谷氨酸工藝總結

谷氨酸工藝學復習課第一章淀粉的水解糖的制備1作為谷氨酸發(fā)酵工業(yè)原料的水解糖液，必須具備以下條件:(1)糖液中還原糖的含量要達到發(fā)酵用糖濃度的要求。(2)糖液潔凈，是杏黃色或黃綠色，有一定的透光度。水解糖液的透光度在一定程度上反映了糖液質(zhì)量的高低。透光度低，常常是由于淀粉水解過程中發(fā)生的葡萄糖復合反應程度高，產(chǎn)生的色素等雜質(zhì)多，或者由于糖液中的脫色條件控制不當所致。(3)糖液中不含糊精。糊精并不能被谷氨酸菌利用，它的存在使發(fā)酵過程泡沫增多，易于逃料，發(fā)酵難以控制，也容易引起雜菌污染。(4)糖液不能變質(zhì)。這就要求水解糖液的放置時間不宜太長，以免長菌、發(fā)酵而降低糖液的營養(yǎng)成分或產(chǎn)生其他的抑制物，一般現(xiàn)做現(xiàn)用。2淀粉水解糖的制備方法比較酸解法(acidhydrolysismethod)酸解法又稱酸糖化法。它是以酸(無機酸或有機酸)為催化劑，在高溫高壓下將淀粉水解轉(zhuǎn)化為葡萄糖的方法。

優(yōu)點：

用酸解法生產(chǎn)葡萄糖，具有生產(chǎn)方便、設備要求簡單、水解時間短、設備生產(chǎn)能力大等優(yōu)點。缺點：水解作用是在高溫、高壓及一定酸度條件下進行的，因此，酸解法要求有耐腐蝕、耐高溫、耐高壓的設備。

淀粉在酸水解過程中研發(fā)生的化學變化是很復雜的，除了淀粉的水解反應外，尚有副反應的發(fā)生，這將造成葡萄糖的損失而使淀粉的轉(zhuǎn)化率降低。酸水解法對淀粉原料要求較嚴格，淀粉顆粒不宜過大，大小要均勻。顆粒大，易造成水解不透徹;淀粉乳濃度也不宜過高，濃度高，淀粉轉(zhuǎn)化率低，這些是酸解法存在的待解決的問題。酶解法(enzymehydrolysismethod)酶解法是用專一性很強的淀粉酶及糖化酶將淀粉水解為葡萄糖的工藝。利用α-淀粉酶將淀粉液化轉(zhuǎn)化為糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，這個過程稱為液化（liquification)。利用糖化酶將糊精及低聚糖進一步水解轉(zhuǎn)化為葡萄糖，這個過程在生產(chǎn)中稱為糖化(saccharification)。淀粉的液化和糖化都是在酶的作用下進行的，故酶解法又有雙酶(或多酶)水解法之稱(double-enzymehydrolysismethod)。優(yōu)點：

