綜合實驗之以α-胰凝乳蛋白酶為催化劑在有機溶劑中合成N-保護的亮-腦啡肽三肽片段

Comprehensivedesignexperiment,Nov10,2016綜合實驗之

以α-胰凝乳蛋白酶為催化劑在有機溶劑中合成N-保護的亮-腦啡肽三肽片段1.原理2.實驗藥品3.實驗步驟(1)HCl·Gly-Gly-OEt的合成(2)HCl·Tyr-OEt的合成(3)Z-Tyr-OEt的合成(4)以α-胰凝乳蛋白酶合成Z-Tyr-Gly-Gly-OEt4.問題總結(jié)(實驗討論)5.產(chǎn)率計算2catalogueCATALOGUEGly-Gly在氯化亞砜作用下酯化，得到甘氨酰甘氨酸乙酯鹽酸鹽（HCl·Gly-Gly-OEt）3experimentalprinciplePRINCIPLES酪氨酸在氯化亞砜作用下酯化，得到酪氨酸乙酯鹽酸鹽（HCl·Tyr-OEt）；而后酪氨酸乙酯與芐氧羰酰氯（Z-Cl）在堿性條件下反應(yīng)，得到芐氧羰酰酪氨酸乙酯（Z-Tyr-OEt）4experimentalprinciplePRINCIPLESZ-Tyr-OEt與Gly-Gly-OEt在二氯甲烷中以α-胰凝乳蛋白酶催化得到亮-腦啡肽的前三肽，即N-保護的芐氧羰酰酪氨酰甘氨酰甘氨酸乙酯（Z-Tyr-Gly-Gly-OEt）。5experimentalprinciplePRINCIPLES6ExperimentalchemicalsCHEMICALS7ExperimentalchemicalsCHEMICALS程序取8mL無水乙醇，用冰鹽浴冷至-10℃，緩慢滴入2mL氯化亞砜，加完后繼續(xù)攪拌20min。加入Gly-Gly1.0g，室溫攪拌3天。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓除去溶劑得到大量固體experimentalprocedureHCl·Gly-Gly-OEt的合成89程序取8mL無水乙醇，用冰鹽浴冷至-10℃，緩慢滴入2mL氯化亞砜，加完后繼續(xù)攪拌20min。加入Tyr1.0g，室溫攪拌3天

experimentalprocedure

現(xiàn)象氯化亞砜在受熱和有水的條件下易分解。實驗過程中產(chǎn)生有刺激性氣味的氣體。塞子差點被氣體沖開。生成透明液體。生成淡黃色透明液體，非均相體系HCl·Tyr-OEt的合成

經(jīng)驗要不時放氣以免塞子被氣體沖出造成危險(Q關(guān)于氯化亞砜的討論)10experimentalprocedureHCl·Tyr-OEt的合成程序現(xiàn)象用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓除去溶劑得到大量固體，用乙醇－乙醚重結(jié)晶后得產(chǎn)物貼士乙醇加5毫升以內(nèi),然后加熱溶解,否則之后需要加大量乙醚才能夠?qū)a(chǎn)物析出(Q關(guān)于重結(jié)晶的討論Q關(guān)于旋蒸的討論)結(jié)晶時加了10毫升乙醇（加多了），然后加了50毫升乙醚才重新析出。析出大量白色沉淀。風干一周后稱量得到1克白色粉裝固體經(jīng)驗experimentalprocedureZ-Tyr-OEt的合成程序現(xiàn)象將HCl·TyrOEt0.81g懸浮于16mLEtOAc中，加了16.3mlEtOAc，得到油狀液體。加入KHCO32.0g的13mL水溶液，冰浴下快速攪拌15min內(nèi)滴加Z-Cl的苯甲醇溶液0.7mL(5.7mmol/mL)。加完后攪拌20min，撤去冰浴，室溫再攪拌2-3h。經(jīng)驗(Q碳酸氫鉀的作用)無明顯變化11experimentalprocedureZ-Tyr-OEt的合成程序現(xiàn)象反應(yīng)結(jié)束后用4mol/L的鹽酸酸化，使水相pH為1，分出有機相，用水、飽和的食鹽水洗滌，硫酸鎂干燥，減壓蒸除溶劑后，余淡黃色油狀物，置于冰箱中，緩慢結(jié)晶，過濾得第一批晶體，母液中加入石油醚再結(jié)晶得第二批晶體經(jīng)驗如果pH未到1，可用水多洗幾次如果晶體很難析出，可以加一點小晶種影響結(jié)晶下層為水層，上層為淺黃色旋蒸后的黃色油狀液體，很難析出第一次就加入了石油醚，冷卻才析出晶體。0.51克白色晶體。12experimentalprocedure以α-胰凝乳蛋白酶合成Z-Tyr-Gly-Gly-OEt程序現(xiàn)象取Z-Tyr-OEt270mg(0.8mmol)與HCl·Gly-Gly-OEt160mg(0.8mmol)懸浮于4mL二氯甲烷中，加入三乙胺224uL(2.0mmol)并在震蕩混合器上震蕩使底物完全溶解，此時體系的表觀pH值約為10，反應(yīng)液為一透明溶液note一定要先適當潤濕試紙再測pH（Q為什么需用水潤濕試紙呢？什么情況下試紙需要潤濕后再測pH？Q為什么需要調(diào)節(jié)pH為10）

