分子生物學(xué)研究法(上)

第五章分子生物學(xué)研究法（上）一、重組DNA技術(shù)回顧二、DNA基本操作技術(shù)三、RNA基本操作技術(shù)四、SNP的理論與應(yīng)用五、基因克隆技術(shù)六、蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)DNA分子的切割與連接核酸分子雜交凝膠電泳細(xì)胞轉(zhuǎn)化核酸序列分析基因的人工合成基因工程基因的定點(diǎn)突變PCR擴(kuò)增等核心技術(shù)基因工程：指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)粒或其它載體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進(jìn)入原先沒有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)和繁殖?；蚬こ碳夹g(shù)區(qū)別于其它技術(shù)的根本特征：具有跨越天然物種屏障、能把來自任何生物的基因置于毫無親緣關(guān)系的新的寄主生物細(xì)胞中。基因工程的一般過程1.從生物有機(jī)體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。2.將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制并具有選擇標(biāo)記的載體分子中，形成重組DNA分子。3.將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱寄主細(xì)胞）并與之一起增殖。4.從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞，并篩選出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因。5.將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，以研究基因的功能及基因與蛋白質(zhì)之間的關(guān)系。一、重組DNA技術(shù)回顧基因工程兩大技術(shù)保證：1.DNA的體外切割和連接1962年Arber發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶，1967年Gellert發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶。RestrictionenzymeLigase3′5′3′5′重組DNA實(shí)驗(yàn)中常見的主要工具酶酶

類功

能限制性核酸內(nèi)切酶識別并在特定位點(diǎn)切開DNADNA連接酶通過磷酸二酯鍵把兩個(gè)或多個(gè)DNA片段連接成一個(gè)DNA分子DNA聚合酶I（大腸桿菌）按5′到3′方向加入新的核苷酸，補(bǔ)平DNA雙鏈中的缺口反轉(zhuǎn)錄酶按照RNA分子中的堿基序列，根據(jù)堿基互補(bǔ)原則合成DNA鏈多核苷酸激酶把磷酸基團(tuán)加到多聚核苷酸鏈的5′-OH末端（進(jìn)行末端標(biāo)記實(shí)驗(yàn)或用來進(jìn)行DNA的連接)末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈核酸的3′末端加上多聚單核苷酸DNA外切酶III從DNA鏈的3′末端逐個(gè)切除單核苷酸λ噬菌體DNA外切酶從DNA鏈的5′末端逐個(gè)切除單核苷酸堿性磷酸酯酶切除位于DNA鏈5′或3′末端的磷酸基團(tuán)DNA片段在體外不具備自我復(fù)制能力，要想得到足夠量和足夠純度的DNA，須將它們連接到具備自主復(fù)制能力的DNA分子上（載體上），并轉(zhuǎn)入寄主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖。這就是基因克隆，或分子克隆。

分子克隆的載體——具備自主復(fù)制能力的DNA分子：病毒噬菌體質(zhì)粒基因克隆目的基因載體復(fù)制子宿主細(xì)胞擴(kuò)增擴(kuò)增提取DNA分子從此，大腸桿菌成為分子克隆中最常用的轉(zhuǎn)化受體。1970年Mandel和Higa發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌經(jīng)氯化鈣處理后，能有效吸收λ噬菌體DNA。1972年，Cohen等人報(bào)道，經(jīng)氯化鈣處理的大腸桿菌能夠攝取質(zhì)粒DNA。細(xì)菌轉(zhuǎn)化研究1972-PaulBerg得到第一個(gè)重組DNA分子EcoRIrecognitionsitesλphageDNAEcoRIcutsDNAintofragmentsStickyendSV40DNAThetwofragmentssticktogetherbybasepairingDNAligaseRecombinantDNAHerbertBoyer,StanleyCohen1973年獲得重組DNA分子HerbertBoyer抗四環(huán)素抗卡那霉素雙抗質(zhì)粒1973-Boyer,Cohen&Chang用重組質(zhì)粒

轉(zhuǎn)化E.coliHerbertBoyer、StanleyCohen、AnnieChangKanamycinresistancegeneTetracyclineresistancegenepSC101