(1)采用酶法制備葡萄糖，酶解反應條件較溫和。因此，不需耐高溫、高壓、耐酸的設備，便于就地取材，容易運作。(2)微生物酶作用的專一性強，淀粉水解的副反應少，因而水解糖液的純度高，淀粉轉(zhuǎn)化率(出糖率)高。（3)可在較高淀粉乳濃度下水解，而且可采用粗原料。（4)用酶解法制得的糖液顏色淺，較純凈，無異味，質(zhì)量高，有利于糖液的充分利用。缺點：酶解反應時間較長(48h)，需要的設備較多，需要具有專門培養(yǎng)酶的條件，而且酶本身是蛋白質(zhì)，易引起糖液過濾困難。第二章氨基酸的發(fā)酵機制1微生物細胞內(nèi)氨基酸合成具有如下特點：某類氨基酸往往有一個共同的前體；氨基酸生物合成與EMP、TCA有十分密切的關系；一種氨基酸可能是另一種氨基酸的前體2細胞內(nèi)要積累大量的氨基酸,采取的措施：必須解除氨基酸代謝途徑中的反饋抑制；防治合成的目標氨基酸降解或者用于合成其它細胞的成分；若幾種氨基酸有一個共同的前體，應該切斷其它氨基酸的合成途徑；增加細胞膜的通透性，使得合成的氨基酸能及時釋放到胞外。3氨基酸合成的調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)對象：關鍵酶起調(diào)節(jié)作用的是關鍵酶。關鍵酶是參與代謝調(diào)節(jié)的酶的總稱。作為一個反應的限速因子，對整個反應起限速作用。這些酶常位于代謝流的樞紐之處，對代謝流的質(zhì)和都起著制約的作用。一般情況下，與氨基酸生物合成途徑分支點有關系的分支點酶可以成為關鍵酶，但關鍵酶并不都是分支點酶。關鍵酶的關鍵效果也只是在特定的氨基生物合成過程中成立，而在其它氨基酸的生物合成過程中則不成立。在每個氨基酸的生物合成途徑中，都有一種以上的關鍵酶。生物合成的途徑越長，關鍵的數(shù)目就越多。關鍵酶中有的是變構酶，有的是同功酶，也有的是多功能酶。對代謝流影最大的關鍵酶處于主導地位，常被配備在由同一前體物出發(fā)去生物合成多種氨基酸的關鍵點上。另外，關鍵酶所受的反饋調(diào)節(jié)因菌株而異。4反饋控制與優(yōu)先合成氨基酸生物合成的基本調(diào)節(jié)機制有反饋控制

(反饋阻遏與反饋抑制)和在合成途徑分支點處的優(yōu)先合成。圖9-24所示的反饋控制，由催化合成途徑最初反應A→B的初始酶受終產(chǎn)物氨基酸E的反饋抑制和合成途徑上各種酶受終產(chǎn)物氨基酸E的反饋阻遏組成。優(yōu)先合成：底物A經(jīng)分支合成途徑生成兩種終產(chǎn)物E和G，由于a酶的酶活性遠遠大于b酶的酶活性，結果優(yōu)先合成E。E合成達到一定濃度時，就會抑制a酶，使代謝轉(zhuǎn)向合成G。G合成達到一定濃度時就會對c酶產(chǎn)生抑制作用。5氨基酸合成的調(diào)節(jié)機制：

(1)通過控制有關基因表達的控制機制誘導:促進酶的合成。阻遏:抑制酶的合成，包括終產(chǎn)物阻遏、分解代謝物阻遏和弱化調(diào)節(jié)。(2)通過酶活性的控制機制終產(chǎn)物抑制或激活。通過輔酶水平的活性調(diào)節(jié)。酶原的活化。潛在酶的活化。(3)通過細胞膜滲透性的控制如棒桿菌、短桿菌積累谷氨酸過程中的細胞膜滲透性變化。第三章谷氨酸的發(fā)酵機制1谷氨酸生物合成途徑谷氨酸的合成主要途徑是α-酮戊二酸的還原性氨基化，是通過谷氨酸脫氫酶完成的。α-酮戊二酸是谷氨酸合成的直接前體，它來源于三羧酸循環(huán)，是三羧酸循環(huán)的一個中間代謝產(chǎn)物。葡萄糖首先經(jīng)EMP及HMP兩個途徑生成丙酮酸。其中以EMP途徑為主.(2)生成的丙酮酸，一部分在丙酮酸脫氫酶系的作用下氧化脫羧生成乙酰CoA，另一分經(jīng)CO2固定反應生成草酰乙酸或蘋果酸.草酰乙酸與乙酰CoA在檸檬酸合成酶催化作用下，縮合成檸檬酸，進入三羧酸循環(huán)，最總終生成ɑ-酮戊二酸。ɑ-酮戊二酸還原氨基化反應生成谷氨酸。4谷氨酸積累的理想圖景A一定的酵解速度，不能走向乳酸發(fā)酵B丙酮酸的碳架全部用于谷氨酸的合成。C：乙酰CoA全部趨于合成檸檬酸方向。