調(diào)節(jié)pH時，開始未潤濕試紙故顏色一直不準確，當潤濕過后，試紙顏色紫藍色，已超過10.經(jīng)驗13experimentalprocedure以α-胰凝乳蛋白酶合成Z-Tyr-Gly-Gly-OEt程序現(xiàn)象加入α-胰凝乳蛋白酶8mg和32uL水(0.4%V/V)室溫下攪拌反應(yīng)1-2天后，反應(yīng)液中有白色沉淀產(chǎn)生。note酶不能加過多.(Q水的作用?)得白色渾濁液體.經(jīng)驗14experimentalprocedure以α-胰凝乳蛋白酶合成Z-Tyr-Gly-Gly-OEt程序現(xiàn)象反應(yīng)3天后，將反應(yīng)液過濾，濾餅依次用二氯甲烷,1mol/L鹽酸、去離子水洗滌。用丙酮重結(jié)晶。貼士得白色渾濁液體，抽濾時產(chǎn)物大量消耗，最后只得0.13克產(chǎn)物。因為產(chǎn)物溶解于于二氯甲烷,故洗滌時一定要小心.第二步用丙酮結(jié)晶時一定要耐心保證產(chǎn)物全部溶解與丙酮中再開始抽濾,并且由于前一步用了加熱方法使產(chǎn)物溶解,抽濾時盡量迅速.我就是由于溶解時沒完全,抽濾時用錯了燒瓶于是抽濾了兩遍,導致大量產(chǎn)物堆積于漏斗管,使產(chǎn)率偏低15Questions問題總結(jié)Q1關(guān)于氯化亞砜的討論Q2關(guān)于重結(jié)晶的討論Q3andQ4常用分離除雜方法Q5關(guān)于旋蒸的討論Q6碳酸氫鉀的作用Q7為什么酶的量不能加過量?Q8加入32ul水的作用?Q9為什么需用水潤濕試紙呢？什么情況下試紙需要潤濕后再測pH？Q10為什么需要調(diào)節(jié)pH為10？16discussions問題總結(jié)17Q1氯化亞砜的作用遇水遇熱易分解：SOCl2+2H2O===H20+SO2+2HCl在HCl·Gly-GLy-OEt、HCl·Tyr-OEt合成中的作用：作為氯化劑；使成酯反應(yīng)更易進行，與一般酯化不同的是，在氯化亞砜的作用下，酯基中的兩個氧原子都來自于羧基。discussions問題總結(jié)18Q2關(guān)于重結(jié)晶的討論原理：利用混合物中各組分在某種溶劑中溶解度不同或在同一溶劑中不同溫度時的溶解度不同而使它們相互分離。步驟：（1）選擇適宜溶劑，制成熱的飽和溶液。（2）熱過濾，除去不溶性雜質(zhì)（包括脫色）。（3）冷卻結(jié)晶、抽濾，除去母液。（4）洗滌干燥，除去附著母液和溶劑。discussions問題總結(jié)19經(jīng)常采用以下試驗的方法選擇合適的溶劑：取0.1g目標物質(zhì)于一小試管中，滴加約1mL溶劑，加熱至沸。若完全溶解，且冷卻后能析出大量晶體，這種溶劑一般認為可以使用。如樣品在冷時或熱時，都能溶于1mL溶劑中，則這種溶劑不可以使用。若樣品不溶于1mL沸騰溶劑中，再分批加入溶劑，每次加入0.5mL，并加熱至沸?？偣灿?mL熱溶劑，而樣品仍未溶解，這種溶劑也不可以使用。若樣品溶于3mL以內(nèi)的熱溶劑中，冷卻后仍無結(jié)晶析出，這種溶劑也不可以使用。discussions問題總結(jié)20混合溶劑：先用良溶劑在較高一些的溫度溶解，必要的話可熱過濾除去不溶雜質(zhì)，溶液慢慢加入不良溶劑，至剛剛開始出現(xiàn)少量渾濁且不消失，此時再加少量良溶劑使沉淀剛剛好完全溶解，停止加熱和攪拌，讓溶液慢慢冷卻到室溫結(jié)晶，必要的話可以放入冰箱，過濾出晶體，并用少量預(yù)冷的混合溶劑洗滌晶體，干燥稱重。discussions問題總結(jié)21Q3常用分離提純方法1.