結(jié)論:（1）質(zhì)粒DNA分子可以作為基因克隆的載體，從而把外源DNA導(dǎo)入寄主細(xì)胞；（2）高等生物的基因也可以被成功地轉(zhuǎn)移到原核細(xì)胞中并實(shí)現(xiàn)其功能表達(dá)；（3）質(zhì)粒DNA-大腸桿菌細(xì)胞作為一種成功的基因克隆體系，在重組DNA或基因工程研究中發(fā)揮重要作用。2.DNA的核苷酸序列分析技術(shù)DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶學(xué)和生物化學(xué)的基礎(chǔ)上創(chuàng)立并發(fā)展起來的一門重要的DNA技術(shù)，這門技術(shù)是進(jìn)一步研究和改造目的基因的基礎(chǔ)。用于測序的技術(shù)主要有Sanger等發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法和Maxam和Gilbert發(fā)明的化學(xué)降解法。二、DNA基本操作技術(shù)

1.核酸凝膠電泳技術(shù)瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳瓊脂糖凝膠：分離大于200bp～50kb的片段;聚丙烯酰胺凝膠：分離1～

1000bp的片段;

用途：DNA核苷酸序列分析、限制性內(nèi)切酶片段分析、核苷酸多態(tài)性分析、DNA片段分離等?；驹恚?/p>

電泳分子的遷移率與電場強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與支持介質(zhì)分子如瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠等的摩擦系數(shù)成反比。而摩擦系數(shù)是分子大小、極性及介質(zhì)粘度的函數(shù)在生理?xiàng)l件下，DNA電泳的遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。凝膠類型及濃度分離DNA片段的大小范圍（bp）0.3%瓊脂糖50000~10000.7%瓊脂糖20000~10001.4%瓊脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1凝膠的分辨能力同凝膠的類型和濃度有關(guān)，凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。反之，濃度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就隨之減弱。脈沖電場凝膠:電場方向、電流大小及作用時(shí)間交替變換。分離相對分子質(zhì)量超大的DNA(50kb~107

bp)凝膠電泳中，加入適量溴化乙錠對核酸分子進(jìn)行染色，紫外光下發(fā)熒光。每條DNA帶中僅含0.05μg微量DNA，也可以被清晰地檢測出來。稱樣溶解加熱制板倒膠電泳操作基本程序取樣點(diǎn)樣電泳檢測細(xì)菌轉(zhuǎn)化是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來自另一種細(xì)菌菌株的DNA而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫作供體菌株，接受轉(zhuǎn)化DNA的細(xì)菌菌株則被稱為受體菌株。處于能夠接受外源DNA狀態(tài)的細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞。2.細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo)DNA分子的增殖細(xì)菌轉(zhuǎn)化常用的方法：CaCl2法和電擊法。CaCl2法：將快速生長中的大腸桿菌置于經(jīng)低溫（0℃）預(yù)處理的低滲氯化鈣溶液中，造成細(xì)胞膨脹，膜通透性改變。電擊法：電擊使細(xì)胞膜產(chǎn)生孔洞。轉(zhuǎn)化體總數(shù)插入頻率轉(zhuǎn)化頻率α－互補(bǔ)藍(lán)白斑篩選原理。a-互補(bǔ)顯色反應(yīng)（藍(lán)白斑篩選）lacZ

-β-半乳糖苷酶-分解半乳糖苷iPO調(diào)控蛋白P分解X-gal產(chǎn)物呈現(xiàn)藍(lán)色誘導(dǎo)劑IPTG宿主含有β-半乳糖苷酶lacZ基因的3′端序列X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)α肽段噬菌體重組體DNA分子的體外包裝法3.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)PCR技術(shù)是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴(kuò)增法。DNA聚合酶在核苷酸底物存在下，以一條DNA鏈為模板催化新鏈合成需要3’-OH引物5’到3’方向合成DNA通常具有3’到5’外切酶活性PCR擴(kuò)增原理引物延伸延伸5′5′3′3′變性、退火變性、退火PCRCycle-Step1-DenaturationTemplateDNAbyHeat(95oC)PCRCycle-Step2–

Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequences5′3′5′5′3′5′3′3′PCRCycle-Step3-

