第二章基因工程概論

基因工程GeneEngineering【部分參考資料】

基因工程，樓士林等編著，科學(xué)出版社，2002年基因工程概論，張惠展，華東理工大學(xué)出版社，2005年基因工程，李立家、肖庚富編著，科學(xué)出版社，2004年基因操作原理，瞿禮嘉、顧紅雅譯，高等教育出版社，2003年基因克隆和DNA分析，魏群等譯，高等教育出版社，2003年……當(dāng)今世界重大問(wèn)題：人口膨脹食物短缺能源匱乏疾病猖獗環(huán)境污染生態(tài)失衡生物物種消亡問(wèn)題的解決依賴于現(xiàn)代生物技術(shù)!饑餓和肥胖是一個(gè)全球性的問(wèn)題，目前地球上仍有超過(guò)10%，全世界約有8億人處于饑餓狀態(tài)，與此同時(shí)，有10億人處于超肥胖狀態(tài)，這一對(duì)數(shù)字的對(duì)比是如此鮮明。在世界上所有國(guó)家，肥胖與饑餓、貧困與富有之間的矛盾正變得日益尖銳。

拉吉·帕特爾曾經(jīng)為世界銀行工作，在世界貿(mào)易組織實(shí)習(xí)，為聯(lián)合國(guó)提供咨詢;但現(xiàn)在他投身于反對(duì)他的這些前雇主的國(guó)際運(yùn)動(dòng)中去。目前，他受聘為南非夸祖魯-納塔爾大學(xué)研究員，是加州大學(xué)伯克利分校非洲研究中心的訪問(wèn)學(xué)者。他先后獲得牛津大學(xué)文學(xué)學(xué)士學(xué)位和倫敦經(jīng)濟(jì)學(xué)院碩士學(xué)位，最后在康奈爾大學(xué)獲得發(fā)展社會(huì)學(xué)博士學(xué)位。2008年7月18日，在美國(guó)紐約聯(lián)合國(guó)總部，聯(lián)合國(guó)秘書(shū)長(zhǎng)潘基文（左）在聯(lián)大全會(huì)上與聯(lián)大主席克里姆交談。第62屆聯(lián)合國(guó)大會(huì)18日就全球糧食和能源危機(jī)問(wèn)題舉行特別會(huì)議，討論如何加強(qiáng)國(guó)際合作與協(xié)調(diào)，以應(yīng)對(duì)糧食和能源價(jià)格上漲所帶來(lái)的挑戰(zhàn)。

生物燃料戰(zhàn)略是一個(gè)錯(cuò)誤?德國(guó)民間機(jī)構(gòu)“糧食監(jiān)督委員會(huì)”干事長(zhǎng)蒂羅·博德認(rèn)為，“生物燃料戰(zhàn)略是一個(gè)威脅人類生存的錯(cuò)誤”，主張停止生產(chǎn)生物燃料。專家指出，一方面，全球糧食儲(chǔ)備已從2010年的1.75億噸下降到目前的1億噸。另一方面，生物燃料每年卻要“吃掉”1.5億噸糧食。如果停止其生產(chǎn)，全球就有足夠的糧食儲(chǔ)備，糧價(jià)也不會(huì)暴漲。光明日?qǐng)?bào)維也納2012年9月5日電美國(guó)汽車從人畜嘴里搶糧！

基因工程是現(xiàn)代生物技術(shù)的核心動(dòng)植物改良生物制藥蛋白質(zhì)工程組織工程代謝工程細(xì)胞工程基因工程美科學(xué)家首次提出:

人類智商和基因有關(guān)美科學(xué)家培育出

首個(gè)轉(zhuǎn)基因人類胚胎第一章緒論

基因工程概況教學(xué)目的和要求：掌握基因工程的基本概念熟悉基因工程的基本原理和過(guò)程了解基因工程的發(fā)展歷史和重要成就

第一章緒論

基因工程概況第一節(jié)基因工程的誕生

第二節(jié)基因工程的成就

第三節(jié)基因工程研究的內(nèi)容

第一節(jié)基因工程的誕生

理論與技術(shù)支持理論上的三大發(fā)現(xiàn)：①證明了生物的遺傳物質(zhì)是DNA②DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機(jī)理③中心法則和三聯(lián)體密碼子系統(tǒng)的建立（1）肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（2）噬菌體轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)DNA是遺傳物質(zhì)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)DNA半保留復(fù)制機(jī)理中心法則DNA

RNA

protein三聯(lián)體密碼子系統(tǒng)

第一節(jié)基因工程的誕生

理論與技術(shù)支持技術(shù)上的三大發(fā)現(xiàn)：①限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)②載體的使用③逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)載體的使用

逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)

第一節(jié)基因工程的誕生

發(fā)展簡(jiǎn)史

第一個(gè)實(shí)現(xiàn)DNA重組的實(shí)驗(yàn)①1972年，美國(guó)斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的P.Berg在世界上第一次成功地實(shí)現(xiàn)了DNA的體外重組

②對(duì)猿猴病毒SV40的DNA和λ噬菌體的DNA進(jìn)行重組

③“在任何時(shí)候，創(chuàng)新性的思維都是最寶貴的。”

P.Berg

1980年，獲Nobel化學(xué)獎(jiǎng)第一節(jié)基因工程的誕生

發(fā)展簡(jiǎn)史

第一次實(shí)現(xiàn)重組體轉(zhuǎn)化成功的實(shí)驗(yàn)

①1973年，科恩（Coher）和博耶（Boyer）建立的基因工程基本模式

②對(duì)猿大腸桿菌的抗四環(huán)素的質(zhì)粒PSC101和來(lái)自鼠傷寒沙門(mén)氏菌的抗鏈霉素和磺胺的質(zhì)粒RSF1010進(jìn)行重組表達(dá)標(biāo)志著基因工程的誕生

Cohen和Boyer的實(shí)驗(yàn)StanleyCohen

1986年，獲Nobel生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)HerbBoyer

世界上第一家利用重組DNA技術(shù)

制造蛋白質(zhì)用于治療人體疾病的公司（Genentech）全球十大生物技術(shù)公司

※全球生物技術(shù)公司的領(lǐng)頭羊—美國(guó)安進(jìn)公司（Amgen）※丹麥諾和諾德公司（NovoNordisk）※生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域的探路先鋒—美國(guó)基因技術(shù)公司（Genentech）※

Serono公司—意大利羅馬※

Biogen公司—瑞士日內(nèi)瓦※

Chiron公司—美國(guó)※

Genzyme公司—美國(guó)※

Immunex公司—美國(guó)※MedImmune公司—美國(guó)※CSL公司—澳大利亞第二節(jié)基因工程的成就1972-1976年，日本，somatostatin（生長(zhǎng)抑素）1978年，美國(guó)，生長(zhǎng)激素基因（HGH）1980年，美國(guó)/瑞士，a干擾素－基因1984年，日本，白細(xì)胞介素2（IL-2）1982年，美國(guó)，大鼠生長(zhǎng)激素基因轉(zhuǎn)入小鼠1983年，美國(guó)，Ti質(zhì)粒導(dǎo)入植物細(xì)胞1990年，美國(guó)，腺苷脫氨酶（ADA）基因治療，重度聯(lián)合免疫缺陷癥（SDID）1991年，美國(guó)倡導(dǎo)，人類基因組計(jì)劃1997年，美國(guó)人，威爾英特克隆多利綿羊