結(jié)晶和重結(jié)晶：利用物質(zhì)在溶液中溶解度隨溫度變化較大，如NaCl，KNO3。2.蒸餾冷卻法：在沸點上差值大。乙醇中(水)：加入新制的CaO吸收大部分水再蒸餾。3.過濾法4.升華法：其中一種固體容易發(fā)生升華現(xiàn)象而另一種不,如固體碘和另一種固體混合物5.萃取法：利用化合物在兩種互不相溶（或微溶）的溶劑中溶解度或分配系數(shù)的不同6.溶解法：Fe粉(Al粉)：溶解在過量的NaOH溶液里過濾分離。7.增加法：把雜質(zhì)轉(zhuǎn)化成所需要的物質(zhì)：CO2(CO)：通過熱的CuO；CO2(SO2)：通過NaHCO3溶液。8.吸收法：除去混合氣體中的氣體雜質(zhì)，氣體雜質(zhì)必須被藥品吸收：N2(O2)：將混合氣體通過銅網(wǎng)吸收O2。9.轉(zhuǎn)化法：兩種物質(zhì)難以直接分離，加藥品變得容易分離，然后再還原回去：Al(OH)3，F(xiàn)e(OH)3：先加NaOH溶液把Al(OH)3溶解，過濾，除去Fe(OH)3，再加酸讓NaAlO2轉(zhuǎn)化成A1(OH)3。discussions問題總結(jié)22Q4常用除雜方法1.雜質(zhì)轉(zhuǎn)化法2.吸收洗滌法3.沉淀過濾法。4.加熱升華法5.溶劑萃取法6.溶液結(jié)晶法7.分餾蒸餾法8.分液法:欲將密度不同且又互不相溶的液體混合物分離，可采用此法，如將苯和水分離。9.滲析法:一種以濃度差為推動力的膜分離操作欲除去膠體中的離子，可采用此法。如除去氫氧化鐵膠體中的氯離子。10.綜合法discussions問題總結(jié)23Q5旋蒸原理旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀主要用于在減壓條件下連續(xù)蒸餾大量易揮發(fā)性溶劑。尤其對萃取液的濃縮和色譜分離時的接收液的蒸餾，可以分離和純化反應(yīng)產(chǎn)物。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的基本原理就是減壓蒸餾，也就是在減壓情況下，當溶劑蒸餾時，蒸餾燒瓶在連續(xù)轉(zhuǎn)動。discussions問題總結(jié)24Q6碳酸氫鉀的作用使用KHCO3調(diào)節(jié)pH至堿性，使氨基游離，而有利于親核反應(yīng)的進行。使芐氧羰酰氯與Tyr-OEt反應(yīng)，生成Z-Tyr-OEt從而保護氨基；為什么不能用KOH調(diào)節(jié)pH?因為制取Z-TyrOEt的反應(yīng)為親核取代反應(yīng),反應(yīng)中生成2分子的HCl，實驗中采用KHCO3，，形成堿性環(huán)境，吸收HCl，使整個反應(yīng)向右移動，增大產(chǎn)率；此反應(yīng)在堿性環(huán)境中進行，也是為使-NH2能穩(wěn)定存在，但不能采用Na2CO3或KOH，因為其堿性太強，酯類易水解。discussions問題總結(jié)25Q8加入32ul水的作用?微量的水對酶在有機介質(zhì)中的活性影響很大。酶在完全干燥的溶劑體系里基本上是不顯催化能力的,但如果水加過量會導致酶活性的降低。Q7為什么酶的量不能加過量?開始增加酶的量，反應(yīng)速率會加快，當?shù)竭_一定濃度過后，速率就決定于底物的濃度而不是酶的濃度了。再增加酶的量，還有可能會抑制反應(yīng)進行。discussions問題總結(jié)26Q9為什么需用水潤濕試紙呢？什么情況下試紙需要潤濕后再測pH？pH試紙測試的是溶液中的氫離子濃度，加水是為了促進有機溶液電離，更方便測pH。除了這種情況，