At72oC,TaqDNApolymerasecatalysesprimerextension5′3′5′5′3′5′Endofthe1stPCRCycle–

Resultsintwocopiesoftargetsequence每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。理論上最高值2nPCR儀PCR技術(shù)的應(yīng)用1)基因克隆重組DNA質(zhì)粒DNA基因片段2)基因檢測A′內(nèi)源性病變基因正常人A病人病原微生物基因正常人(-)病人(+)3）表達(dá)分析4）探針制備5）定點(diǎn)突變4、實(shí)時(shí)定量PCR常規(guī)PCR方法的局限性：無法對起始模板準(zhǔn)確定量,只能對終產(chǎn)物進(jìn)行分析必須在擴(kuò)增后用電泳方法分析,費(fèi)時(shí)費(fèi)力而且EB有毒無法對擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測CyclenumberTheoreticalRealLifeLogTargetDNARealityvs.TheoryAmplificationisexponential,buttheexponentialincreaseislimited:TheoreticalLogTargetDNADetectorCycle#RealLife定量的最佳時(shí)期:指數(shù)期如何知道PCR反應(yīng)什么時(shí)候處在指數(shù)期、又如何進(jìn)行檢測呢？

實(shí)時(shí)定量PCR是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，使每一個(gè)循環(huán)變得“可見”，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品中的目的DNA(或cDNA)的起始濃度進(jìn)行定量的方法。Real-TimePCRPCR儀+監(jiān)測、分析系統(tǒng)+熒光標(biāo)記

llll非特異性熒光標(biāo)記：SYBRGreen特異性熒光標(biāo)記：TaqManMolecularBeacon

DNA產(chǎn)物的熒光標(biāo)記SYBRGreen工作原理

SYBRGreen能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位SYBRGreen只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光變性時(shí)，DNA雙鏈分開，無熒光復(fù)性和延伸時(shí)，形成雙鏈DNA，SYBRGreen發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號。SYBRGreen

5’3’5’3’SGNoEmissionSGSGSGExcitationSGSGSGSGSGSGSG5’3’5’3’EmissionExcitation約497nm約520nmCleavageProbes(TaqManTM)Taqman探針：與靶DNA序列中間部位結(jié)合的單鏈DNA（50-150bp）Molecularbeacon法(分子信標(biāo))標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針環(huán)與目標(biāo)序列互補(bǔ)莖由互補(bǔ)配對序列組成環(huán)莖熒光素淬滅劑發(fā)夾型雜交探針定量原理:介紹三個(gè)概念：擴(kuò)增曲線、熒光閾值、Ct值如何對起始模板定量？通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對起始模板進(jìn)行定量分析擴(kuò)增曲線:熒光檢測元件擴(kuò)增曲線可分成三個(gè)階段：熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。

熒光閾值熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，一般將熒光域值設(shè)置為3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。Ct值Ct值定義：PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)Ct值的重現(xiàn)性:Ct值的特點(diǎn)：相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定；Ct值則極具重現(xiàn)性模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小

Ct值與模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系理想的PCR反應(yīng)：

X=X0*2n非理想的PCR反應(yīng)：

X=X0(1+Ex)nn：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)

X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量

X0：初始模板量

Ex：擴(kuò)增效率確定未知樣品的C(t)值通過標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量Sample絕對定量25

相對定量：通過內(nèi)標(biāo)定量

內(nèi)標(biāo)通常是β-actin等看家基因在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響小內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組數(shù)量前提：目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴(kuò)增效率接近100％且偏差在5％以內(nèi)

1、用內(nèi)參基因的CT值確定目標(biāo)基因的CT值：

ΔCT(test)=CT(target,test)–CT(ref,test)

ΔCT(calibrator)=CT(target,calibrator)–CT(ref,calibrator)

2、用校準(zhǔn)樣本的ΔCT值確定試驗(yàn)樣本的ΔCT值：

ΔΔCT=ΔCT（test)-ΔCT（calibrator)3、計(jì)算表達(dá)水平比率：

(1+E)–ΔΔCT=表達(dá)量的比值相對定量分析法：-ΔΔCt法基因文庫（genelibrary）：應(yīng)用DNA重組技術(shù)構(gòu)建的含有基因組的全部基因的DNA克隆。基因文庫是包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體?；蛭膸彀ɑ蚪M文庫(Genomelibrary)和cDNA文庫(cDNAlibrary)5、基因組DNA文庫構(gòu)建基因組文庫分離組織或細(xì)胞染色體DNA，利用限制性核酸內(nèi)切酶切割成