……

第三節(jié)基因工程研究的內(nèi)容

1、什么是基因工程？

按照人們事先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，在體外將不同來(lái)源的DNA分子進(jìn)行剪切重組，與載體DNA形成鑲嵌DNA分子（即重組DNA分子），然后將之導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使之在宿主細(xì)胞中擴(kuò)增表達(dá)，從而使宿主或宿主細(xì)胞獲得新的遺傳特性，或形成新的基因產(chǎn)物（劉祖洞，《遺傳學(xué)》）。第三節(jié)基因工程研究的內(nèi)容

1、什么是基因工程？

專指用生物化學(xué)的方法，在體外將各種來(lái)源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的DNA片段）與載體系統(tǒng)（病毒、細(xì)菌質(zhì)粒和噬菌體等）的DNA結(jié)合成一個(gè)重組的復(fù)制子。這樣形成的雜合分子可以在復(fù)制子所在的宿主生物或細(xì)胞中復(fù)制，繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，生長(zhǎng)和篩選轉(zhuǎn)化子，無(wú)性繁殖使之成為克隆。然后直接利用轉(zhuǎn)化子，或者將克隆的分子自轉(zhuǎn)化子分離后再導(dǎo)入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)體系，使重組基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生特定的基因產(chǎn)物（賀淹才，《簡(jiǎn)明基因工程原理》）。

第三節(jié)基因工程研究的內(nèi)容

1、什么是基因工程？

在分子水平上，提取（或合成）不同生物的遺傳物質(zhì)，在體外切割，再和一定的載體拼接重組，然后把重組的DNA分子引入細(xì)胞或生物體內(nèi)，使這種外源DNA（基因）在受體細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制與表達(dá)，按人們的需要繁殖擴(kuò)增基因或生產(chǎn)不同的產(chǎn)物或定向地創(chuàng)造生物地新性狀，并能穩(wěn)定地遺傳給后代。(李立家，肖庚富，《基因工程》)

第三節(jié)基因工程研究的內(nèi)容

1、什么是基因工程？

按人們的需要，用類似工程設(shè)計(jì)的方法將不同來(lái)源的基因（DNA分子），在體外構(gòu)建成雜種分子，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的操作。因此，人類利用基因工程技術(shù)，就有可能根據(jù)需要，通過(guò)體外重組，跨越生物種屬間的屏障，改變生物原有的遺傳特性，定向培養(yǎng)或創(chuàng)造新的生物品種（程備久，《現(xiàn)代生物技術(shù)概論》）。

第三節(jié)基因工程研究的內(nèi)容

2、相關(guān)名詞術(shù)語(yǔ)遺傳工程（Geneticengineering）基因工程（Geneengineering）基因操作（Genemanipulation）重組DNA技術(shù)（RecombinantDNAtechnique）基因克隆（Genecloning）基因修飾（Geneticmodification）分子克?。∕olecularcloning）遺傳工程和基因工程的差別

遺傳工程是指以改變生物有機(jī)體性狀特征為目標(biāo)的遺傳信息量的操作（themanipulationoftheinformationcontent），它既包括常規(guī)的選擇育種，也包括相對(duì)復(fù)雜的基因克隆等不同技術(shù)層次。第三節(jié)基因工程研究的內(nèi)容

3、理論依據(jù)不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)基因是可以切割的基因是可以轉(zhuǎn)移的多肽與基因之間存在對(duì)應(yīng)關(guān)系遺傳密碼是通用的基因可以通過(guò)復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代第三節(jié)基因工程研究的內(nèi)容

4、基本技術(shù)路線第三節(jié)基因工程研究的內(nèi)容

5、主要內(nèi)容①?gòu)墓w細(xì)胞中分離出基因組DNA，用限制性核酸內(nèi)切酶分別將外源DNA（包括外源基因或目的基因）和載體分子切開(kāi)（簡(jiǎn)稱切）；②用DNA連接酶將含有外源基因的DNA片段接到載體分子上，形成DNA重組分子（簡(jiǎn)稱接）；③借助于細(xì)胞轉(zhuǎn)化手段將DNA重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞中（簡(jiǎn)稱轉(zhuǎn)）；④短時(shí)間培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，以擴(kuò)增DNA重組分子或使其整合到受體細(xì)胞的基因組中（簡(jiǎn)稱增）；⑤篩選和鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞，獲得使外源基因高效穩(wěn)定表達(dá)的基因工程菌或細(xì)胞（簡(jiǎn)稱檢）。第三節(jié)基因工程研究的內(nèi)容

6、基本要素基因工具酶載體受體細(xì)胞第二章基因克隆所需的工具酶

教學(xué)目的和要求：掌握各種工具酶的基本特性

熟悉工具酶的使用方法和注意事項(xiàng)酶是DNA重組技術(shù)中必不可少的工具基因工程中所用的酶統(tǒng)稱為工具酶。

工具酶就其用途而言可分為三大類：限制性內(nèi)切酶、連接酶和修飾酶

第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）核酸酶=核酸外切酶（exonuclease）

+

核酸內(nèi)切酶（endonuclease）限制性核酸內(nèi)切酶的定義又簡(jiǎn)稱限制酶或內(nèi)切酶，一類能從DNA分子中間水解磷酸二酯鍵，從而切斷雙鏈DNA的核酸水解酶。第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）一、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)細(xì)菌細(xì)胞的限制—修飾體系1978年，W.Arber、H.O.Smith&D.Nathans獲諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)首批被發(fā)現(xiàn)的包括來(lái)源于大腸桿菌的EcoRI和EcoRII，以及來(lái)源于Heamophilusinfluenzae的HindII和HindIII“帶剪刀的仆人”的故事——瑞士微生物遺傳學(xué)家W·阿爾伯（1929－）的女兒西爾維婭講述

第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）二、限制性核酸內(nèi)切酶的類型按功能特性、大小及反應(yīng)時(shí)所需的輔助因子，分成三類：I、II、III類無(wú)用廣泛應(yīng)用用處不大通常提到的限制性核酸內(nèi)切酶主要指Ⅱ類酶而言第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）三、限制性核酸內(nèi)切酶的命名法分布極廣，幾乎在所有細(xì)菌的屬、種中都發(fā)現(xiàn)至少一種限制性內(nèi)切酶H．O．Smith和D．Nathans（1973年）提議的命名系統(tǒng)，已被廣大學(xué)者所接受一般是以微生物屬名的第一個(gè)字母和種名的前兩個(gè)字母組成，第四個(gè)字母表示菌株（品系）屬名+種名+株名BacillusamyloliquefaciensHHaemophilusinfluenzaedⅠ→BamH

→

HindⅠ第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）四、Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的基本特性1、識(shí)別特定的核苷酸序列識(shí)別長(zhǎng)度一般為4~8bp具有回文序列(palindrome)

＝6個(gè)（大多數(shù)）：如EcoRⅠ5’-GAATTC-3’<6個(gè)：如AsuⅠ5’-GGNCC-3’（5個(gè)）

MboⅠ5’-GATC-3’（4個(gè)）>6個(gè)：如NotⅠ5’-GCGGCCGC-3’（8個(gè)）識(shí)別序列有的限制酶識(shí)別序列包含在另一種限制酶內(nèi)

