第二章-昆蟲解毒代謝

1.前言2.初級代謝

(1)氧化代謝（MFO)(2)

非氧化代謝

I.水解代謝（酯酶）

II.還原代謝（硝基還原酶）3.次級代謝4.有毒物質在昆蟲體內代謝第二章：昆蟲解毒代謝第一節(jié)前言一、研究昆蟲解毒代謝的意義二、昆蟲對毒物的代謝

I.解毒作用：有毒物質進入昆蟲體內，昆蟲體內有多種防御機能，能將有毒物質迅速代謝為無毒物質，使機體保持正常狀態(tài)而不受其害，這種代謝稱為解毒作用。

II.活化作用：有些化合物在生物體內，經代謝轉化成比原化合物更毒的物質，這種代謝稱為活化作用。I.昆蟲解毒代謝的類型：

(1)初級代謝（Ⅰ型反應）：主要包括對外來化合物的氧化、水解、還原以及基團的轉移。

(2)次級代謝（Ⅱ型反應）：初級代謝的產物（主要具有-OH、-SH、-NH2、-COOH的基團）與內源物質（軛合劑）結合，最后排除體外。

農藥在昆蟲體內的軛合形式主要是氨基酸反應，包括與單氨基酸類的軛合和復氨基酸的軛合、及與硫酸酯的軛合、與谷胱甘肽的軛合、烷基化和酰化反應等。軛合后的軛合物比農藥本身的親水性更強，更容易從動物體內排出。藥物殺蟲劑其它外來化合物初級產物次級產物初級代謝氧化、還原、水解、基團轉移次級代謝葡萄糖、氨基酸、硫酸、磷酸等共軛脂溶性水溶性第二節(jié)氧化代謝（MFO)

氧化代謝中所涉及到的酶系很多，主要有：脫氯化氫酶（deyudrochlorinase）、微粒體多功能氧化酶（microsomalmixed-functionoxidases，MFO）、谷胱甘肽轉移酶（glutathione-transferases，GST）及各種酯酶（esterases）等。其中微粒體多功能氧化酶具有底物廣譜性的特點，能參與對各種殺蟲劑（包括有機氯、有機磷、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯、化學不育等等）及有毒物質的解毒作用，在有毒物質代謝中起著非常重要的作用。一、微粒體多功能氧化酶作用方式及機理(一)微粒體多功能氧化酶研究歷史

1.1943年Claude把通過差速離心分離出來的亞細胞顆粒（直徑約200μm）稱之為微粒體。

2.1954年Axelrod首先發(fā)現(xiàn)兔肝微粒體對苯異丙胺具有脫氨氧化作用，此后人們才開始注意到微粒體在氧化代謝中的重要作用。

3.1958年，Brodie等證明了離體的微粒體氧化酶要起作用，需要氧和還原性輔酶Ⅱ（NADPH）

4.昆蟲中的微粒體氧化酶是Agosin等于1961年首次在德國蜚蠊中發(fā)現(xiàn)的。（二）微粒體多功能氧化酶的組成及性質

MFO是一個酶的復合體，主要包括：細胞色素P450、黃素蛋白-NADPH-P450還原酶、細胞色素b5、黃素蛋白-NADH-細胞色素b5還原酶和磷脂等成分組成。1.細胞色素P450的特性(1)光學特性

微粒體被還原后可以與CO結合形成復合體，通過雙光束掃描分光光度計掃描，在波長450nm處出現(xiàn)一個最大吸收峰。除了與CO結合外，細胞色素P450可以與許多物質結合，結合后所誘導產生的光譜，按其性質可分為三類：Ⅰ型：波峰在390-410，波谷在425-435nm；

Ⅱ型：波峰在425-435nm，波谷在390-410nm；

MⅡ型：最大和最小吸收峰分別在325和420nm。棉鈴蟲中腸細胞色素P450CO差光譜圖棉鈴蟲中腸CytP420-CO差光譜(2)不穩(wěn)定性10,000g離心20min沉淀（細胞核、碎片、線粒體）100,000g離心60min微粒體微粒體上清液線粒體上清液粗勻漿液中腸或脂肪體差速離心

