基礎(chǔ)生物化學(xué)

第四章酶Enzyme酶的概念、命名、分類、化學(xué)本質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系酶的專一性和作用機制酶促反應(yīng)動力學(xué)酶的分離純化和活力測定第一節(jié)酶的概念、命名、分類P88人們對酶的認(rèn)識起源于生產(chǎn)與生活實踐：夏禹時代，人們掌握了釀酒技術(shù)。公元前12世紀(jì)周朝，人們釀酒，制作飴糖和醬。春秋戰(zhàn)國時期已知用麴(曲)治療消化不良的疾病?！懊刚?，酒母也”神的饋贈——古埃及制作面包的傳說尼羅河流域盛產(chǎn)小麥，古埃及人將小麥磨成粉，加入水、馬鈴薯及鹽拌在一起，擺在溫?zé)岬牡胤?，空氣中的酵母落入一塊未被烤過的面團中，面團竟慢慢地漲大起來，這種面團烤出來后非常松軟，從此人們便故意留一塊面團，讓酵母慢慢使它發(fā)大、變酸，再取一團作“面種”留待下次發(fā)面包。古埃及人只知道制作面包的方法，卻不懂得原理，一直認(rèn)為這是神在暗中幫忙，而認(rèn)定面包是“神的饋贈”一、酶的概念由細胞產(chǎn)生的、有高度專一性和高效催化作用的生物大分子酶具有復(fù)雜空間構(gòu)象，包括蛋白質(zhì)和核酸（核酶）二、酶的命名

1.習(xí)慣命名法。根據(jù)酶所催化的底物、酶的來源、酶反應(yīng)的最適溫度或pH、催化反應(yīng)的性質(zhì)來命名。舉例：淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶

2.系統(tǒng)命名法。底物1:底物2+反應(yīng)類型+酶。

舉例：轉(zhuǎn)氨酶的系統(tǒng)名稱為

丙氨酸：α-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶。三、酶的分類國際酶委員會（EnzymeCommission,EC）根據(jù)酶所催化的反應(yīng)，把酶分為六大類，分別以1、2、3、4、5、6的編號表示，各大類根據(jù)更具體的酶反應(yīng)性質(zhì)分為若干亞類、亞亞類。酶的分類催化反應(yīng)的通式舉例及說明1.氧化還原酶類AH2＋B→A＋BH2葡萄糖氧化酶、醇脫氫酶2.轉(zhuǎn)移酶類A－R＋B→A＋B－R谷丙轉(zhuǎn)氨酶3.水解酶類AB＋H2O→AOH＋BH如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等，是應(yīng)用最廣泛的一類酶。4.裂解（合）酶類AB→A＋B果膠裂解酶、醛縮酶5.異構(gòu)酶類A→B葡萄糖異構(gòu)酶6.合成酶類A＋B＋ATP→AB＋AD(M)P+P(P)i這類酶催化反應(yīng)時需要能量，如谷氨酰胺合成酶酶的分類編號由EC和四個數(shù)字組成，如胰蛋白酶（EC3.4.17.1）；6-磷酸葡萄糖酶（EC3.1.3.9）。四、酶的化學(xué)本質(zhì)——蛋白質(zhì)或核酸（目前為止）1926年J.B.Sumner首次從刀豆制備出脲酶結(jié)晶，證明其為蛋白質(zhì)，并提出酶的本質(zhì)就是蛋白質(zhì)的觀點。他因此獲得了1946年的諾貝爾化學(xué)獎。1982年T.Cech發(fā)現(xiàn)了第1個有催化活性的天然RNA——ribozyme（核酶），以后Altman和Pace等又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了真正的RNA催化劑。核酶的發(fā)現(xiàn)不僅表明生物催化劑不一定都是蛋白質(zhì)，還促進了有關(guān)生命起源、生物進化等問題的進一步探討。四、酶的組成酶單純酶:單純由蛋白質(zhì)組成結(jié)合酶（全酶）=酶蛋白+輔助因子（非蛋白質(zhì)成分）輔助因子與酶蛋白結(jié)合得不牢固，可用透析法分開的輔因子與酶蛋白結(jié)合牢固，不能用透析的方法去除輔酶：輔基：輔助因子可以是有機小分子，也可以是金屬離子酶的催化專一性主要決定于酶蛋白部分輔因子通常是作為電子、原子或某些化學(xué)基團的載體舉例：蘋果酸脫氫酶的輔酶NAD+舉例：細胞色素氧化酶的輔基鐵卟啉第二節(jié)酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系P103一、酶的活性部位和必需基團必需基團：與酶活性密切相關(guān)的基團。這些基團若經(jīng)化學(xué)修飾使其改變，則酶的活性喪失?；钚圆课唬ɑ钚灾行模好阜肿又兄苯优c底物結(jié)合，并和酶的催化作用有直接關(guān)系的部位。必需基團活性基團維持酶的空間結(jié)構(gòu)的基團結(jié)合基團催化基團專一性催化能力胰凝乳蛋白酶的活性部位與底物相結(jié)合二、酶原的激活細胞中許多酶（特別是一些水解酶）是以無活性的前體（酶原）的形式被合成的，隨著細胞催化功能的需要，這些前體被某些蛋白酶有限的水解，切除部分肽段后，就轉(zhuǎn)變成有活性的酶。這個過程稱為酶原的激活?；钚灾行娜?、同工酶（isozyme)同工酶是指能催化相同的化學(xué)反應(yīng)，但酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同的一組酶。生物為了調(diào)節(jié)某一化學(xué)反應(yīng)的速度，往往在不同的組織和不同的發(fā)育階段表達不同的同工酶。脊椎動物中乳酸脫氫酶的各種同工酶第三節(jié)酶的專一性和催化機制P99一、酶的專一性立體異構(gòu)專一性：當(dāng)?shù)孜锎嬖趦煞N立體異構(gòu)體時，酶只能作用于其中的一種。結(jié)構(gòu)專一性：指酶對底物結(jié)構(gòu)的要求，有些酶對底物的整體結(jié)構(gòu)有要求，有些酶只對底物的局部結(jié)構(gòu)有要求。結(jié)構(gòu)專一性絕對專一性相對專一性舉例：脲酶只能催化尿素水解為氨和碳酸舉例：己糖激酶能催化多種己糖（六碳糖）在C6為上的磷酸化舉例：胰蛋白酶只能斷裂L-氨基酸構(gòu)成的肽鍵，對D-氨基酸構(gòu)成的肽鍵則不起作用二、關(guān)于酶專一性的假說1、鎖鑰學(xué)說（1894年提出）認(rèn)為整個酶分子的天然構(gòu)象是具有剛性結(jié)構(gòu)的，酶表面具有特定的形狀。酶與底物的結(jié)合如同一把鑰匙配一把鎖一樣。不足之處：鎖鑰學(xué)說很難解釋在可逆反應(yīng)中，酶既能和底物結(jié)合，又能和產(chǎn)物結(jié)合的現(xiàn)象2、誘導(dǎo)契合學(xué)說（1958年提出）認(rèn)為整個酶分子是高柔性的動態(tài)構(gòu)象分子，酶和底物結(jié)合是相互作用的過程。