高中生物競(jìng)賽課件：顯微鏡和顯微技術(shù)

顯微鏡和顯微技術(shù)決定顯微觀察效果的因素：放大倍數(shù)被觀察物越小，放大倍數(shù)應(yīng)越大，否則難以看清！特定條件下能辨析的兩點(diǎn)之間的最小距離分辨率觀察效果的最重要指標(biāo)顯微鏡和顯微技術(shù)決定顯微觀察效果的因素：放大倍數(shù)被觀察物越小，放大倍數(shù)應(yīng)越大，否則難以看清！特定條件下能辨析的兩點(diǎn)之間的最小距離被觀察物區(qū)別于背景的程度

與顯微鏡的自身特點(diǎn)有關(guān)，但也取決于進(jìn)行顯微觀察時(shí)對(duì)顯微鏡的正確使用及良好的標(biāo)本制作和觀察技術(shù)，這就是顯微技術(shù)分辨率反差觀察效果的最重要指標(biāo)病毒20-200nm支原體0.1-0.3μm細(xì)菌0.5-5.0μm動(dòng)植物細(xì)胞20-30μm活細(xì)胞多是無(wú)色透明的肉眼0.2mm光學(xué)顯微鏡0.2μm電子顯微鏡0.2nm掃描隧道顯微鏡樣品制備技術(shù)直徑分辨率顯微鏡和顯微技術(shù)從細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)、細(xì)胞學(xué)說(shuō)的建立，直至今天光學(xué)顯微鏡仍然是細(xì)胞生物學(xué)研究的重要工具1.目鏡2.準(zhǔn)焦螺旋3.物鏡4.載物臺(tái)5.反光鏡組成部分？成像原理？樣品制備？顯微鏡和顯微技術(shù)顯微鏡的種類(lèi)普通光學(xué)顯微鏡暗視野顯微鏡相差顯微鏡熒光顯微鏡透射電子顯微鏡掃描電子顯微鏡掃描隧道顯微鏡原子力顯微鏡顯微鏡和顯微技術(shù)（一）普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡——組成由3部分組成：光學(xué)放大系統(tǒng)(目鏡與物鏡)照明系統(tǒng)(光源和聚光鏡)(有時(shí)另加濾光片以控制波長(zhǎng)范圍)鏡架及樣品調(diào)節(jié)系統(tǒng)顯微鏡最重要的性能參數(shù)：分辨率，字母D表示決定因素：光源的波長(zhǎng)λ物鏡鏡口角α(標(biāo)本在光軸上的一點(diǎn)對(duì)物鏡鏡口的張角）介質(zhì)折射率N

數(shù)值孔徑值NA（鏡口率）決定物鏡性能最重要的指標(biāo)（一）普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡——分辨率顯微鏡最重要的性能參數(shù)：分辨率，字母D表示決定因素：光源的波長(zhǎng)λ物鏡鏡口角α(標(biāo)本在光軸上的一點(diǎn)對(duì)物鏡鏡口的張角）介質(zhì)折射率N

數(shù)值孔徑值NA（鏡口率）決定物鏡性能最重要的指標(biāo)（一）普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡——分辨率分辨率與所用波長(zhǎng)成反比！最短可見(jiàn)光波長(zhǎng)λ=400nm(450nm)最大物鏡鏡口角α=140°空氣折射率N=1

分辨率D=260nm(292nm)，約為0.3μm如何提高顯微鏡的分辨能力？縮短波長(zhǎng)增大數(shù)值孔徑介質(zhì)空氣水香柏油α溴萘折射率11.331.5151.66油鏡下，D可達(dá)0.18μm普通光學(xué)顯微鏡最大分辨率0.18μm。肉眼分辨能力0.25mm，光學(xué)顯微鏡有效的最高放大倍數(shù)只有1000-1500倍

（一）普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡——分辨率最短可見(jiàn)光波長(zhǎng)λ=400nm(450nm)最大物鏡鏡口角α=140°空氣折射率N=1

分辨率D=260nm(292nm)，約為0.3μm如何提高顯微鏡的分辨能力？縮短波長(zhǎng)增大數(shù)值孔徑介質(zhì)空氣水香柏油α溴萘折射率11.331.5151.66油鏡下，D可達(dá)0.18μm普通光學(xué)顯微鏡最大分辨率0.18μm。肉眼分辨能力0.25mm，光學(xué)顯微鏡有效的最高放大倍數(shù)只有1000-1500倍

（一）普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡——分辨率很多原來(lái)由于在透鏡及載片表面的反射和折射而損失的光線可以進(jìn)入物鏡，使照明亮度提高，改善觀察效果。（二）暗視野顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡又稱(chēng)明視野顯微鏡，其照明光線直接進(jìn)入視野，屬透射照明光闌樣品與背景之間的反差增大暗視野顯微鏡特點(diǎn)：特殊的聚光器實(shí)現(xiàn)斜射照明光不直接穿過(guò)物鏡，由樣品反射或折射后進(jìn)入物鏡視野是暗的，樣品是明亮的觀察更容易、清晰（二）暗視野顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡又稱(chēng)明視野顯微鏡，其照明光線直接進(jìn)入視野，屬透射照明光闌樣品與背景之間的反差增大暗視野顯微鏡特點(diǎn)：特殊的聚光器實(shí)現(xiàn)斜射照明光不直接穿過(guò)物鏡，由樣品反射或折射后進(jìn)入物鏡視野是暗的，樣品是明亮的觀察更容易、清晰蒼白密螺旋體團(tuán)藻（三）相差顯微鏡光波的基本屬性包括：波長(zhǎng)、頻率、振幅和相位；波長(zhǎng)和頻率變化è顏色不同；振幅變化è亮度不同；相位變化人眼無(wú)法覺(jué)察；相差顯微鏡：利用光線干涉的原理，將相位差轉(zhuǎn)換成振幅差，實(shí)現(xiàn)對(duì)非染色活細(xì)胞的觀察相差顯微鏡：利用光線干涉的原理，將相位差轉(zhuǎn)換成振幅差，實(shí)現(xiàn)對(duì)非染色活細(xì)胞的觀察A.