如：Sau3A識(shí)別：GATCBamHⅠ識(shí)別：GGATCC有的限制酶識(shí)別多種核苷酸序列如：HindⅡ識(shí)別4種核苷酸序列：

5’-CTPyPuAC-3’（Py→嘧啶堿基C或T；Pu→嘌呤堿基A或G）各種限制酶的識(shí)別序列一般都具有回文結(jié)構(gòu)限制酶：BamHⅠGGATCCCCTAGG5’3’5’3’正讀與反讀都相同以識(shí)別序列的中線為對(duì)稱軸，左右兩側(cè)堿基互補(bǔ)為便于書(shū)寫(xiě)，識(shí)別序列可以以5’→3’走向的單鏈DNA表示第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）四、Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的基本特性2、具有特定的酶切位點(diǎn)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）四、Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的基本特性3、切割類型兩條鏈上的斷裂位置是交錯(cuò)地、但又是對(duì)稱地圍繞著一個(gè)對(duì)稱軸排列兩條鏈上的斷裂位置是處在一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu)的中心T第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）四、Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的基本特性4、切割頻率P=（1/4）nn：酶識(shí)別的堿基數(shù)。切點(diǎn)數(shù)目＝分子大?。▔A基對(duì)數(shù)）×識(shí)別序列頻率第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）四、Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的基本特性5、同裂酶（isoschizomers）有一些來(lái)源不同的限制酶識(shí)別的是同樣的核苷酸靶子序列，這類酶稱為同裂酶。同裂酶的切點(diǎn)位置可相同或不同。（a）切點(diǎn)位置相同GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ（a）切點(diǎn)位置不同CCCGGGGGGCCCCGGGCCCCGGGC+XmaⅠCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCC+SmaⅠ第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）四、Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的基本特性6、同尾酶（isocaudamer）這一類的限制酶來(lái)源各異，識(shí)別的靶字序列也不相同，但產(chǎn)生相同的粘性末端。由一對(duì)同尾酶分別產(chǎn)生的粘性末端共價(jià)結(jié)合形成的位點(diǎn)，特稱之為“雜種位點(diǎn)”（hybridsite）。BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BglⅡAGATCTTCTAGAATCTAG

GATCTA第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）四、Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的基本特性7、稀切酶有較長(zhǎng)的識(shí)別序列和富含GC或AT的識(shí)別序列的限制性核酸內(nèi)切酶。基因操作中使用稀切酶可獲得大的片段。

第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）五、影響核酸內(nèi)切限制酶活性的因素

1、DNA的純度

2、DNA的甲基化程度

3、酶切消化反應(yīng)的溫度

4、DNA的分子結(jié)構(gòu)

5、核酸內(nèi)切限制酶的緩沖液

DNA的純度污染在DNA制劑中的蛋白質(zhì)、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸（EDTA）、SDS（十二烷基硫酸鈉）以及高濃度的鹽離子等，都有可能抑制核酸內(nèi)切限制酶的活性。

DNA的純度

提高核酸內(nèi)切酶對(duì)低純度DNA的反應(yīng)效率，一般采用3種方法：①增加核酸內(nèi)切限制酶的用量②擴(kuò)大酶催化反應(yīng)的體積③延長(zhǎng)酶催化反應(yīng)的保溫時(shí)間DNA的甲基化程度

識(shí)別序列中特定核苷酸的甲基化作用會(huì)強(qiáng)烈地影響酶的活性。

酶切消化反應(yīng)的溫度

不同的核酸內(nèi)切限制酶，具有不同的最適反應(yīng)溫度大多數(shù)核酸內(nèi)切限制酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度都是37℃，但也有例外的情況

DNA的分子結(jié)構(gòu)

切割線性分子的效率明顯高于切割超螺旋的質(zhì)粒DNA或病毒DNA識(shí)別序列的側(cè)面序列位點(diǎn)偏愛(ài)性

核酸內(nèi)切限制酶的緩沖液標(biāo)準(zhǔn)緩沖液組份包括：氯化鎂、氯化納或氯化鉀、Tris-HCl,?-巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）以及牛血清白蛋白（BSA）等

星性（Star）活性某些限制性核酸內(nèi)切酶在特定條件下，可以在不是原來(lái)的識(shí)別序列處切割DNA，這種現(xiàn)象稱為Star活性Star活性出現(xiàn)的頻率，根據(jù)酶、底物DNA、反應(yīng)條件的不同而不同

星性（Star）活性控制反應(yīng)條件，避免Star活性（避免高濃度的核酸內(nèi)切限制酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、用Mn2+取代Mg2+以及高pH值等誘導(dǎo)條件）第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）六、利用限制酶對(duì)DNA進(jìn)行消化的具體步驟

※建議遵循與酶一起提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作

※不同限制酶的緩沖液主要差別在于其中所含NaCl的濃度第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）六、利用限制酶對(duì)DNA進(jìn)行消化的具體步驟

①將DNA溶液加入一滅菌的微量離心管中并與適量水混勻，使總體積為18μ1；②加入2μl適當(dāng)?shù)?0×限制酶消化緩沖液，輕敲管外壁以混勻之；③加入1~2單位限制酶，輕彈管外壁以混勻；④將上述混合的反應(yīng)物置于適當(dāng)溫度并按所需的時(shí)間進(jìn)行溫育；⑤酶切反應(yīng)的終止⑥酶切結(jié)果分析第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）七、使用限制酶的注意點(diǎn)

①小心取用，節(jié)省開(kāi)支

；②操作要盡可能快，用完后立即將酶放回冰箱，以使酶在冰箱外放置的時(shí)間盡可能縮短

；③盡量減少反應(yīng)中的加水量以使反應(yīng)體積減到最小

；④通常延長(zhǎng)消化時(shí)間可使所需的酶量減少

第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）八、DNA分子片段化

1、單酶切法

2、雙酶切法

3、部分酶切法現(xiàn)有一長(zhǎng)度為1000堿基對(duì)（bp）的DNA分子，用限制性核酸內(nèi)切酶EcoR1酶切后得到的DNA分子仍是1000bp，用Kpn1單獨(dú)酶切得到400bp和600bp兩種長(zhǎng)度的DNA分子，用EcoRI、Kpnl同時(shí)酶切后得到200bp和600bp兩種長(zhǎng)度的DNA分子。第二節(jié)DNA連接酶一、DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)

1967年，世界上有多個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)而且獨(dú)立地發(fā)現(xiàn)。1974年以后，科學(xué)界正式肯定了這一發(fā)現(xiàn)，并把這種酶叫作DNA連接酶。

第二節(jié)DNA連接酶二、DNA連接酶的連接機(jī)理(演示)

一種封閉DNA鏈上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈5'-PO4與另一DNA鏈的3'-OH生成磷酸二酯鍵。如果是兩個(gè)或兩個(gè)以上不同的雙鏈DNA片段末端連接，則產(chǎn)生重組DNA分子。

第二節(jié)DNA連接酶三、常用的DNA連接酶1、E.coli

DNA連接酶

催化片段互補(bǔ)黏性末端之間的連接以NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，是一種轉(zhuǎn)遞電子的輔酶）作為輔助因子