當(dāng)酶分子與底物接近時，酶蛋白受底物分子的誘導(dǎo)，構(gòu)象發(fā)生有利于結(jié)合底物的變化近年來許多研究結(jié)果都支持這種假說活性部位E+SESEPTS1TS2TS3E+PTS（無酶）ΔG(無酶)ΔG(有酶)ΔG(S→P)三、酶的催化機制——改變反應(yīng)歷程的過渡態(tài)理論S→P的化學(xué)反應(yīng)中，只有底物S的自由能高于產(chǎn)物P，即ΔG(S→P)<0,平衡才有利于向產(chǎn)物方向進行該理論認(rèn)為，任何一個化學(xué)反應(yīng)中，反應(yīng)物需要達到一個特定的高能狀態(tài)后才能發(fā)生反應(yīng)，這一個高能狀態(tài)叫過渡態(tài)（Transitionstate,TS）。要達到過渡態(tài)，反應(yīng)物必須具有足夠的能量來克服勢能障礙ΔGE+SESEPE+PTS1TS2TS3反應(yīng)進程自由能G酶促反應(yīng)的中間物ES的生成，降低了反應(yīng)所需的活化自由能，使酶促反應(yīng)高效快速進行四、酶實現(xiàn)高效催化的因素1、鄰近效應(yīng)和定向效應(yīng)鄰近效應(yīng)：指底物和酶的靠近，使要發(fā)生反應(yīng)的底物在酶活性部位的有效濃度大大地提高。例如，某些酶促反應(yīng)，在酶活性中心的底物濃度比溶液中高出10萬倍。定向效應(yīng)：酶與各個底物發(fā)生特異、定向結(jié)合，使底物中需要發(fā)生反應(yīng)的基團靠在一起。2、誘導(dǎo)契合根據(jù)誘導(dǎo)－契合學(xué)說，底物和酶活性部位的構(gòu)象不是完全互補吻合，酶促反應(yīng)中，酶和底物分子會相互誘導(dǎo)，發(fā)生扭曲變形而契合在一起，使其幾何和靜電結(jié)構(gòu)更接近過渡態(tài)，從而大大加快反應(yīng)速度。3、酸堿催化酶分子的某些功能基團能作為酸或堿，瞬時向底物提供質(zhì)子或者從底物中抽去質(zhì)子，使過渡態(tài)得到穩(wěn)定，從而加速反應(yīng)進行。Glu，AspLys，ArgCysTyrHis氨基酸殘基質(zhì)子供體基團質(zhì)子受體基團注意：His既能作為質(zhì)子酸，又能作為質(zhì)子堿4、共價催化酶作為親核基團或者親電基團，與底物形成共價中間物的過渡態(tài)，能使反應(yīng)活化能大大降低，從而加速反應(yīng)。（1）親核催化：親核基團對底物進行親核攻擊而產(chǎn)生的催化作用（2）親電催化：親電基團對底物進行親電攻擊而產(chǎn)生的催化作用.這些親電基團往往是酶的一些輔因子，如金屬離子Mg2+,Mn2+,Fe2+,5、金屬離子催化金屬離子（比如Mg2+）是許多酶的輔因子，往往通過以下方式參與酶的催化作用：結(jié)合底物為反應(yīng)定向在氧化還原反應(yīng)中傳遞電子靜電屏蔽或屏蔽負電荷6、酶活性中心的疏水微環(huán)境許多酶的活性中心位于疏水凹穴中，催化基團被低介電環(huán)境包圍。在疏水的環(huán)境中，電荷間作用力顯著增強，有利于酶分子催化基團和底物發(fā)生作用。酶催化作用實例——胰凝乳蛋白酶的催化機制球狀蛋白，活性中心位于酶分子凹陷處的疏水口袋中，主要由Ser195,His57,Asp102組成胰凝乳蛋白酶及其活性中心胰凝乳蛋白酶活性中心的電荷轉(zhuǎn)移系統(tǒng)胰凝乳蛋白酶對底物的水解過程胰凝乳蛋白酶作用原理動畫演示第四節(jié)酶促反應(yīng)動力學(xué)P91酶動力學(xué)是研究酶促反應(yīng)速率及其變化規(guī)律和影響因素的的一門學(xué)科。一、酶促反應(yīng)速率和酶活力1、酶促反應(yīng)速率：單位時間內(nèi)底物濃度的減少量或者產(chǎn)物濃度的增加量酶促反應(yīng)速率以初速率ν0為準(zhǔn)產(chǎn)物濃度反應(yīng)時間反應(yīng)速率=斜率=濃度/時間初速率ν0時間范圍2、酶的活力單位——U（activityunit）或者IU（internationalunit）1U=1IU=在最適反應(yīng)條件下（溫度25℃，最適pH和最適底物濃度下），一分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1μmol底物所需的酶量3、酶的比活力比活力（SpecificActivity）是指：單位重量的蛋白質(zhì)中所含有的酶活力單位數(shù)，一般用IU/mg蛋白質(zhì)來表示。比活力可以代表酶的純度，酶的比活力越高，說明酶的純度越高。二、底物濃度對酶促反應(yīng)速率的影響v一級反應(yīng)混合級反應(yīng)零級反應(yīng)[S]一級反應(yīng)：底物濃度較低時，v=v0=kc，反應(yīng)速率與底物濃度成一次方程正比；混合級反應(yīng)：隨著底物濃度的增加，反應(yīng)速率和和底物濃度不成正比，介于一級反應(yīng)和零級反應(yīng)之間；零級反應(yīng)：底物濃度增加到一定程度時，v=vmax=k，反應(yīng)速率達到最大，與底物物濃度無關(guān)；利用Henri的中間復(fù)合物學(xué)說來解釋底物濃度對反應(yīng)速率的影響，酶促反應(yīng)的方程可表示為：S+