D：α－酮戊二酸氧化能力微弱，不能轉(zhuǎn)化為琥珀酸，而成為不完整的三羧酸循環(huán)。

E：不形成乙醛酸循環(huán)F：異檸檬酸脫氫酶活性強；G：GHD強；H：強的細胞膜透性5.生物素在谷氨酸合成中的調(diào)節(jié)作用1）·生物素對糖代謝速率的影響生物素對糖代謝速率的影響，主要是影響糖降解速率，而不是影響EMP與HMP途徑的比率。在生物素充足條件下，丙酮酸以后的氧化活性雖然也有提高，但由于糖降解速率顯著提，打破了糖降解速率與丙酮酸氧化速率之間的平衡，丙酮酸趨于生成乳酸的反應，因而會起乳酸的溢出。2）生物素對CO2的固定反應生物素是丙酮酸羧化酶的輔酶，參與CO2固定反應，據(jù)報道，生物素大過量時(100ug/L以上）CO2，固定反應可提高30％。3）生物素對乙醛酸循環(huán)的影響乙醛酸循環(huán)的關鍵酶異檸檬酸裂解酶受葡萄糖、琥珀酸阻遏，為醋酸所誘導。以葡萄糖原料發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸時，通過控制生物素亞適量，幾乎看不到異檸檬酸裂解酶的活性。4）生物素對細胞膜合成的調(diào)節(jié)作用。6細胞膜的滲透性的控制方法

細胞膜通透性的控制方法大致可以分為兩種類型:一類是通過控制磷脂的合成來控制細胞膜通透性。另一類是通過控制細胞壁的合成間接控制細胞膜通透性?？刂屏字暮铣?）生物素缺陷型使用生物素缺陷型菌株進行谷氨酸發(fā)酵，通過限制發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素的濃度控制脂肪酸生物合成，從而控制磷脂的合成。作用機制:生物素作為催化脂肪酸生物合成最初反應的關鍵酶乙酰CoA羧化酶的輔酶參與了脂肪酸的合成，進而影響磷脂的合成。2)添加表面活性劑如吐溫－60或飽和脂肪酸(C16一C18)使用生物素過量的原料(如糖蜜等)發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸時，通過添加表面活性劑(如吐溫-60)或是高級飽和脂肪酸(C16一C18)及其親水聚醇酯類，同樣能清除滲透障礙物，大量積累谷氨酸。作用機制:在不飽和脂肪酸的合成過程中，作為生物素的拮抗物具有抑制脂肪酸的合成作用。通過拮抗脂肪酸的生物合成，導致磷脂合成不足，結果形成磷脂不足的細胞膜，提高了細胞膜對谷氨酸的滲透性。影響產(chǎn)酸的關鍵:必須控制好添加表面活性劑、飽和脂肪酸的時間與濃度，必須在藥劑添加后，在這些藥劑存在下，再次進行菌的分裂增殖，形成處于異常生理狀態(tài)的產(chǎn)酸型細胞，即完成谷氨酸非積累型細胞向谷氨酸積累型細胞的轉(zhuǎn)變。3)油酸缺陷型使用油酸缺陷型菌株進行谷氨酸發(fā)酵，通過限制發(fā)酵培養(yǎng)基中油酸的濃度而控制磷脂的合成。作用機制:由于油酸缺陷突變株阻斷了油酸的后期合成，喪失了自身合成油酸的能力;即喪失脂肪酸生物合成能力，必須由外界供給油酸，才能生長。故油酸含量的多少，直接影響到磷脂合成量的多少和細胞膜的通透性;通過控制油酸亞適量，使磷脂合成量減少到正常量的1/2左右時，細胞變形，谷氨酸分泌于細胞外?？刂频年P鍵:對油酸缺陷突變株的谷氨酸產(chǎn)生菌來說，最重要的因素是細胞內(nèi)的油酸含量，必須控制油酸亞適量，而細胞內(nèi)生物素、棕櫚酸等飽和脂肪酸的含量多少卻影響甚微。若油酸過量時，則‘長菌不產(chǎn)酸或長菌好產(chǎn)酸少’；只有在油酸亞適量的條件下，當油酸耗盡后，谷氨酸菌經(jīng)再度倍增，發(fā)生細胞膜結構與功能上的特異性變化，除去谷氨酸向膜外漏出的滲透障礙物，谷氨酸才能高產(chǎn)。4)甘油缺陷型使用甘油缺陷型菌株進行谷氨酸發(fā)酵，通過限制發(fā)酵培養(yǎng)基中甘油的濃度而控制磷脂的合成。作用機制:甘油缺陷突變株的遺傳阻礙是喪失ɑ-磷酸甘油脫氫酶，所以自身不能合成ɑ-磷酸甘油和磷脂，必須由外界供給甘油才能生長。在甘油限量供應下，由于控制了細胞膜透性?？刂频年P鍵：必須控制添加亞適量的甘油或甘油衍生物(添加0.02%)對于甘油缺陷型菌株，其細胞內(nèi)的磷脂可以由添加甘油的數(shù)來調(diào)節(jié)。添加甘油過少，菌株生長不好，數(shù)量不夠，周期長，產(chǎn)酸低；甘油過量，磷脂合正常，只長菌不產(chǎn)酸或長菌好產(chǎn)酸低；只有控制甘油亞適量時，開始菌體正常生長，當甘油耗盡以后，通過再度增殖，細菌變形，細胞磷脂含量降為親株的50％以下，從而破壞了細胞膜對谷氨酸的滲透障礙，使谷氨酸向膜外滲透。5）溫度敏感突變株機制：利用溫度敏感菌株，當溫度變化時，參與合成細胞膜結構的酶的遺傳密碼轉(zhuǎn)換（A-T變G-C或反之）或顛換（A-T變?yōu)門-A或C-G變?yōu)镚-C），使得合成的酶的失活，從而不能形成完整的細胞膜結構?？刂脐P鍵：溫度轉(zhuǎn)換時間。