P450s的氨基酸同源性大于40％時為同一家族；若大于55%時為同一亞家族若大于55%時為同一亞家族，大于80％屬于等位基因，大于97％屬于等位基因的變異體。等位基因用v1、v2等表示，假基因用p1、p2等表示。

例外：

CYP6A1和CYP6B2雖屬于同一6家族，但是這兩個蛋白的氨基酸的同源性卻低于40％

(3)

命名

(4)多樣性P450基因已經有35億年的歷史?，F(xiàn)在所有的p450s均來自一個共同的古老的基因。現(xiàn)在認為當前p450超家族是通過基因擴增或基因適應多樣化形成的。P450基因屬于基因超家族(superfamily)，目前已知，該超家族包括70個家族(family)，120個亞家族(sub-family)（Nelson,1998），并且不斷有新的成員加入，其數(shù)量增長很快。

到目前為止，p450超家族已發(fā)現(xiàn)1200種基因，哺乳動物中有大約310種。到2000年春季，植物中已知的p450基因有513種。細菌和低等的真核生物中的p450有接近100種已命名。人類有56種。(I)p450家族數(shù)目(II)P450s的進化分子驅動學說指出，一個種群基因型組分的改變是由于DNA翻轉內在的動力而非自然選擇造成的。假基因是一段與功能基因相似的序列，但不能形成蛋白產物。假基因的識別要么通過編碼區(qū)的異常或轉錄的異常，或兩者兼有。

(III)同工酶的多樣性果蠅基因組的序列揭示了在果蠅中有86個公認的p450基因，4個假基因，歸屬25個不同的家族。來自家族4與6的基因數(shù)目大約占這個中群p450s的一半多。在86個基因中，CYP6A17和CYP6A23具有最高的相似性，達到84.2％。僅有10對的相似性大于70％。

其表達與昆蟲的發(fā)育階段、性別、組織、品系及取食有關。

(IV)表達的多樣性細胞色素P450基因調控的多樣性

調節(jié)步驟舉例基因轉錄1A11A22B12B22C72C112C122D92E12H12H23A1/23A64A111A111B1/172C122E1加工1A2mRNA的穩(wěn)定性1A12B12B22C122E12H12H23A1/211A1翻譯2E1酶的穩(wěn)定性2E13A1/23A6(5)可誘導性

現(xiàn)已證明，許多化合物，如藥物、殺蟲劑、以及植物他感化和物都能誘導P450的生物合成。目前搞的比較清楚的是苯巴比妥和3-甲基膽蒽可誘導P450的合成。槲皮素（0.01%和0.02%）對棉鈴蟲幼蟲P450s誘導的時間效應單寧（0.1%和0.5%）對棉鈴蟲幼蟲P450s誘導的時間效應

十三烷酮(0.02%)對棉鈴蟲中腸細胞色素P450的誘導作用

時間 4 16 26 40 50 72 96 CK 中腸 1.50 2.29 2.24 3.07 2.58 4.32 2.58 1.22 倍數(shù) 1.22 1.87 1.84 2.51 2.11 3.53 2.11(6)分離昆蟲p450s的方法1全基因測序2蛋白純化

3用已知的p450s作為探針

4利用兼并引物

5差異或消減篩選

P450純化可通過兩個途徑:(1)直接從生物體組織中分離，(2)通過分子生物學方法獲得P450基因，再進行異源表達純化P450蛋白。從生物組織中直接分離P450蛋白一個首要解決的問題就是需要大量的組織材料.另外生物體內蛋白種類多，要經過繁瑣的步驟進行分離.這樣容易造成P450蛋白失活，而通過P450差光譜就很難鑒定。通過P450其它種類已分離450蛋白的抗血清或特異性抗體加以解決。槲皮素F1對照中腸、脂肪體BufferA微粒體溶解微粒體差數(shù)離心10%chaps40%PEGBufferB微粒體增溶雜蛋白沉淀DE-32BufferC0-60%NaClSDSP450蛋白純化的研究實驗流程中腸或脂肪體RNAcDNAPCR擴增目的片段回收轉化DH5α菌株與pGEM-T載體相連酶切鑒定藍白斑篩選SP6/T7測序序列分析分離昆蟲p450s的方法家蠅CYP6A1和果蠅CYP6A2的cDNA文庫就是通過p450的抗體篩選得到的cDNA文庫。