EE+PESk1k2k3k4當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時，只有少數(shù)酶參與反應(yīng)生成中間產(chǎn)物，其他酶分子處于空閑狀態(tài)，所以當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾訒r，馬上被空閑的酶分子結(jié)合生成中間產(chǎn)物，反應(yīng)速率增加，呈現(xiàn)一級反應(yīng)；當(dāng)?shù)孜餄舛壤^續(xù)增加，酶分子漸漸飽和，反應(yīng)速率不再和底物濃度成正比，為混合級反應(yīng)；當(dāng)?shù)孜餄舛茸銐虼髸r，所有酶都參與了反應(yīng)，反應(yīng)速率達最大，此時繼續(xù)增加底物濃度，反應(yīng)速率不變，為零級反應(yīng)其推導(dǎo)過程包含三個假設(shè)前提：（1）E與S形成ES復(fù)合物的反應(yīng)是快速平衡反應(yīng)，而ES分解為E及P的反應(yīng)為慢反應(yīng)，反應(yīng)速度取決于慢反應(yīng)即

V0=k3[ES]（2）在反應(yīng)初始階段，S的總濃度遠遠大于E的總濃度，因此在反應(yīng)的初始階段，S的濃度可認(rèn)為不變即[S]＝[St]

（3）在反應(yīng)初始階段，P→0，忽略由E+P形成ES這步反應(yīng)，即：S+

EE+PESk1k2k3底物濃度與酶促反應(yīng)速率的數(shù)學(xué)關(guān)系——米氏方程

米氏方程的推導(dǎo)過程給定反應(yīng)的速率與各反應(yīng)物濃度的乘積成正比，比例為反應(yīng)速率常數(shù)K米氏方程的意義

米氏常數(shù)Km的意義

所以米氏常數(shù)的意義為：當(dāng)酶促反應(yīng)速率達到最大反應(yīng)速率一半時的底物濃度Km值是酶的一個重要特征常數(shù)，單位為mol/L。只與酶的性質(zhì)有關(guān)，與酶濃度無關(guān)Km值可表示酶與底物之間的親和力。Km值大表示親和力弱，底物難與酶結(jié)合;Km值小表示親和力強。因此可以用來判斷酶的最適底物。舉例：P93表6-1最適底物判斷米氏常數(shù)圖示

Km是酶的特性常數(shù)，與pH、溫度、離子強度、酶及底物種類有關(guān)，與酶濃度無關(guān)，可以鑒定酶。酶底物Km(mmol/L)脲酶尿素25溶菌酶6-N-乙酰葡萄糖胺0.006葡萄糖-6-磷酸脫氫酶6-磷酸-葡萄糖0.058胰凝乳蛋白酶苯甲酰酪氨酰胺2.5甲酰酪氨酰胺12.0乙酰酪氨酰胺32.0米氏常數(shù)Km的求解——雙倒數(shù)作圖法