第二節(jié)DNA連接酶三、常用的DNA連接酶2、T4DNA連接酶

不僅能催化片段互補(bǔ)黏性末端之間的連接，也能催化雙鏈DNA平末端之間的連接以ATP（腺嘌呤核苷三磷酸，又叫三磷酸腺苷）作為輔助因子

第二節(jié)DNA連接酶三、常用的DNA連接酶3、TscDNA連接酶

一種能夠在高溫下催化兩條寡核苷酸探針發(fā)生連接作用的核酸酶連接酶鏈反應(yīng)（ligasechainreaction，LCR）

第二節(jié)DNA連接酶四、DNA片段的連接方法

1、互補(bǔ)黏性末端片段之間的連接

既可用大腸桿菌DNA連接酶，也可用T4DNA連接酶同種限制酶切開(kāi)連接后保留原有切點(diǎn)；同尾酶切開(kāi)連接后失去原有的兩種限制性酶的識(shí)別序列

第二節(jié)DNA連接酶四、DNA片段的連接方法

2、平末端片段之間的連接

只能用T4DNA連接酶，但要增加酶用量同種限制酶切開(kāi)連接后保留原有切點(diǎn)；同尾酶切開(kāi)連接后失去原有的兩種限制性酶的識(shí)別序列有的新連接片段還可能形成新的限制酶切位點(diǎn)

第二節(jié)DNA連接酶四、DNA片段的連接方法

3、片段末端修飾后進(jìn)行連接

DNA片段末端同聚物加尾后連接黏性末端修飾成平末端后連接

DNA片段5’端脫磷酸化作用后連接DNA片段加連桿后連接DNA片段末端同聚物加尾后進(jìn)行連接黏性末端修飾成平末端后進(jìn)行連接DNA片段5’端脫磷酸化作用后連接DNA片段加連桿后連接寡核苷酸連桿（linker）是一種按預(yù)先設(shè)計(jì)化學(xué)合成的寡核苷酸片段，一般由8-12個(gè)核苷酸組成，具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的平末端的雙鏈寡核苷酸片段。DNA片段加連桿后連接設(shè)計(jì)合成的另一類寡核苷酸連桿由幾十至上百個(gè)核苷酸組成，有多種限制酶的識(shí)別序列，可作為連桿且被組裝在克隆載體上成為多克隆位點(diǎn)（MCS），這種連桿即多克隆位點(diǎn)寡核苷酸連桿或簡(jiǎn)稱MCS連桿。DNA片段加連桿后連接銜接頭（adaptor）是一類人工合成的一類具有一種以上的限制酶粘性末端的寡核苷酸短片段。與連桿的重要區(qū)別是合成的銜接頭的一端或兩端已具有一種或兩種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端。

第三節(jié)DNA聚合酶DNA聚合酶以DNA為復(fù)制模板，從DNA由5‘端點(diǎn)開(kāi)始復(fù)制到3’端的酶。常用的DNA聚合酶有：耐熱性DNA聚合酶、大腸桿菌DNA聚合酶I、Klenow酶、T4DNA聚合酶等。

第三節(jié)DNA聚合酶一、大腸桿菌DNA聚合酶I

第三節(jié)DNA聚合酶一、大腸桿菌DNA聚合酶I

1、5′→3′的聚合酶活性

①dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）和Mg2+離子

②帶有3′-OH游離基團(tuán)的引物鏈③DNA模板，它可以是單鏈的，也可以是雙鏈的

第三節(jié)DNA聚合酶一、大腸桿菌DNA聚合酶I

2、5′→3′的核酸外切酶活性

①?gòu)腄NA鏈的5′端向3′末端水解已配對(duì)的核苷酸，切斷磷酸二酯鍵，每次能切除10個(gè)核苷酸

②通過(guò)DNA缺口轉(zhuǎn)移，制備供核酸分子雜交用的帶放射性標(biāo)記的DNA探針第三節(jié)DNA聚合酶一、大腸桿菌DNA聚合酶I

3、3′→5′的核酸外切酶活性

※從3′→5′方向識(shí)別并切除DNA生長(zhǎng)鏈末端與模板DNA不配對(duì)而游離的核苷酸第三節(jié)DNA聚合酶二、Klenow片段

※大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（klenow片段），又叫做Klenow聚合酶或Klenow大片段酶※作為商品提供的klenow片段是用枯草桿菌蛋白酶裂解完整的DNA聚合酶Ⅰ而產(chǎn)生或者通過(guò)克隆技術(shù)而得到的單一多肽

Klenow聚合酶的主要用途

①補(bǔ)平限制性內(nèi)切酶切割DNA產(chǎn)生的3′凹端；②用[32P]dNTP補(bǔ)平3′凹端，對(duì)DNA片段進(jìn)行末端標(biāo)記；③對(duì)帶3′突出端的DNA進(jìn)行末端標(biāo)記；④在cDNA克隆中，合成cDNA第二鏈；⑤在體外誘變中，從單鏈模板合成雙鏈DNA；⑥應(yīng)用雙脫氧鏈末端終止法進(jìn)行DNA測(cè)序。⑦也用于PCR反應(yīng)進(jìn)行體外擴(kuò)增基因DNA序列，但已經(jīng)被TaqDNA聚合酶代替。第三節(jié)DNA聚合酶三、T4DNA聚合酶※從一種攜帶有高表達(dá)T4DNA聚合酶質(zhì)粒的大腸桿菌中提純制備※具有5′→3′聚合酶活性及3′→5′外切核酸酶活性

T4DNA聚合酶的主要用途

①補(bǔ)平或標(biāo)記限制性內(nèi)切酶消化DNA后產(chǎn)生的3′凹端，②對(duì)帶有3′突出端的DNA分子進(jìn)行末端標(biāo)記；③標(biāo)記用作探針的DNA片段。④將雙鏈DNA的末端轉(zhuǎn)化成為平端，⑤使結(jié)合于單鏈DNA模板上的誘變寡核苷酸引物得到延伸。

外切酶活性

聚合酶活性

無(wú)dNTPdNTP5’CAGCAACGT

3’dATPCAGCAACGT3’S1T3’3’GTCGTTGCA5’T4聚合酶

A5’A5’第三節(jié)DNA聚合酶四、耐熱DNA聚合酶

※從嗜熱的水生菌Thermusaquaticus中純化來(lái)的，現(xiàn)在以基因工程生產(chǎn)并出售（AmpliTaqTM）※分為三類：普通耐熱DNA聚合酶、高保真DNA聚合酶、DNA序列測(cè)定耐熱DNA聚合酶

耐熱DNA聚合酶的主要用途

①DNA測(cè)序

②聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）對(duì)DNA片段進(jìn)行體外擴(kuò)增第三節(jié)DNA聚合酶五、逆轉(zhuǎn)錄酶

※又稱RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶，是以RNA為模板合成DNA的酶

※有兩種已經(jīng)商品化：一種來(lái)自純化的成骨細(xì)胞性白血病病毒（AMV）；另一種是來(lái)自Moloney鼠白血病病毒（Mo-MLV）。

逆轉(zhuǎn)錄酶的主要用途

①以mRNA為模板合成cDNA，是反轉(zhuǎn)錄酶的最主要的用途

②利用其5‘→3’外切酶活性，標(biāo)記帶5‘突出末端的DNA片段

③當(dāng)其他酶用于雙脫氧鏈終止法測(cè)序效果不理想時(shí)，則可試用反轉(zhuǎn)錄酶

5’AAAAA3’引物

5’AAAAA3’