CYP6B3就是通過用CYP6B1CDNA為探針分離得到的。

(7)昆蟲p450s的底物

昆蟲單加氧酶可代謝內源性物質諸如保幼激素、蛻皮激素及其類似物等，也可代謝外源物質如次生物質、殺蟲劑及前誘變劑。

2.細胞色素P450酶系氧化底物循環(huán)作用機理(1)底物與酶結合，酶上的鐵原子由于NADPH-細胞色素P450還原酶供給一個電子使得三價鐵還原為二價鐵。(2)鐵的還原作用使其與分子氧結合。(3)另一個電子和質子加到鐵上形成FeOOH復合體。(4)失去一分子水后形成（FeO）3+復合體，此復合體將其氧原子轉移到底物上。(5)被氧化的底物釋放出來，游離的細胞色素P450又重復下一個循環(huán)。MonooxygenationreactionscatalysedbycytochromeP450MonooxygenationreactionscatalysedbycytochromeP450MonooxygenationreactionscatalysedbycytochromeP450催化反應機制

RH+O2+NADPH+H+→ROH+H2O+NADP+

這一循環(huán)開始于酶作用物與亞鐵血紅素的結合，通常誘導鐵旋轉狀態(tài)由低自旋到高自旋底改變。鐵通過從氧化還原配耦體轉移出一個電子被還原成亞鐵形式并和氧迅速結合。第2個電子轉移到亞鐵血紅素導致氧分子分裂成瞬時底介體并釋放水。最終，活潑底介體攻擊酶反應物導致化合物單加氧化。

P450對底物的氧化循環(huán)機理Fe3+P450底物OHFeOOHP450底物HFe2+O2

P450底物HFe2+P450底物HFe3+P450底物HFe3+P450底物OH底物H(FeO)3+P450底物HH+H2OH+1NADPHe-NADPHe-O23從p450s研究中獲得信息(1)殺蟲劑抗性

(2)植物—昆蟲相互作用

(3)昆蟲生理知識

植物—昆蟲相互作用

黑尾鳳蝶能夠取食含有呋喃香豆素的大多數(shù)植物，并能忍受含有0.1％花椒毒素。在這個種中，花椒毒素可被p450單加氧酶代謝，誘導的p450的活性接近5倍。二、多功能氧化酶作用方式O、S和N-烷基的羥基化作用脂族羥基化作用和環(huán)氧化作用芳香族羥基化作用有機磷酸酯的脂族氧化作用氮和硫醚的氧化作用MonooxygenationreactionscatalysedbycytochromeP4501.O、S和N-烷基的羥基化作用

（西維因的N-烷基羥基化作用）西維因1-萘基-N羥基-氨基甲酸甲酯O、S和N-烷基的羥基化作用

（西維因的N-烷基羥基化作用）MonooxygenationreactionscatalysedbycytochromeP4502.脂族羥基化作用和環(huán)氧化作用

DDT三氯殺螨醇OHHMFO(1)DDT的羥基化作用艾氏劑狄氏劑.芳基羥基化作用和環(huán)氧化作用2.艾氏劑的環(huán)氧化作用MFOONADPH,O2微粒體萘