阻礙細胞壁的合成作用機制:(抗生素）抑制細胞壁糖肽轉(zhuǎn)肽酶活性，影響細胞壁糖肽的生物合成。控制關鍵：添加時間。第四章谷氨酸發(fā)酵菌及其

擴大培養(yǎng)1谷氨酸生產(chǎn)菌形態(tài)及生理方面共同的特征：細胞形態(tài)為球狀、棒狀或短桿狀；革蘭氏染色陽性，無芽抱，無鞭毛，不能運動；發(fā)酵中菌體發(fā)生明顯的形態(tài)變化，同時發(fā)生細胞膜滲透性的變化；都是需氧型微生物；脲酶強陽性和生物素缺陷型；CO2固定反應酶系活力強，檸檬酸合成酶、烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶和谷氨酸脫氫酶活力強；異檸檬酸裂解酶活力欠缺或微弱，乙醛酸循環(huán)弱；a-酮戊二酸氧化能力缺失或弱；還原型輔酶II(NADPH2，)進入呼吸鏈能力弱；不分解淀粉、纖維素、油脂、酪蛋白以及明膠，能利用醋酸，不能利用石蠟；具有向環(huán)境中泄露谷氨酸的能力；不分解利用谷氨酸，并能耐高濃度的谷氨酸，產(chǎn)谷氨酸5％以上。2依據(jù)谷氨酸合成特點，提出發(fā)酵菌株選育方法（一）選育耐高滲透壓菌株1．耐高糖

選在20一30％葡萄糖的平板上生長好的突變株。2．耐高谷氨酸

選育在15-20％味精的平板上生長好的突變株。3．耐高糖、高谷氨酸選育在20％葡萄糖加15％味精的平板上生良好的突變株。谷氨酸發(fā)酵，目的是積累谷氨酸。如果菌種一邊合成谷氨酸，一邊分解利用谷氨酸，就達不到積累谷氨酸的目的。所以必須使菌種不能分解利用谷氨酸，即選育以谷氨酸為唯一碳源菌體不長或生長微弱的突變株。(二)選育不分解利用谷氨酸的突變株（三）選育細胞膜滲透性好的突變株1.抗Vp類衍生物據(jù)有關資料報道，抗Vp類衍生物如香豆素、蘆丁等能遺傳性地改變細胞膜的滲透性。2.選育溶菌酶敏感性突變株谷氨酸菌對溶菌酶都不敏感。用溶菌酶破壁時，首先用青霉素預處理后才能破壁。如果經(jīng)誘變處理，使菌種對溶菌酶敏感，就便菌種的細胞壁網(wǎng)狀結構變得較松散，細胞壁對細胞膜的保護作用降低，滲透性變大。3.選育二氨基庚二酸缺陷型突變株