兩束光的相位相同è相互干涉的結(jié)果使光波的振幅↑，亮度↑B.兩束光的相位相反è光波的振幅↓，亮度↓（三）相差顯微鏡相差顯微鏡在普通光學(xué)顯微鏡的基礎(chǔ)上，添加“環(huán)狀光闌”和“相差板”，將光程差或相位差，轉(zhuǎn)換成振幅差（三）相差顯微鏡（三）相差顯微鏡荷蘭人FritsZernike(F·澤爾尼克)1930年，發(fā)明相襯方法(相差顯微鏡)1941年，制造出第一臺(tái)相差顯微鏡1953年，諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)釀酒酵母草履蟲(chóng)（四）熒光顯微鏡——基本原理光鏡水平上對(duì)細(xì)胞內(nèi)特異的蛋白質(zhì)、核酸、糖類(lèi)、脂質(zhì)以及某些離子等組分進(jìn)行定性定位研究的有力工具熒光：分子吸收入射光能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，再?gòu)募ぐl(fā)態(tài)回到基態(tài)而發(fā)出的可見(jiàn)光(波長(zhǎng)比入射光長(zhǎng))，可分為自發(fā)熒光和誘發(fā)熒光濾光片系統(tǒng)由激發(fā)濾光片和阻斷濾光片組成激發(fā)光片：光源和樣品之間，只允許特定波長(zhǎng)的激發(fā)光通過(guò)；阻斷濾光片：物鏡和目鏡之間，只允許熒光染料所發(fā)出的熒光通過(guò)；光源和光學(xué)系統(tǒng)與普通光學(xué)顯微鏡不同核心部件是濾光片系統(tǒng)及專(zhuān)用物鏡鏡頭吸收短波長(zhǎng)的光，發(fā)射長(zhǎng)波長(zhǎng)的光（四）熒光顯微鏡（四）熒光顯微鏡蒼白密螺旋體（四）熒光顯微鏡鼠疫耶爾森菌“照亮細(xì)胞”的綠色熒光蛋白Greenfluorensentprotein)2008年，諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予發(fā)現(xiàn)和修飾GFP的3位科學(xué)家美國(guó)下村修美國(guó)馬丁.查爾菲美國(guó)錢(qián)永健（四）熒光顯微鏡電子顯微鏡(Electronmicroscope,EM)TheNobelPrizeinPhysics1986

觀察細(xì)胞內(nèi)部精細(xì)結(jié)構(gòu)1932年由Ruska制成1986年獲諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)透射電鏡

transmissionelectronmicroscope,TEM掃描電鏡

scanningelectronmicroscope,SEM電子顯微鏡(Electronmicroscope,EM)電子顯微鏡的基本知識(shí)電子束作為光源，波長(zhǎng)一般<0.1nm電磁透鏡聚焦鏡筒高度真空?qǐng)D像通過(guò)熒光屏、感光膠片或電荷耦合器件顯示和記錄1、與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別分辨率光源透鏡真空成像原理光學(xué)顯微鏡200nm可見(jiàn)光，波長(zhǎng)400-700nm玻璃透鏡不要求真空樣本對(duì)光的吸收形成明暗反差和顏色變化電鏡0.2nm電子束，波長(zhǎng)0.01-0.9nm電磁透鏡1.33×10-3~1.33×10-5Pa樣品對(duì)電子的散射和透射形成明暗反差電子顯微鏡的基本知識(shí)1、與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別電子顯微鏡分辨率可達(dá)0.2nm人眼分辨率0.2mm，光學(xué)顯微鏡0.2μm，放大倍數(shù)1000，電鏡0.2nm，放大倍數(shù)106，稱(chēng)為有效放大倍數(shù)，通過(guò)光學(xué)手段繼續(xù)放大，不會(huì)得到任何有意義的信息，稱(chēng)為“空放大”電鏡分辨率≠分辨本領(lǐng)分辨本領(lǐng)指電鏡處于最佳狀態(tài)下的分辨率影響因素：生物制樣技術(shù)的限制(超薄切片樣品中分辨率約為切片厚度1/10，即50nm厚度切片的實(shí)際分辨率為5nm,<<電鏡分辨率0.2nm)2．電子顯微鏡的分辨本領(lǐng)與有效放大倍數(shù)電子顯微鏡的基本知識(shí)4個(gè)組成部分：電子束照明系統(tǒng)電子槍+聚光鏡成像系統(tǒng)物鏡+中間鏡+投影鏡真空系統(tǒng)電子槍?zhuān)R筒及記錄系統(tǒng)內(nèi)高真空記錄系統(tǒng)熒光顯示屏/感光膠片/CCD相機(jī)3．電子顯微鏡的基本構(gòu)造電子顯微鏡的基本知識(shí)掃描隧道顯微鏡

(Scanningtunnelmicroscope,STM)1981年發(fā)明，1986年Binnig和Rohrer獲諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)原理：在低電壓下，當(dāng)兩電極之間近到一定距離(d)（50nm以?xún)?nèi)）時(shí)，電極之間產(chǎn)生電流，稱(chēng)為隧道電流(I)，隧道電流I和針尖與樣品之間的距離d呈指數(shù)關(guān)系，距離可轉(zhuǎn)化為電流的函數(shù)被測(cè)