1，2-二羥基-1，2-二氫化萘α-萘酚芳香族羥基化作用萘的羥基化作用NADPHO2NADPHO2對硫磷二乙基硫代磷酸4-硝基酚有機磷酸酯的脂族氧化作用（對硫磷）NADPHO2NADPHO2甲基對硫磷二甲基硫代磷酸4-硝基酚有機磷的脂族氧化作用（甲基對硫磷）MetabolicdisorderscausedbymutationsandpolymorphismsinP450oxidoreductaseMostdrugsandxenobioticsaremetabolizedbyasmallnumberofhepaticcytochromeP450enzymes.AlldrugmetabolizingP450enzymesreceiveelectronsfromNADPHthroughasingleflavoproteinknownasNADPH-P450reductase.WehaverecentlyidentifiedmutationsinNADPHP450reductasefrompatientswithdisorderedsteroidogenesis.Polymorphismsinthedrugmetabolizingenzymes,especiallycytochromeP450sarewellknowntoberesponsibleforvariationsindrugresponses.MypreliminaryworkonmutantandpolymorphicP450reductasesuggeststhatmanydrugmetabolizingP450enzymesareseverelyaffectedbyanabnormalP450reductaseenzyme.SinceallliverP450enzymesneedP450reductaseforactivity,itisseemslikelythatchangesinP450reductasemayproducedrugresponsesthatarephenotypicallysimilartooneormorecytochromeP450mutations/polymorphisms.Asanexample,inthefirstreportofP450reductasemutations,thediseaseprofileofhormonallyimpairedpatientssuggestedadefectinP450c17orP450c21butnomutationinanyoftheseenzymeswasfoundanditwasthedefectiveP450reductasethatproducedaphenotypicresponsesimilartodefectiveP450c17andP450c21.SequencingdatafromnormalpopulationhasrevealedseveralvariantsofNADPHP450reductaseenzyme.TheseP450reductasevariantsarebeingtestedfortheelectrontransferactivitiestowardsvariouscytochromeP450enzymes.FirstsetofP450reductasemutationshadbeentestedforactivitytowardsP450c17andaromatase(CYP19A1).第三節(jié)：有毒的其它初級代謝一：殺蟲劑的水解代謝A酯酶主要是芳基酯酶，能水解某些含芳基的磷酸酯類殺蟲劑，B酯酶包括了膽堿酯酶，羧酸酯酶核酯酶。Aldridge（1953）根據(jù)酯酶與有機磷的相互作用把酯酶分為三類：(1）A-酯酶，這類酶能耐受有機磷，并把它們作為底物進行水解；(2）B-酯酶，這類酶對對氧磷等有機磷很敏感，能被這些有機磷抑制；(3）C-酯酶，既不被有機磷抑制，又不能水解這些有機磷。

殺蟲劑的水解代謝主要包括：（一）磷酸三酯的水解（二）羧酸的水解（三）酰胺的水解（一）磷酸三酯的水解

磷酸三酯能夠被磷酸三酯水解酶水解。此酶主要作用于磷酯和酐鍵。在以前用了很多名字描述這種酶，例如：對氧磷酶、A酯酶、磷酸酯酶、磷酰基磷酸酶、芳基酯酶等，實際上都屬于磷酸三酯水解酶。一般，水解磷酸酯酶系大多是根據(jù)其水解底物的名稱來命名的。目前發(fā)現(xiàn)的水解酶主要包括：DFP酶、芳族酯水解酶、O-烷基水解酶、磷酸二脂水解酶。

1.氟水解酶(Fluorohydrolases,DFP酶)2.芳族酯水解酶

3.O-烷基水解酶

4.磷酸二脂水解酶（一）磷酸三酯的水解+H2O+HX+H2O+ROH1.磷酸三酯的水解+H2O+HF氟水解酶（DFP酶）＋H2O+2.

芳族酯水解酶OHHO＋H2O+CH2OH3.O-烷基水解酶DDVP+H2O+4.磷酸二酯的水解HOHOCH=CCL2（二）羧酸的水解

羧酸酯酶(Carboxylesterase)，屬于B酯酶，又稱脂族酯酶，能催化各種脂族酯和芳族酯的水解，但不能水解膽堿酯。目前研究表明羧酸酯酶在一些有機磷和擬除蟲菊酯的代謝中起著重要的作用，這種酶的活性一般在正常的昆蟲品系中是比較低的而在某些抗性品系中比較高。羧酸酯酶通過附加一分子水而將底物裂解成酸和醇兩部分。例如：將馬拉硫磷水解，形成α，β單酸以及醇。（二）羧酸的水解H2O+2C2H5OH馬拉硫磷馬拉硫磷α-單酸馬拉硫磷β-單酸+（三）酰胺的水解H2O+CH3NH2樂果樂果酸