從米氏方程的雙曲線作圖求Km值很麻煩，若方程兩邊求倒數(shù)，則變得很容易：

三、溫度對酶促反應(yīng)速率的影響最適溫度最適溫度一方面，溫度提高，反應(yīng)速度加快另一方面，酶屬于蛋白質(zhì)，高溫容易變性失活最適溫度：酶促反應(yīng)速率達到最大時的溫度四、pH對酶促反應(yīng)速率的影響最適pH最適pH過酸或過堿環(huán)境會使酶變性影響酶活性中心必須基團的解離程度影響底物和輔基或者輔酶的解離，從而影響酶和底物的結(jié)合最適pH：酶促反應(yīng)速率達到最大時的pH酶的最適pH通常與酶的來源環(huán)境有關(guān)多數(shù)酶的pH在7.0左右五、激活劑對酶促反應(yīng)速率的影響1.激活劑的概念凡是能提高酶活性的物質(zhì)都叫酶的激活劑。

反之，凡是可以減弱、抑制甚至破壞酶活性的物質(zhì)就稱為酶的抑制劑。2.激活劑的類型無機離子：包括陽離子（如K＋、Na＋、Ca2＋、Mg2＋、Fe3＋等）和陰離子（如Cl－、I－、CN－等）。中小有機分子：如某些還原劑（半胱氨酸、巰基乙醇、谷胱甘肽、抗壞血酸等）和金屬鰲合物（EDTA）。蛋白質(zhì)大分子：如蛋白酶對某些酶原的激活，某些蛋白激酶對酶分子的修飾。六、抑制劑對酶促反應(yīng)速率的影響酶的失活作用：使酶蛋白變性從而引起酶活力喪失酶的抑制作用：使酶活力下降但不引起酶變性不可逆抑制作用：抑制不能被解除，酶活性不能被恢復(fù)的抑制可逆抑制作用：可通過加入其它物質(zhì)或用物理方法（如透析、超慮等）解除的抑制酶的抑制作用1、不可逆抑制作用很多不可逆抑制劑為劇毒物質(zhì)——重金屬、有機磷、有機汞、有機砷、氰化物、青霉素、毒鼠強等。不可逆抑制劑能與酶活性中心基團共價結(jié)合，使酶活性下降，無法用透析、超濾等物理方法除去舉例1：有機磷農(nóng)藥對昆蟲和脊椎動物的傷害人體中毒后緊急救治：洗胃、喝雞蛋清或牛奶；導(dǎo)泄、利尿；血液透析（清除游離狀態(tài)毒物）；服解毒藥（解磷定）舉例2：青霉素對細菌的毒害作用青霉素可以結(jié)合細菌內(nèi)轉(zhuǎn)肽酶的活性中心，使該酶失活，從而阻止細菌細胞壁的形成，使細菌失去細胞壁的滲透屏障，對細菌起到殺滅作用。青霉素分子的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)肽酶底物的結(jié)構(gòu)2、可逆抑制作用可逆抑制劑與酶蛋白的結(jié)合是可逆的，抑制劑可以用透析、超濾等物理方法除去，從而恢復(fù)酶的活性（1）競爭性抑制劑該類抑制劑（Inhibitor，I）具有與底物類似的結(jié)構(gòu)，抑制劑與底物競爭性地同酶的活性部位結(jié)合，與酶形成可逆的EI復(fù)合物

