射10mmol/LGd-DTPA溶液2L(注射時間10min)。注射Gd-DTPA后不同時間點(diǎn)，15min、30min、第1、2、3、4、5、6小時行磁共振掃描成像。成像序列和參數(shù)如前所述。1.3圖像后處理和參數(shù)計算用MATLAB7.8軟件(MathWork，美國)將注射后掃描圖像與預(yù)掃描圖像配準(zhǔn)后獲得減影圖像。本課題組前期研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了3.0T磁共振機(jī)應(yīng)用T1加權(quán)3DMP-RAGE序列掃描的Gd-DTPA濃度與信號強(qiáng)度增量(SI)的線性關(guān)系。與以往的1/T1值與Gd-DTPA濃度關(guān)系相比更有利于實(shí)時成像計算。MRI示蹤法定量細(xì)胞外間隙擴(kuò)散的主要參數(shù)包括自由擴(kuò)散系數(shù)(D)，有效擴(kuò)散系數(shù)(D*)，迂曲度()和去除速率常數(shù)(k)．根據(jù)本課題組已經(jīng)報道的方式方法進(jìn)行參數(shù)計算。為測量腦組織間液流動參數(shù)半衰期(thalf-life)，將高于背景噪音兩個標(biāo)準(zhǔn)差的的信號強(qiáng)度作為閾值，逐層提取感興趣區(qū)內(nèi)的所有像素得到各掃描時間點(diǎn)Gd-DTPA總量(Gdsum)。由于Gd-DTPA在腦內(nèi)按一級動力學(xué)常數(shù)去除，Gd-DTPA的半衰期能夠通過曲線擬合得到(Gdsum=e－kt)，華而不實(shí)半衰期(thalf-life)根據(jù)thalf-life=ln(2/k)進(jìn)行計算?！緢D１、２略】1.4免疫組化選取典型的細(xì)胞外基質(zhì)大分子進(jìn)行免疫組化分析。5m石蠟切片脫蠟后，3%過氧化氫避光浸泡，抗原熱修復(fù)。分別滴加抗硫酸軟骨素蛋白多糖、腱生蛋白C、IV型膠原蛋白一抗(兔抗大鼠;1∶200;博奧森)，4℃過夜;加二抗常溫孵育30min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。1.5蛋白質(zhì)印跡(Westernblotting)將上述大分子用蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行檢測。腫瘤組織取材，參加裂解液勻漿后離心，各取上清液50g點(diǎn)樣于12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，用5%脫脂牛奶封閉。分別用硫酸軟骨素蛋白多糖抗體、腱生蛋白C抗體、抗IV型膠原蛋白(兔抗大鼠;1∶1000;博奧森)或抗GAPDH(1∶10000;博奧森)4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1h，洗膜后參加免疫印跡化學(xué)發(fā)光檢測試劑(enhancedchemiluminescence，ECL)，X光膠片曝光，ImageJ軟件(國立衛(wèi)生院，美國)分析。以GAPDH蛋白作為系統(tǒng)內(nèi)參，測定條帶進(jìn)行灰度值，以目的/內(nèi)參比值來比擬表示出的差異。1.6統(tǒng)計學(xué)方式方法統(tǒng)計分析采用SPSS軟件19.0版本進(jìn)行(IBM，美國)。所有結(jié)果均用均值標(biāo)準(zhǔn)差(SD)的形式表示。用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比擬兩組樣本的有效擴(kuò)散系數(shù)(D*)，迂曲度()，去除速率常數(shù)(k)和半衰期(thalf-life)。用配對樣本t檢驗(yàn)比擬兩組樣本的蛋白印跡分析。P值小于0.05(P＜0.05)為有統(tǒng)計學(xué)差異。2結(jié)果2.1膠質(zhì)瘤10d模型和膠質(zhì)瘤20d模型Gd-DTPA擴(kuò)散參數(shù)和半衰期的比擬MRI矢狀位、橫軸位和冠狀位三個方向顯示不同時間點(diǎn)Gd-DTPA的擴(kuò)散經(jīng)過(圖1和2);Gd-DTPA導(dǎo)入細(xì)胞外間隙后，局部信號強(qiáng)度增高，隨后信號強(qiáng)度隨時間衰減至示蹤劑從細(xì)胞外間隙中去除。20d膠質(zhì)瘤有效擴(kuò)散系數(shù)(D*)明顯小于10d膠質(zhì)瘤((6.671.78)10－5mm2/svs．(1.260.27)10－4mm2/s;t=4.265;P＜0.01)，導(dǎo)致迂曲度()增大(=(D/D*)1/2)((3.990.57)vs．(2.830.29);t=4.11;P＜0.01)(圖3A)。測量去除速率常數(shù)(k)，20d膠質(zhì)瘤((7.672.29)10－5mm2/s)小于10d膠質(zhì)瘤((1.460.36)10－4mm2/s)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.87;P＜0.05)(圖3A)。10d膠質(zhì)瘤半衰期(0.860.23h)顯著小于20d膠質(zhì)瘤(1.640.12h)(t=5.91;P＜0.01)(圖3B)。