酰胺酶可以水解含酰胺鍵的化合物。例如將樂果水解成樂果酸。（四）環(huán)氧化物水解環(huán)氧化物的水解由環(huán)氧化物水解酶催化，昆蟲中存在家蠅、紅頭麗蠅、黃粉甲、亞熱帶粘蟲H2O二還原代謝

還原代謝沒有氧化代謝那么普遍。在動物體內這種代謝多發(fā)生于那些含硝基苯核或含鹵原子的化合物，在酶或細菌的作用下，被轉化為相應的氨基化合物及脫鹵代謝物。如：DDT轉變?yōu)榈蔚我恋姆磻褪峭ㄟ^脫氯化氫酶的作用，一個鹵原子被氫所取代。含硝基苯母核的農藥，如：苯硫磷、對硫磷、殺螟松等化合物在動物體內容易被還原為氨基衍生物。在昆蟲中發(fā)現(xiàn)了硝基還原和偶氮還原兩類。如對硫磷在依賴于NADPH的硝基還原酶的作用下被還原成胺基對硫磷。二、還原反應對硫磷氨基對硫磷NADPH

硝基還原酶NH2NO2三以谷胱甘肽為介質的代謝

許多外來化合物的代謝都與谷胱甘肽（GSH）有關，殺蟲劑以及其代謝產物也能夠被以谷胱甘肽為介質的系統(tǒng)代謝。這種代謝有兩類，第一是GSH以純粹催化劑的形式被利用；第二谷胱甘肽直接與底物結合而被消耗，至少在反應初期是這樣的，并不能再生，而是排除體外。X-raystructureofglutathioneS-transferasefromthemalarialparasitePlasmodiumfalciparumX-raystructureofglutathioneS-transferaseX-raystructureofglutathioneS-transferase單體雙體（一）谷胱甘肽催化代謝DDT脫HClCCl--ClC+GSH

+HCl+GSH

(二)GSH消耗代謝GSH-S-轉移酶

此酶屬于共軛反應類型，在以后還會介紹。GSH和底物結合，一般有兩種類型。第一：GSH代替底物中不穩(wěn)定的部分：第二：直接進攻底物分子二乙基順丁烯二酸1.GSH-S-烷基轉移酶

GSH+CH3-SG甲基對氧磷2.GSH-S-芳基轉移酶二嗪農+3.GSH-S-芳烷基轉移酶+GSH+HCl芐基氯4.GSH-S-鏈烯轉移酶+GSH二乙基馬來酸酯以下兩類反應是通過GSH-S-轉移酶直接將GSH轉移到底物分子中5.GSH-S-環(huán)氧基轉移酶+GSH1,2環(huán)氧乙基苯第四節(jié)殺蟲劑的次級代謝

(共軛代謝)

次級代謝（Ⅱ型反應）：初級代謝的產物（主要具有-OH、-SH、-NH2、-COOH的基團）與內源物質（軛合劑）結合，最后排除體外。農藥在昆蟲體內的軛合形式主要是氨基酸反應，包括與單氨基酸類的軛合和復氨基酸的軛合、與硫酸酯的軛合、與谷胱甘肽的軛合、烷基化和酰化反應等。軛合后的軛合后的軛合物比農藥本身的親水性更強，更容易從動物體內排出。一、共軛反應

共軛反應主要指天然的或外來的化合物及其代謝物與內源性的中間產物結合。具有中間代謝和解毒的雙重作用在昆蟲中主要有三種類型的共軛反應。1.外來化合物或其代謝產物和內源性的活化供體反應要求外來化合物或其它代謝產物有-OH，–NH2，–SH，-COOH基團，這些基團與尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）反應。α-萘酚+UDPG(活化供體)α-萘基葡萄糖苷2.外來化合物活化成活化的供體，然后和內源性受體酶促反應對硝基苯甲酰CoA（活化供體）對硝基苯甲酸活化CoA甘氨酸共軛對硝基苯甲酰甘氨酸3.外來化合物或其產物與GSH酶促反應

在第一種和第二種類型的共軛反應中，需要形成高能量的或活化的中間產物，雖然第三種類型不需要但它反應所需要的GSH的合成需要ATP。因此，總的來