TTTTT5’

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

5’3’5’3’3’5’3’5’

全長(zhǎng)cDNA提前終止反應(yīng)

第四節(jié)DNA修飾酶一、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶

※簡(jiǎn)稱末端轉(zhuǎn)移酶，能夠催化5′脫氧核苷三磷酸進(jìn)行5′→3′方向的聚合作用※不需要模板存在就可以催化DNA分子發(fā)生聚合作用第四節(jié)DNA修飾酶二、堿性磷酸酯酶

※細(xì)菌堿性磷酸酶（bacterialalkalinephosphatase，簡(jiǎn)稱BAP）；小牛腸堿性磷酸酶（calfintestinalalkalinephosphatase，簡(jiǎn)稱CIP）※使DNA（或RNA）片段的5′-P末端轉(zhuǎn)換成5′-OH末端第四節(jié)DNA修飾酶三、T4多聚核苷酸激酶

※從T4噬菌體感染的大腸桿菌細(xì)胞中分離出來(lái)※催化γ-磷酸從ATP分子轉(zhuǎn)移給DNA或RNA分子的5′-OH末端第四節(jié)DNA修飾酶四、甲基化酶

※可使細(xì)菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤發(fā)生甲基化，形成5’-甲基胞嘧啶和6’-甲基腺嘌呤※5’-甲基胞嘧啶（Dcm甲基化酶識(shí)別CCAGG或CCTGG序列，在第二個(gè)胞嘧啶C的C5

位置上引入甲基）

※6’-甲基腺嘌呤（Dam甲基化酶可在GATC序列中的腺嘌呤N6

位置上引入甲基）

第四節(jié)DNA修飾酶四、甲基化酶

※常用的甲基化酶屬于II型，它與相應(yīng)的限制酶的識(shí)別順序相同，其甲基化位點(diǎn)與限制酶作用位點(diǎn)可同可不同如：M.EcoRIGAmATTCC

EcoRIG

AATTC不同

M．HpaICmCGG

HpaICCGG相同

對(duì)甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶限制酶識(shí)別序列*甲基化酶AvaⅡGG(A/T)CC(A/T)GG

dcmBclⅠTGATCAdamClaⅠGATCGATdamEcoRⅡCC(A/T)GG

dcmHphⅠGGTGATCdamMboⅠGATCdamNruⅠGATCGCGAdamSau96ⅠGGNCC(A/T)GG

dcmSauFⅠCC(A/T)GG

dcmStuⅠAGGCCTGG

dcmTagⅠGATCGAdamXbaⅠTCTAGATCdam*下橫線字母表示限制酶識(shí)別序列,綠色字母表示dam甲基化酶識(shí)別序列,紅色字母表示dcm甲基化酶識(shí)別序列

甲基化對(duì)限制酶切的影響①修飾酶切位點(diǎn)

②產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)

③對(duì)基因組作圖的影響（使DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切）

第三章基因克隆的載體

教學(xué)目的和要求：了解各種載體一般生物學(xué)特性

學(xué)會(huì)看懂質(zhì)粒圖，掌握各種載體的用途把一個(gè)有用的目的的DNA片段通過(guò)重組DNA技術(shù)，送進(jìn)受體細(xì)胞中去進(jìn)行繁殖和表達(dá)的工具叫載體

能與目的基因結(jié)合，且有完整的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄功能的DNA大分子稱之為載體（vector）多數(shù)載體是DNA分子，但某些RNA分子也能用做載體。

按構(gòu)建克隆載體DNA的來(lái)源分類①質(zhì)粒載體②噬菌體載體③病毒載體④質(zhì)粒與病毒或噬菌體DNA組成的載體⑤質(zhì)粒與染色體DNA片段組成的載體⑥其它克隆載體

按克隆載體的用途分類①cDNA克隆載體②轉(zhuǎn)錄載體③表達(dá)載體④普通載體

按應(yīng)用對(duì)象分類①原核生物基因克隆載體②酵母基因克隆載體③植物基因克隆載體④動(dòng)物基因克隆載體

理想的克隆載體具備的基本條件

①針對(duì)受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性

②自主復(fù)制功能

③多種且單一的限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)

④容易檢測(cè)的篩選標(biāo)記

⑤載體的分子量適當(dāng)

⑥在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高

第一節(jié)質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性

※質(zhì)粒是一種廣泛存在于細(xì)菌細(xì)胞中染色體以外的能自主復(fù)制的裸露的環(huán)狀雙鏈DNA分子，比病毒更簡(jiǎn)單?！诿咕?、藍(lán)藻、酵母和一些動(dòng)植物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒，目前對(duì)細(xì)菌的質(zhì)粒研究得比較深入。第一節(jié)質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性

※質(zhì)粒的組成與構(gòu)型細(xì)胞內(nèi)：超螺旋環(huán)狀共價(jià)雙鏈DNA分子細(xì)胞外：超螺旋、開(kāi)環(huán)，線形雙螺旋共價(jià)閉合環(huán)（超螺旋）開(kāi)環(huán)雙螺旋（一個(gè)裂口）線狀雙螺旋（兩個(gè)裂口）l-DNAoc-DNAccc-DNA構(gòu)型：第一節(jié)質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性

①自主復(fù)制性②不親和性

③可轉(zhuǎn)移性④顯性質(zhì)粒和隱蔽質(zhì)粒

第一節(jié)質(zhì)粒載體①自主復(fù)制性

質(zhì)粒DNA分子只在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行單向復(fù)制，其復(fù)制受質(zhì)粒本身和宿主細(xì)胞遺傳系統(tǒng)的雙重控制，質(zhì)粒提供復(fù)制的起始位點(diǎn)和核苷酸的序列．

第一節(jié)質(zhì)粒載體①自主復(fù)制性

每種質(zhì)粒在其宿主細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)相對(duì)穩(wěn)定

嚴(yán)緊型質(zhì)粒：1~數(shù)個(gè)拷貝松馳型質(zhì)粒：10個(gè)以上拷貝A）COP因子：決定質(zhì)粒的拷貝數(shù)，在質(zhì)粒的復(fù)制過(guò)程中指令細(xì)胞合成阻物，當(dāng)質(zhì)粒復(fù)制到一定的拷貝時(shí)，阻物的量也積累到足以阻止質(zhì)粒的復(fù)制．B）Rep基因：在質(zhì)粒的復(fù)制過(guò)程中，Replication基因會(huì)指令宿主細(xì)胞合成一種調(diào)節(jié)蛋白，促進(jìn)質(zhì)粒的復(fù)制．C）Inc基因：決定兩種親緣關(guān)系相近的兩種質(zhì)粒不能存在于同一宿主細(xì)胞中．D）Tra基因：指令宿主細(xì)胞合成菌毛（Pilus）和細(xì)胞表面物，促使宿主細(xì)胞與受體細(xì)胞表面結(jié)合，遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移．E）抗性基因：抗菌素抗性基因，Apr，Tcr．F）產(chǎn)毒素基因：大腸桿菌素基因（Col-質(zhì)粒）．G）降解基因：降解重金屬、有機(jī)物和農(nóng)藥等．H）致瘤基因：誘導(dǎo)某些組織形成腫瘤，如Ti質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒．cop基因：指令宿主合成阻遏物，當(dāng)質(zhì)粒復(fù)制到一定拷貝數(shù)時(shí)，阻遏物也合成積累，直到阻止質(zhì)粒的繼續(xù)復(fù)制。rep基因：指令宿主合成一種調(diào)節(jié)蛋白，促進(jìn)質(zhì)粒的復(fù)制第一節(jié)質(zhì)粒載體②不親和性