二氨基庚二酸是谷氨酸菌細胞壁的組成成分，選育二氨基庚二酸缺陷突變株，限量添加二氨基庚二酸，使細胞壁合成不完整，細胞壁對細胞膜的保護作用降低，滲透性變大。4.選育溫度敏感性突變株谷氨酸溫度敏感突變株的突變位點發(fā)生在與谷氨酸分泌有密切關系的細胞膜結構基因上，常發(fā)生順反子中堿基的轉(zhuǎn)換或顛換，一個堿基為另一個堿基所置換，這樣為該順反子所控制的酶對溫度敏感，容易受熱失活，即在低溫下正常表達而在高溫下失活，導致細胞膜某些結構的改變。（四）選育強化CO2固定反應的突變株1.選育以琥珀酸為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長快、大的菌株。以琥珀酸為唯一碳源，菌體要想生長，碳代謝必須走四碳二羧酸的脫羧反應。菌體生長越快，四碳二羧酸的脫羧反應越強，而四碳二羧酸的脫羧反應與二氧化碳固定反應是相同酶所催化的，所以以琥珀酸為唯一碳源，菌體長得越好，二氧化碳固定反應越強。2.選育氟丙酮酸敏感性突變株氟丙酮酸是丙酮酸脫氫酶的抑制劑，菌種對氟丙酮酸越敏感，說明菌種丙酮酸向乙酰CoA的轉(zhuǎn)化反應越弱，相對地CO2固定反應比例也就越大。（五）選育減弱乙醛酸循環(huán)的突變株四碳二竣酸是由CO2固定反應和乙醛酸循環(huán)所提供的，減弱乙醛酸循環(huán)，CO2固定反應所占的比例就會增大，谷氨酸的產(chǎn)率就高。1.選育琥珀酸敏感型突變株琥珀酸是乙醛酸循環(huán)關鍵酶異檸檬酸裂解酶的阻遏物，菌種對琥珀酸越敏感，異檸檬酸裂解酶的合成能力越弱，乙醛酸循環(huán)就越弱。2.選育不利用醋酸的突變株

以醋酸為唯一碳源，菌種要生長，必須走乙醛酸循環(huán)。如果菌種不能利用乙酸，說明乙醛酸循環(huán)受阻。3利用基因工程技術，使異檸檬酸裂解酶活力降低。

(七)選育強化三羧酸循環(huán)中從檸檬酸到a-酮戊二酸代謝的突變株(八)選育解除谷氨酸對谷氨酸脫氫酶反饋調(diào)節(jié)的突變株第五章谷氨酸發(fā)酵過程控制1生物素對Glu發(fā)酵的影響在谷氨酸發(fā)酵中，生物素的作用主要影響谷氨酸產(chǎn)菌細胞膜的谷氨酸通透性，同時也影響菌體的代謝途徑。如果生物素過量，就大量繁殖而不產(chǎn)或少產(chǎn)谷氨酸，而產(chǎn)乳或琥珀酸。在生產(chǎn)中表現(xiàn)為長菌快，耗氧快，pH低，液氨消耗多。若生物素不足，菌體長不好，谷氨酸產(chǎn)量也低，表現(xiàn)為長菌慢，耗糖慢，發(fā)酵周期長。當供氧不足，生物素過量，發(fā)酵向乳酸發(fā)酵轉(zhuǎn)換。供氧充足，生物素過量，糖代謝傾向于完全氧化。2溶解氧對發(fā)酵的影響好氣發(fā)酵供氧主要包括化學工程學和微生物生理學兩方面，在氨基酸發(fā)酵中，氧與C源和N源一樣是需要大量供應的原料之一。（1）生理學方面氧參與生物氧化獲得ATP，能量參與谷氨酸合成。氨基酸合成過程中NAD（P）H2在氧存在下才能被氧化成NAD（P）。1)能量獲取：谷氨酸菌為好氧菌，在生長過程中，菌體的呼吸作用需要氧氣，完成生物氧化，獲得生長和菌體代謝的能量ATP。2)代謝產(chǎn)物合成：氨基酸合成過程中需要氧氣將還原態(tài)NAD（P）H2（還原酶）氧化成氧化態(tài)的NAD（P）（氧化酶）。當氧氣不足，NAD（P）H2氧化受阻，谷氨酸生成受抑制。二、化學過程方面研究認為：當DOT（溶解氧）高于臨界值時溶氧對微生物的呼吸速率沒有影響；而當DOT低于該值時則呼吸速率下降。具體表現(xiàn)在：菌體生長期：

