瓊脂擴(kuò)散實驗20150916

瓊脂擴(kuò)散試驗一、實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)掌握瓊脂擴(kuò)散試驗的原理與應(yīng)用熟悉掌握其基本操作方法二、實驗原理沉淀反應(yīng)是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合，在二者比例適當(dāng)并有電解質(zhì)存在及一定的溫度條件下，可形成肉眼可見的沉淀物的反應(yīng)。免疫擴(kuò)散法就是使抗原與抗體在瓊脂糖凝膠中自由擴(kuò)散而相遇，從而形成抗原抗體復(fù)合物，由于此復(fù)合物分子量增大并產(chǎn)生聚集，不再繼續(xù)擴(kuò)散而形成肉眼可見的帶狀或線狀沉淀帶。利用瓊脂糖凝膠作為擴(kuò)散介質(zhì)是因為一定濃度的瓊脂糖凝膠，其內(nèi)部為多孔網(wǎng)狀。而且孔徑很大，可以允許大分子物質(zhì)（分子量自十幾萬到幾百萬以上）自由通過。因為大多數(shù)抗原和抗體的分子量都在20萬以上，所以它們在瓊脂糖凝膠中幾乎可以自由擴(kuò)散。而且瓊脂糖凝膠又具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性、含水量大、透明度好、來源方便、處理容易等優(yōu)點(diǎn)，因此是免疫沉淀檢測技術(shù)中最理想的擴(kuò)散介質(zhì)。

沉淀線的形狀、位置，與抗原的濃度、擴(kuò)散速度相關(guān)。

瓊脂擴(kuò)散試驗可在試管內(nèi)、平皿中以及玻片上的瓊脂中進(jìn)行。又可分為單向瓊脂擴(kuò)散試驗和雙向瓊脂擴(kuò)散試驗兩類。應(yīng)用（1）抗原或抗體的純度鑒定。也可對抗體效價進(jìn)行初步估算。（2）用已知抗血清（或抗原）檢測未知抗原（或抗體）（3）抗原或抗體相對分子量的估計雙向瓊脂擴(kuò)散常見孔型有三孔型、雙孔型、雙排孔型、梅花孔型單向瓊脂擴(kuò)散試驗

單向瓊脂擴(kuò)散試驗是一種常用的定量檢測抗原的方法。將適量稀釋后的抗體與等量瓊脂混勻，澆注成板，凝固后，在板上打孔，孔徑3mm，孔間距10mm，孔中加入抗原，每孔10μL，放置濕盒中，37℃溫箱，抗原就會向孔的四周擴(kuò)散，邊擴(kuò)散邊與瓊脂中的抗體結(jié)合。24h－48h后觀察結(jié)果，在兩者比例適當(dāng)處形成白色沉淀環(huán)。沉淀環(huán)的直徑與抗原的濃度成正比。如事先用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，則從曲線中可求出標(biāo)本中抗原的含量。本試驗主要用于檢測標(biāo)本中各種免疫球蛋白和血清中各種補(bǔ)體成分的含量，敏感性很高。

雙向瓊脂擴(kuò)散試驗測定時將加熱溶化的瓊脂或瓊脂糖澆至玻片上，等瓊脂凝固后，打多個小孔，將抗原和抗體分別加入小孔內(nèi)，使抗原和抗體在瓊脂板上相互擴(kuò)散。當(dāng)二個擴(kuò)散圈相遇，如抗原和抗體呈特異性的結(jié)合且比例適當(dāng)時，將會形成抗原抗體復(fù)合物的沉淀，該沉淀可在瓊脂中呈現(xiàn)一條不透明的白色沉淀線。如果抗原與抗體無關(guān)，就不會出現(xiàn)沉淀線，因此可以通過該試驗，用特異性抗體鑒定抗原，或反之用已知抗原鑒定抗體。

另外沉淀線的特征與位置不僅取決于抗原，抗體的特異性和濃度，而且與其分子的大小及擴(kuò)散速度有關(guān)，當(dāng)抗原體存在多種成分時，將呈現(xiàn)多條沉淀線以至交叉反應(yīng)線，因此可用來檢查抗原和免疫血清的特異性、純度或濃度比較抗原之間的異同點(diǎn)，因而應(yīng)用范圍較廣。

圖1雙向免疫瓊脂擴(kuò)散孔型○○○○

○

○○○

○

○○○○○三孔型雙孔型梅花孔型雙排孔型一種抗原抗體系統(tǒng)只出現(xiàn)一條沉淀帶根據(jù)沉淀帶出現(xiàn)的數(shù)目、位置以及相鄰二條沉淀帶之間的融合、交叉、分枝等情況，就可了解該復(fù)合抗原的組成。

免疫擴(kuò)散

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗

A：Ag、Ab濃度及擴(kuò)散率近似；B：Ag、Ab濃度近似，擴(kuò)散率Ag＞Ab；C：Ag、Ab濃度近似，擴(kuò)散率Ag＜Ab；D：擴(kuò)散率近似，濃度Ag＞Ab；E：濃度Ag＞Ab，擴(kuò)散率Ag＞Ab；F：濃度Ag＜Ab，擴(kuò)散率Ag＜Ab沉淀線形狀、位置與抗原抗體擴(kuò)散率及濃度的關(guān)系

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗

(1)沉淀線吻合：待檢抗原與標(biāo)準(zhǔn)抗原完全相同。(2)沉淀線相切：待檢抗原中含有與標(biāo)準(zhǔn)抗原相同的抗原，還含有另外的抗原與抗血清相對應(yīng)。(3)沉淀線相交：待檢抗原有與抗血清對應(yīng)的抗原，但和標(biāo)準(zhǔn)抗原不同。(4)沉淀線部分吻合：待測抗原和標(biāo)準(zhǔn)抗原性質(zhì)相同，但含量較低。A1：待檢抗原；A2：標(biāo)準(zhǔn)抗原免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗抗體效價滴定用梅花型孔，中間放抗原，周圍孔放下不同稀釋度的相應(yīng)抗體，以出現(xiàn)沉淀線的最高稀釋倍數(shù)為該抗體的效價。材料與試劑1．瓊脂粉2．平皿3．打孔器4．生理鹽水或其他緩沖液5.抗原、抗體實驗

操作方法1．稱取一定量的瓊脂粉，按1.5%的比例加入生理鹽水或緩沖液，煮沸融化。2．將融化的瓊脂倒入平皿內(nèi)，使厚度2mm～3mm。自然冷卻。3．根據(jù)要求（孔徑即孔的直徑，孔距即兩孔圓心之間的距離，包括兩孔的半徑3－5mm）打成梅花形孔圖。4．挑出孔內(nèi)瓊脂，注意不要挑破孔緣。5．在火焰上緩緩加熱，使孔底邊緣的瓊脂少許熔化，以封底，以免加樣后液體從孔底滲漏。6．吸取樣品加入孔內(nèi)(約15ul)，，以加滿為度。7．加畢后，蓋上平皿蓋，將平皿翻過來，置濕盤中，37℃自由擴(kuò)散24h～48h。結(jié)果判定．用以檢測抗原或比較抗原差異時，將抗血清置中心孔，將待測抗原或需比較的抗原置于周圍相鄰孔。若出現(xiàn)沉淀帶完全融合，證明為同種抗原；若二者有部分相連，表明二者有共同抗原決定簇；若二條沉淀線相互交叉，說明二者抗原完全不同。213456

雙向免疫擴(kuò)散凝膠染色圖1.雙擴(kuò)散用于疾病診斷：以IBD診斷為例，中心孔加IBD標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，周圍孔分別加IB