不親和性是指在沒(méi)有選擇壓力的情況下，兩種親源關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個(gè)寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。

第一節(jié)質(zhì)粒載體②不親和性

親和性質(zhì)粒：能在同一細(xì)胞中復(fù)制的幾種質(zhì)粒

不親和性（不相容性）質(zhì)粒：不能在同一細(xì)胞中復(fù)制的質(zhì)粒意義：宿主細(xì)胞內(nèi)的原有質(zhì)粒與克隆載體的質(zhì)粒必須是親和性質(zhì)粒，最好不含內(nèi)源性質(zhì)粒

第一節(jié)質(zhì)粒載體③可轉(zhuǎn)移性在天然條件下，很多天然質(zhì)粒都可以通過(guò)細(xì)菌接合作用從一種宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到另外一種宿主內(nèi)，這種轉(zhuǎn)移依賴于質(zhì)粒上的tra基因產(chǎn)物。

第一節(jié)質(zhì)粒載體③可轉(zhuǎn)移性在天然條件下，很多天然質(zhì)粒都可以通過(guò)細(xì)菌接合作用從一種宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到另外一種宿主內(nèi)，這種轉(zhuǎn)移依賴于質(zhì)粒上的tra基因產(chǎn)物。

第一節(jié)質(zhì)粒載體③可轉(zhuǎn)移性含tra基因的質(zhì)粒稱為接合質(zhì)粒。不含tra基因的質(zhì)粒稱為非接合質(zhì)粒。質(zhì)粒的遷移作用第一節(jié)質(zhì)粒載體④顯性質(zhì)粒和隱蔽質(zhì)粒宿主因含某種質(zhì)粒而呈現(xiàn)出新的性狀，稱為顯性（表達(dá)型）質(zhì)粒。反之稱為隱蔽質(zhì)粒。顯性質(zhì)粒：Ｒ質(zhì)粒、Col質(zhì)粒、Ｆ質(zhì)粒、降解質(zhì)粒、Ｔi質(zhì)粒。隱蔽質(zhì)粒：藍(lán)藻內(nèi)源質(zhì)粒

第一節(jié)質(zhì)粒載體二、質(zhì)?？寺≥d體構(gòu)建的基本策略

能進(jìn)行有效復(fù)制——復(fù)制起始位點(diǎn)（最好是多拷貝）克隆位點(diǎn)——組裝MCS連桿選擇標(biāo)記基因——抗性基因，LacZ’基因分子盡可能?。ㄞD(zhuǎn)化率高），＞15kb，轉(zhuǎn)化率↓↓組裝各種“元件”，如啟動(dòng)子、終止子等第一節(jié)質(zhì)粒載體三、質(zhì)?？寺≥d體構(gòu)建

※構(gòu)建過(guò)程：嚴(yán)密的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)→構(gòu)建（切割、修飾和連接重組）

第一節(jié)質(zhì)粒載體三、質(zhì)?？寺≥d體構(gòu)建

※構(gòu)建原則

：選用合適的出發(fā)質(zhì)粒正確獲得構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的元件組裝合適的選擇標(biāo)記基因選用合適的啟動(dòng)子構(gòu)建過(guò)程力求簡(jiǎn)單質(zhì)粒DNA的分離與純化

常用的有：氯化銫－溴化乙錠密度梯度離心法、堿變性法、煮沸裂解法、羥基磷灰石柱層析法、酸酚法、兩相法等

氯化銫密度梯度離心法

首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸鈉（SDS）來(lái)促進(jìn)大腸桿菌的細(xì)胞裂解；將溴化乙錠的氯化銫溶液加到清亮的大腸桿菌裂解液中，EB會(huì)嵌入到DNA鏈的堿基中去；在EB達(dá)到飽和時(shí)，進(jìn)行氯化銫密度梯度離心。堿變性法

在PH值12.0～12.5范圍內(nèi)時(shí)，線性的DNA會(huì)被變性而共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA卻不會(huì)被變性。通過(guò)冷卻或恢復(fù)中性PH值使之復(fù)性，線性染色體形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而cccDNA可以準(zhǔn)確迅速?gòu)?fù)性，通過(guò)離心去除線性染色體，獲得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，獲得質(zhì)粒DNA。①取1.5毫升含質(zhì)粒的大腸桿菌過(guò)夜培養(yǎng)物，加在微量離心管中，離心收集細(xì)胞沉淀；②加入100微升冰冷的溶液，（50mM葡萄糖，25mMTris-HClPH=8.0,10mMEDTA，4~5mg溶菌酶）靜置5分鐘；③加入200微升微冷的溶液（0.2NaOH，1.0%SDS）緩緩混勻置室溫5分鐘。（65度水浴一段時(shí)間會(huì)加強(qiáng)染色體DNA的變性作用。）④加入150毫升冰冷的PH=4.8的3M醋酸鈉，振蕩后，冰浴5分鐘。⑤離心的上清液用苯酚抽提數(shù)次，用乙醇沉淀收集質(zhì)粒DNA。第二節(jié)大腸桿菌質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒pBR322

※質(zhì)粒ColE1衍生的pMB1作為出發(fā)質(zhì)粒

※pSF2124+pSC101+ColE1=pBR322質(zhì)粒載體

優(yōu)點(diǎn)

①具有較小的分子量，容易純化

②具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)③具較高的拷貝數(shù)

④對(duì)多種常見(jiàn)的限制性內(nèi)切核酸酶只含有一個(gè)能切割的位點(diǎn)

第二節(jié)大腸桿菌質(zhì)粒載體二、pUC質(zhì)粒載體

※1987年，J.Messing和J.Vieria采用MCS技術(shù)在pBR322和M13基礎(chǔ)上構(gòu)建的

優(yōu)點(diǎn)

①具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)

②適用于組織化學(xué)法檢測(cè)重組體

③具有多克隆位點(diǎn)區(qū)段（MCS）

第二節(jié)大腸桿菌質(zhì)粒載體三、pGEM系列載體

※由pUC派生而來(lái)

※與pUC的主要區(qū)別是在MCS的兩側(cè)分別加了一個(gè)噬菌體啟動(dòng)子T7和SP6

特點(diǎn)