1）供養(yǎng)必須滿足呼吸需要；

2）當溶氧低于臨界氧分壓時，菌體呼吸受抑制，乳酸積累增強，谷氨酸發(fā)酵受抑制；

3）高供氧時，菌體生長受抑制，菌體不能有效產(chǎn)生Glu。谷氨酸生成期：

1谷氨酸發(fā)酵在細胞最大呼吸速率時，Glu產(chǎn)量最大；

2當供氧不足，Glu合成緩慢；

3供氧過量，從發(fā)酵開始，菌體生長、耗糖就不良，幾乎不產(chǎn)生Glu（高氧阻害：即超氧基O2-引起，它對細胞代謝的許多方面具有破壞性，可引起許多酶氧化）。3泡沫對發(fā)酵的影響泡沫過多的影響：發(fā)酵液逃逸而造成浪費；引起污染；減少發(fā)酵罐的裝填系數(shù)，降低了設備利用率；影響氧的傳遞和通氣攪拌效果；影響菌體的正常呼吸作用，甚至使菌體體自溶。4.噬菌體侵染的異常現(xiàn)象典型特征：二高三低。pH高：NH3·H2O利用低；殘?zhí)歉撸禾抢玫蚈D低：噬菌體侵染，細胞增殖緩慢；溫度低：微生物代謝慢，生物熱產(chǎn)生降低谷氨酸低：微生物量少，代謝慢。第六章谷氨酸的提取2007-10-221等電點提取谷氨酸的原理谷氨酸分子中有兩個羧基和一個堿性氨基，其等電點為pH3.22，當Glu所處溶液的pH等于其等電點時，它的溶解度最低，glu會以晶體析出，得以和發(fā)酵液中的殘?zhí)堑入s質(zhì)分離。

谷氨酸等電點的性質(zhì)：溶解度最小，在pI時正負電荷相等，總靜電荷等于零，形成偶極離子，在直流電場下，既不向正極，也不向陰極移動，此時glu分子相互碰闖，通過引力作用結合成較大的聚集體而沉淀出。因而在pI時，glu的溶解度最小。2影響谷氨酸溶解度的因素（1）pH（2）溫度(3)雜質(zhì)影響:如殘?zhí)恰被?、菌體、膠體等3.影響谷氨酸結晶的因素（1）谷氨酸含量太低（<3.5%），難以結晶太高（>8.0%），β-型結晶比例增加2）溫度與降溫速度>30oC，β-型結晶明顯增加。3）加酸速度和終pH加酸速度過快是β-型結晶產(chǎn)生的重要原因。4）投晶種與育晶

投晶種關鍵：使用質(zhì)量好的晶種掌握恰當?shù)耐斗艜r間育晶5）攪拌6）殘?zhí)?）菌體第七章谷氨酸制味精二、中和液除鐵、除鋅1.中和液中鐵、鋅離子的來源鐵離子：由于生產(chǎn)原材料不純而夾帶鐵離子，特別是設備的腐蝕而游離出較多的鐵離子。鋅離子：則主要是提取工藝采用鋅鹽法而帶入谷氨酸中，一般含鋅離子1