2.2膠質(zhì)瘤10d模型和20d模型細(xì)胞外基質(zhì)表示出的差異為了更好地理解上述擴(kuò)散參數(shù)(D*，和k)和半衰期(thalf-life)的差異，我們用免疫組化法觀察到20d膠質(zhì)瘤中硫酸軟骨素蛋白多糖、腱生蛋白C和IV型膠原蛋白的表示出(圖4B，4D和4F)均較10d膠質(zhì)瘤的表示出(圖4A，4C和4E，圖4見封三)增高。Westernblotting的定量結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)。硫酸軟骨素蛋白多糖(CSPGs/GAPDH)(圖5A)在20d膠質(zhì)瘤中(0.480.07)的表示出均高于在10d膠質(zhì)瘤中(0.320.09)的表示出(t=4.663;P＜0.01)，腱生蛋白C(Tenascin-C/GAPDH)亦然((0.290.04)vs．(0.580.11);t=6.50;P＜0.01)(圖5B)。20d膠質(zhì)瘤中IV型膠原蛋白(collagenIV/GAPDH)(圖5C)的含量也高于10d膠質(zhì)瘤((0.240.07)vs．(0.330.06);t=3.81;P＜0.05)。3討論眾所周知，磁共振擴(kuò)散加權(quán)成像(diffusion-weightedMRI)是一種能夠測量組織內(nèi)水分子擴(kuò)散的成像技術(shù)，是腦腫瘤分級和判定放化療療效方面的研究熱門。但是由于擴(kuò)散加權(quán)成像并不能區(qū)分細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的擴(kuò)散且空間分辨力低，因此難以用于指導(dǎo)腦內(nèi)局部給藥，實(shí)時磁共振示蹤技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。本研究應(yīng)用磁共振示蹤法定量研究了膠質(zhì)瘤模型在生長的第10天和第20天腫瘤細(xì)胞外間隙的有效擴(kuò)散系數(shù)(D*)，去除速率常數(shù)(k)和半衰期(thalf-life)等方面表現(xiàn)出了顯著的差異。這兩個時期的膠質(zhì)瘤細(xì)胞外擴(kuò)散和去除的所具有的不同特征與膠質(zhì)瘤細(xì)胞外基質(zhì)的不同相關(guān)。20d膠質(zhì)瘤細(xì)胞外基質(zhì)成分如硫酸軟骨素蛋白多糖，腱生蛋白C和IV型膠原蛋白的增加，與20d膠質(zhì)瘤有效擴(kuò)散系數(shù)、去除速率常數(shù)的較小和半衰期的延長相對應(yīng)。通常，腫瘤體積的增大是腫瘤進(jìn)展的重要標(biāo)志。腫瘤細(xì)胞植入后，腫瘤體積隨時間逐步增大，即為腫瘤進(jìn)展。腫瘤細(xì)胞外間隙的擴(kuò)散對于腫瘤細(xì)胞攝取營養(yǎng)物質(zhì)，和抗腫瘤藥物到達(dá)治療靶點(diǎn)作用于腫瘤都至關(guān)重要。細(xì)胞外基質(zhì)成分是影響腦腫瘤細(xì)胞外間隙擴(kuò)散的重要因素之一，能夠增加細(xì)胞外間隙粘滯度，降低擴(kuò)散速率。細(xì)胞外基質(zhì)的存在增加了分子運(yùn)動的粘滯阻力，使細(xì)胞外間隙不再是自由擴(kuò)散介質(zhì)。以往文獻(xiàn)報道，硫酸軟骨素蛋白多糖、腱生蛋白C和IV型膠原蛋白在膠質(zhì)瘤細(xì)胞外間隙中高表示出，并隨著腫瘤生長進(jìn)展含量逐步升高。本研究的結(jié)果與以往文獻(xiàn)報道一致。腦細(xì)胞外間隙占腦容積的20%，腦細(xì)胞間約50nm的空隙內(nèi)含細(xì)胞外基質(zhì)。當(dāng)前以為細(xì)胞外基質(zhì)成分可降低溶質(zhì)分子或膜相關(guān)分子的擴(kuò)散。膠質(zhì)瘤細(xì)胞外基質(zhì)分子種類較多，主要包括蛋白多糖、糖蛋白、膠原纖維等成分。本研究中的硫酸軟骨素蛋白多糖，腱生蛋白C和IV型膠原蛋白分別是上述三種主要成分的典型代表分子，在ECS中含量較高，介入構(gòu)成膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的微環(huán)境，并影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的進(jìn)展轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為，而遭到廣泛關(guān)注。另外由于幾種成分之間往往互相連接構(gòu)成復(fù)合構(gòu)造，所以選取典型細(xì)胞外基質(zhì)分子有助于對于膠質(zhì)瘤細(xì)胞外間隙的分析。本研究局限性在于只是選取了典型的細(xì)胞外基質(zhì)分子，將來需要對于細(xì)胞外基質(zhì)的各種分子對擴(kuò)散的影響進(jìn)行更全面的研究，并進(jìn)一步對不同類型膠質(zhì)瘤擴(kuò)散參數(shù)和細(xì)胞外基質(zhì)的表示出進(jìn)行定量研究。腫瘤分期是腫瘤學(xué)研究的基本內(nèi)容之一。國際抗癌聯(lián)盟(UICC)美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)的TNM分期系統(tǒng)是五十多年來評估腫瘤患者預(yù)后的參考。但是自第五版以來，TNM分期已不再包含原發(fā)性腦腫瘤的