在競爭性抑制劑存在下，酶的Vmax不變，但是Km值增大競爭性抑制作用舉例甲醇中毒容易致盲：甲醇與乙醇競爭性結(jié)合乙醇脫氫酶，使甲醇轉(zhuǎn)化為甲醛，而眼睛對甲醛非常敏感抗癌藥物5’-氟尿嘧啶遏制癌細胞增殖：5’-氟尿嘧啶結(jié)構(gòu)和尿嘧啶很相似，能競爭性結(jié)合胸腺嘧啶合酶（底物是尿嘧啶），抑制胸腺嘧啶的合成，影響DNA復(fù)制，使細胞無法分裂磺胺類藥物抗菌：該類藥物和對氨基苯甲酸類似，競爭性結(jié)合二氫葉酸還原酶，阻止細菌合成四氫葉酸，進而抑制細菌核酸合成。競爭性抑制作用舉例某些藥物或體內(nèi)代謝物對酶的競爭性抑制作用藥物（抑制劑）被抑制的酶競爭底物臨床應(yīng)用及機理磺胺藥二氫葉酸合成酶（細菌）苯甲酸抗菌作用（抑制四氫葉酸）氨基蝶呤二氫葉酸還原酶二氫葉酸抗白血病5-氟尿嘧啶（5-FU）尿嘧啶核苷磷酸化酶（胸腺嘧啶核苷磷酸化酶）尿嘧啶（胸腺嘧啶）抗癌作用（抑制核苷酸合成）別嘌呤醇黃嘌呤氧化酶黃嘌呤，次黃嘌呤抗痛風(fēng)（抑制尿酸生成）6-氨基已酸纖溶酶-賴氨酸-氨基酰止血，抗纖溶（抑制纖溶酶）苯丙胺（麻黃素）單胺氧化酶腎上腺素（去甲腎上腺素）中樞興奮，抗哮喘（2）反競爭性抑制劑這種情況下酶只有與底物結(jié)合后，才能與抑制劑結(jié)合。

在反競爭性抑制劑存在下，酶的Vmax和Km值都變小（3）非競爭性抑制劑該抑制劑與酶的結(jié)合位點不同于底物。當(dāng)酶先與底物結(jié)合后，可以再和抑制劑結(jié)合；當(dāng)酶先與抑制物結(jié)合后，也可以再和底物結(jié)合。

在非競爭性抑制劑存在下，酶的Vmax變小，Km值不變不同類型可逆抑制動力學(xué)的比較七、酶的別構(gòu)效應(yīng)調(diào)節(jié)反應(yīng)速率當(dāng)某一代謝物與酶分子的某一特定部位結(jié)合后，引起酶蛋白分子構(gòu)象發(fā)生變化，從而改變酶的催化功能，這種現(xiàn)象就稱為酶的別構(gòu)效應(yīng)。具有別構(gòu)效應(yīng)的酶成為別構(gòu)酶。（1）大部分別構(gòu)酶為寡聚酶，含兩個以上亞基（2）具有活性中心和別構(gòu)中心，前者負責(zé)底物的結(jié)合和催化，后者負責(zé)調(diào)節(jié)酶促反應(yīng)速率別構(gòu)激活劑別構(gòu)抑制劑（3）別構(gòu)酶不遵循米氏方程，其動力學(xué)曲線為S形曲線本章小結(jié)酶的概念，命名，分類和化學(xué)本質(zhì)（蛋白質(zhì)或者核酸）酶的活性部位和必須基團酶的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系：酶原的激活、同工酶、別構(gòu)酶（S形曲線）酶的專一性及解釋學(xué)說（鎖鑰學(xué)說、誘導(dǎo)契合學(xué)說）酶的催化機制——過渡態(tài)理論酶實現(xiàn)高效催化的6大機制（鄰近和定向效應(yīng)、誘導(dǎo)契合、酸堿催化、共價催化、金屬離子催化、酶活性中心的疏水環(huán)境）酶促反應(yīng)速率的定義，單位和測定底物對酶促反應(yīng)的影響（一級、混合級、零級反應(yīng)）米氏方程的推導(dǎo)，方程和米氏常數(shù)的意義，雙曲線型動力學(xué)曲線，雙倒數(shù)作圖求米氏常數(shù)溫度，pH和激活劑對酶促反應(yīng)的影響抑制劑對酶促反應(yīng)的影響（競爭性，反競爭性，非競爭性）1.在酶濃度不變的條件下，以反應(yīng)速度V對作用物[S]作圖，其圖像為A.直線B.S形曲線C.雙曲線D.拋物線2.酶促反應(yīng)中所有酶達到飽和后，再增加底物濃度A.反應(yīng)速度隨底物增加而加快B.隨著底物濃度增加酶逐漸失活C.酶的結(jié)合部位全部被作用物占據(jù)，反應(yīng)速度不再增加D.增加抑制劑反應(yīng)速度反而加快3.酶的Km是A.飽和底物濃度時的反應(yīng)速度