①如果加入純化的T7或SP6RNA聚合酶，在試管里就可以轉(zhuǎn)錄mRNA

②外源基因正接反接都可以轉(zhuǎn)錄

③MCS與pUC18的完全一樣第三節(jié)病毒（噬菌體）載體※病毒基本結(jié)構(gòu)：

DNA（或RNA）+外殼蛋白感染細(xì)菌的病毒，稱為噬菌體。第三節(jié)病毒（噬菌體）載體※分類（根據(jù)病毒與宿主關(guān)系）：

溫和性病毒：

溶原性增殖→構(gòu)建病毒載體

烈性病毒：

溶菌性增殖→改造后構(gòu)建病毒載體※噬菌體的生命周期分為溶菌周期和溶源周期，只具有溶菌生長(zhǎng)周期的噬菌體顆粒叫烈性噬菌體。烈性噬菌體溶菌生長(zhǎng)的基本過(guò)程：1、吸附吸附到位于感染細(xì)胞表面的特殊接受器上2、注入噬菌體DNA穿過(guò)細(xì)胞壁注入寄主細(xì)胞3、轉(zhuǎn)變被感染的細(xì)胞成為制造噬菌體顆粒的場(chǎng)所4、合成大量合成噬菌體特有的核酸和蛋白質(zhì)5、組裝包裝了DNA頭部和尾部組裝成噬菌體的顆粒6、釋放合成的子代噬菌體顆粒從寄主細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái)噬菌體的溶源生命周期：溶源生長(zhǎng)周期：

是指在感染過(guò)程中沒(méi)有產(chǎn)生出子代噬菌體顆粒，噬菌體的DNA是整合到寄主細(xì)胞染色體DNA上，成為它的一個(gè)組成部分?，F(xiàn)知只有雙鏈DNA的噬菌體才具有溶源周期λ噬菌體（一）λ噬菌體性質(zhì)①組成：

λDNA+外殼蛋白λDNA(48.5kb)噬菌體中：線性宿主細(xì)胞：環(huán)狀(cos位點(diǎn))λ噬菌體（一）λ噬菌體性質(zhì)②是一個(gè)溫和噬菌體一般以溶源生長(zhǎng)進(jìn)行增殖，脅迫條件下也會(huì)進(jìn)入溶菌生長(zhǎng)周期。

λ噬菌體（一）λ噬菌體性質(zhì)③復(fù)制溶源周期隨溶源細(xì)菌染色體一起復(fù)制溶菌周期的早期是“θ”復(fù)制，晚期進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制

λ噬菌體（一）λ噬菌體性質(zhì)④基因組成

λDNA至少包括61個(gè)基因，大多基因按功能相似性成簇排列其中一部分為噬菌體生命活動(dòng)的必須基因，另一部分約1／3為非必須區(qū)段λ噬菌體（二）λ噬菌體載體的構(gòu)建依據(jù)

1、λ噬菌體是一種溫和噬菌體2、能承載較大的外源DNA片段

λDNA頭部可包裝約36.4～51kb（自身的75%～105%），且約有20kbλDNA可缺失（生長(zhǎng)非必需）3、在λDNA上有多種限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)λ噬菌體（三）構(gòu)建的基本策略與技術(shù)路線

策略：切去部分非必需區(qū)刪掉多余的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)插入選擇性標(biāo)記基因建立體外包裝系統(tǒng)。λ噬菌體（三）構(gòu)建的基本策略與技術(shù)路線

技術(shù)路線

：①用限制性酶切去非必需區(qū)，抹去多余識(shí)別位點(diǎn)

λ噬菌體（三）構(gòu)建的基本策略與技術(shù)路線

技術(shù)路線

：②在λDNA的非必需區(qū)內(nèi)插入選擇標(biāo)記基因

最常用的篩選標(biāo)記：LacZ基因λ噬菌體（三）構(gòu)建的基本策略與技術(shù)路線

技術(shù)路線

：③建立重組λDNA分子體外包裝系統(tǒng)D-（D基因缺失噬菌體）＋E-（E基因缺失噬菌體）＝λ噬菌體λ噬菌體（四）λ噬菌體載體的類型

①插入型（Insertionvectors）一種只具有一個(gè)可供外源DNA插入的克隆位點(diǎn)的派生載體。如：λgt10、λgt11

λ噬菌體（四）λ噬菌體載體的類型

②置換型（Replacementvectors）具有兩個(gè)對(duì)應(yīng)的酶切克隆位點(diǎn)，在兩個(gè)位點(diǎn)之間的λDNA區(qū)段是λ噬菌體的非必需序列，可以被外源插入的DNA取代。

如Charon4載體（凱倫噬菌體載體）常用的λ噬菌體衍生載體

載體名稱分子大小(kb)可克隆外源DNA片段大小(kb)Charon3A4.830–21.4Charon4A

4.54

0–20.1Charon174.640-22.4Charon2040.360–21.37Charon21A41.70–21.08Charon2839.390–20.05Charon3046.760-20.24LA7–140.60–24.1Sep6-lac544.30–22.4BF10146.06.3–24.4M13噬菌體

（一）M13噬菌體性質(zhì)①絲狀噬菌體，內(nèi)有一環(huán)狀單鏈DNA分子（“+”鏈DNA）大?。?.4kb結(jié)構(gòu)：10個(gè)區(qū)基因間隔區(qū)（IS區(qū)）含復(fù)制起始位點(diǎn)及可插入外源DNA的位點(diǎn)M13噬菌體

②復(fù)制與增殖

M13DNA“+”鏈進(jìn)入雄性大腸桿菌→合成“-”鏈→產(chǎn)生雙鏈M13DNA（復(fù)制型DNA或RF-DNA）→按環(huán)狀雙鏈DNA方式復(fù)制，同時(shí)以“+”鏈DNA為模板轉(zhuǎn)錄包裝蛋白→RF-DNA達(dá)200拷貝時(shí)，單鏈DNA特異結(jié)合蛋白與“+”鏈結(jié)合而阻斷合成“-”鏈→結(jié)果只能以“-”鏈為模板合成“+”鏈→“+”鏈DNA被包裝蛋白包裝成新的M13噬菌體→擠出受體細(xì)胞→宿主細(xì)胞不被溶菌。RFDNAM13噬菌體

（二）M13噬菌體性質(zhì)①在IS區(qū)內(nèi)插入LacZ基因

②在標(biāo)記基因區(qū)內(nèi)組裝MCS區(qū)段

柯斯質(zhì)?！滤官|(zhì)粒載體，又稱粘粒、柯斯載體，是一類人工構(gòu)建的含有λDNA的cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體，cosmid是cossitecarryingplasmid的縮寫(xiě)?？滤官|(zhì)粒pHC79系由質(zhì)粒pBR322和噬菌體λ的cos位點(diǎn)的一段DNA構(gòu)成全長(zhǎng)4.3kbCosmid載體的特點(diǎn)①具有λ噬菌體的特性

②具有質(zhì)粒載體的特性③高容量的克隆能力采用柯斯質(zhì)粒作載體的不足①載體自身只相當(dāng)于可以插入片段的1/10左右，因此往往會(huì)出現(xiàn)載體同載體自身連接，結(jié)果在一個(gè)重組分子內(nèi)可有幾個(gè)柯斯質(zhì)粒載體連在一起。采用柯斯質(zhì)粒作載體的不足②大小不等的外源片段相互連接后插入同一個(gè)載體分子，結(jié)果使在基因組內(nèi)本來(lái)不是相鄰的片段錯(cuò)亂地連接成一個(gè)片段，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析采用柯斯質(zhì)粒作載體的不足③細(xì)菌的菌落體積遠(yuǎn)大于噬菌斑，因此如用柯斯質(zhì)粒制備基因文庫(kù)，則篩選所需的含某一DNA片段的菌落很費(fèi)時(shí)間。第四節(jié)人工染色體克隆載體

※人工染色體指人工構(gòu)建的含有天然染色體基本功能單位的載體系統(tǒng)。

溫和性病毒：

溶原性增殖→構(gòu)建病毒載體

烈性病毒：

溶菌性增殖→改造后構(gòu)建病毒載體酵母人工染色體（YAC）

酵母人工染色體（YAC)是人工染色體中能克隆最大DNA片段的載體，可以插入100-2000kb的外源DNA片段。有酵母的自主復(fù)制序列、著絲點(diǎn)、四膜蟲(chóng)的端粒以及酵母選擇性標(biāo)記組成的酵母線性克隆載體。

pYAC4人工染色體

優(yōu)點(diǎn)：可以容納更長(zhǎng)的DNA片段，用較少的克隆就可以包含特定的基因組全部序列，從而保持了基因組特定序列的完整性，有利于物理圖譜的制作。

例如，某些基因如人凝血因子VII基因長(zhǎng)達(dá)180kb，肌營(yíng)養(yǎng)不良基因大于1800kb．缺點(diǎn)：（1）克隆外源基因易出現(xiàn)嵌合體（2）有些克隆不穩(wěn)定（3）YAC克隆不容易與酵母自身染色體相分離

細(xì)菌人工染色體（BAC）細(xì)菌人工染色體（BAC）是以細(xì)菌F因子為基礎(chǔ)構(gòu)建的細(xì)菌克隆載體。BAC克隆容量可以達(dá)300kb

，可以通過(guò)電穿孔導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞。拷貝數(shù)低，穩(wěn)定，比YAC易分離。

P1派生人工染色體（PAC）P1派生人工染色體（PAC）是將BAC和P1噬菌體載體二者優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái)的克隆體系，可以克隆100-300kb的外源DNA片段。

含有卡那霉素抗性基因，便于篩選。在宿主細(xì)胞中以單拷貝的形式存在，避免了因多拷貝造成的不穩(wěn)定。

哺乳動(dòng)物人工染色體（MAC）哺乳動(dòng)物人工染色體（MAC）指從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分離出復(fù)制起始區(qū)、端粒以及著絲粒構(gòu)建而成的克隆載體?？梢钥寺〈笥?000kb的外源DNA片段。人類游離人工染色體（HAEC）基于人類EB病毒（人類皰疹病毒）而構(gòu)建的環(huán)形DNA，含有EB病毒的復(fù)制原點(diǎn)（oriP）和潮霉素（鏈霉菌產(chǎn)生的氨基糖苷類抗生素）抗性基因。能以環(huán)形小染色體形式復(fù)制，并在有絲分裂中保持穩(wěn)定。外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞重組體的篩選1、利用抗生素基因2、營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)法3、核酸雜交4、免疫反應(yīng)篩選5、酶活性篩選1.細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)2.周質(zhì)中表達(dá)3.胞外表達(dá)外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)部位蛋白質(zhì)的合成是在細(xì)胞之中進(jìn)行的目標(biāo)蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的主要優(yōu)點(diǎn)是：表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建比較簡(jiǎn)單；能夠達(dá)到很高的目標(biāo)蛋白表達(dá)量，一般可以達(dá)到占細(xì)胞總蛋白的20%～40%。目標(biāo)蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)的形式有二種：在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)為不溶性的包涵體顆粒，包涵體存在于大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)為可溶性的蛋白質(zhì)，1.細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)形成包涵體優(yōu)點(diǎn)：

a.蛋白質(zhì)易于以高純度和高濃度方式分離

b.蛋白質(zhì)受保護(hù)而免受胞內(nèi)酶的降解作用

c.蛋白質(zhì)沒(méi)有活性，因此不會(huì)使寄主細(xì)胞

受傷害d.蛋白質(zhì)的產(chǎn)量高

二硫鍵的斷裂以及轉(zhuǎn)譯修飾作用的喪

失，會(huì)導(dǎo)致外源片斷編碼的蛋白質(zhì)

在大腸桿菌中超量表達(dá)。e.表達(dá)的質(zhì)粒載體構(gòu)建比較簡(jiǎn)單。包涵體缺點(diǎn)：

a.蛋白質(zhì)折疊了，再折疊的蛋白質(zhì)可

能無(wú)法恢復(fù)其生物學(xué)活性

b.蛋白質(zhì)的終產(chǎn)量偏低

c.蛋白質(zhì)的生產(chǎn)成本比較昂貴

3.胞外表達(dá)：

可溶性的目標(biāo)蛋白質(zhì)除可存在于細(xì)胞質(zhì)中外，還可借助于本身的功能序列和大腸桿菌蛋白質(zhì)加工、運(yùn)輸體系，最終分泌到培養(yǎng)液中。分泌表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)：目的蛋白穩(wěn)定性高重組人胰島素原若分泌到細(xì)胞周中，其穩(wěn)定性大約是在細(xì)胞質(zhì)中的10倍目的蛋白易于分離目的蛋白末端完整相當(dāng)多的真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸殘基。當(dāng)這些真核基因在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，N端的甲硫氨酸殘基往往不能被切除。如若將外源基因與大腸蛋白質(zhì)桿菌的信號(hào)肽編碼序列重組在一起，一旦分泌型表達(dá)，其N端的甲硫氨酸殘基便可在信號(hào)肽的剪切過(guò)程中被有效除去

融合型異源蛋白的表達(dá)

除了直接表達(dá)異源蛋白外，還可將外源基因與受體菌自身的蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起，并作為一個(gè)開(kāi)放型閱讀框架進(jìn)行表達(dá)。由這種雜合基因表達(dá)出的蛋白質(zhì)稱為融合蛋白。在這種融合蛋白結(jié)構(gòu)中，通常受體細(xì)菌的蛋白部分位于N端，異源蛋白位于C端。通過(guò)在DNA水平上人工設(shè)計(jì)引入的蛋白酶切割位點(diǎn)或化學(xué)試劑特異性斷裂位點(diǎn)，可以在體外從純化的融合蛋白分子中釋放回收異源蛋白融合型異源蛋白的表達(dá)以融合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)目的蛋白穩(wěn)定性高尤其對(duì)分子量較小的多肽效果更佳目的蛋白表達(dá)率高與受體蛋白共用一套完善的表達(dá)元件目的蛋白需要回收融合蛋白需要裂解和進(jìn)一步分離，才能目的蛋白。在實(shí)際生產(chǎn)中，產(chǎn)品主要的成本往往就在該工段目的蛋白易于分離利用受體蛋白成熟的抗體、配體、底物進(jìn)行親和層析，可以快速獲得純度較高的融合蛋白目的蛋白溶解性好由于受體蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞內(nèi)形成良好的空間構(gòu)象，且大多具有水溶性據(jù)了解，美國(guó)在2000年1月~2004年12月批準(zhǔn)的所有創(chuàng)新生物技術(shù)藥物中，用酵母表達(dá)的有兩種，用大腸桿菌表達(dá)的有6種，且都是分子量為3500~6000道爾頓的低分子量多肽。與此形成鮮明對(duì)比的是，從2000年以后，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)更受美國(guó)等國(guó)家的制藥公司的重視。目前，美國(guó)418種在研藥物中70%是由以中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO）為主的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的。在FDA已批準(zhǔn)上市的生物技術(shù)藥物中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)品占70%以上。從銷售情況來(lái)看，2005年全球生物技術(shù)藥物約70%的銷售額（超過(guò)365億美元）是由