耿婷婷-基于金磁微粒的化學發(fā)光免疫學檢測梅毒螺旋體抗體方法的建立(西北大學碩士學位畢業(yè)PPT)

基于金磁微粒的化學發(fā)光免疫學檢測梅毒螺旋體抗體方法的建立答辯人：耿婷婷導師：陳超崔亞麗GoldMag-AS微米金磁微粒磁內核金外殼金殼層：納米級金顆粒生物分子固定化容量大

非共價偶聯(lián)：Au-S相互作用

疏水

靜電

磁核心:超順磁性，易于分離

一背景介紹國家衛(wèi)生部傳染病法定報告：2005年全國發(fā)病人數(shù)第五位2007年全國發(fā)病人數(shù)第三位

年份全國梅毒報告病例首例梅毒病例在1979年重慶市報告梅毒螺旋體梅毒在我國已成為一個嚴峻的公共衛(wèi)生問題，輸血必檢項目之一。快速血漿反應素試驗;假陰假陽梅毒螺旋體特異性抗體明膠凝集試驗;方便、靈敏度低梅毒螺旋體特異性抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗;靈敏度中等梅毒螺旋體核酸檢測法；靈敏度高、昂貴梅毒螺旋體特異性抗體化學發(fā)光法檢測;靈敏度高金磁微粒為載體的化學發(fā)光酶免疫檢測系統(tǒng)金磁：比表面積大；可自動化操作?；瘜W發(fā)光：靈敏度高。二.實驗目的1.建立磁酶免化學發(fā)光系統(tǒng)檢測TP抗體2.血液中TP篩查，提高輸血安全性3.血站自動化病原篩查三.實驗原理＋HRP化學發(fā)光Luminol,H2O2,PIPTMB底物檢測吸光度與樣品濃度成正比｛＋HRPAg-Ab-酶復合物四、實驗設計及結果分析TP抗原免疫磁珠的制備1磁酶免反應條件的優(yōu)化2化學發(fā)光條件的優(yōu)化3磁酶免化學發(fā)光法建立及方法價4（一）TP抗原免疫磁珠的制備磁粒與抗體偶聯(lián)封閉，清洗，磁性分離，棄上清保存磁粒中加入抗體（一）TP抗原免疫磁珠的制備1.TP抗原在金磁微粒表面的固定化TP抗原包被前后的紫外吸收曲線一步偶聯(lián)：磁粒表面靜電作用；疏水相互作用；半胱氨酸殘基側鏈的巰基與金的作用等。（一）TP抗原免疫磁珠的制備2.優(yōu)化免疫磁珠的包被時間1min、5min、10min、15min、20min、30min、60min20min左右即可完成偶聯(lián)反應選取30min為最佳包被時間（一）TP抗原免疫磁珠的制備3.選擇磁粒的濃度：10μg/孔、30μg/孔、50μg/孔、100μg/孔

過低：陽性值低過高：磁粒不透光影響發(fā)光信號選擇：30μg/孔磁粒濃度（

μg/孔）化學發(fā)光信號（一）TP抗原免疫磁珠的制備4.優(yōu)化封閉反應條件：陽性陰性陽性／陰性4℃過夜1.9061.8840.0800.07324.7737℃2h+4℃過夜1.7451.8150.0300.01972.65常用封閉條件為4C過夜，但實驗中發(fā)現(xiàn)4C過夜并不適用于金磁微粒的封閉，達不到理想的封閉效果，陰性值較高。磁性微粒4C過夜時基本完全沉降在管底，不能充分反應導致。

增加37C震蕩2h，明顯加強了封閉效果，陰性值較低。（一）TP抗原免疫磁珠的制備5.選擇合適封閉劑1％明膠、10％小牛血清、0.5%BSA、5%奶粉、10%奶粉、

5％奶粉＋2％小牛血清

陽性陰性陽性／陰性1%明膠——————————10%小牛血清1.7651.7230.4960.4353.750.5％BSA2.2992.160.2530.3137.885%奶粉2.2272.3090.1780.14214.1810%奶粉——————————5％奶+2％小牛血清1.7451.8150.030.01972.65（二）TP抗體的免疫學結合雙抗原夾心法檢測1.選擇HPR標記抗原稀釋液:20％小牛PBST降低非特異性吸附：加入非特性蛋白加入表面活性劑酶標抗體稀釋液吸光度值編號稀釋液陰性1PBS0.230±0.0302PBST0.213±0.0503PBST+5%小牛血清0.137±0.0434PBST+10%小牛血清0.115±0.0555PBST+20%小牛血清0.015±0.0306PBST+30%小牛血清0.012±0.040（二）TP抗體的免疫學結合（二）TP抗體的免疫學結合2.優(yōu)化免疫反應時間包被抗原、待檢抗體、酶標抗原的結合是一個動態(tài)平衡反應，分別考察反應時間為10、15、25、30、40、50min時的檢測結果時間(min)吸光度值陽性對照陰性對照3.選擇包被抗原濃度

2.5μg/mg、5μg/mg、7.5μg/mg、10μg/mg、12.5μg/mg、15μg/mg

×HRP√HRPHRP×抗原包被量（μg/mg）發(fā)光信號（二）TP抗體的免疫學結合

2.5

5

7.51012.515

4.選擇HPR標記抗原的濃度

2.557.51012.5151:2000PN0.7850.0241.2870.0091.2400.0201.6800.0231.5640.0111.6700.0101:3000PN0.8550.0181.1570.0131.2830.0001.2720.0101.4930.0231.2830.0001:4000PN0.6530.0051.0200.0171.0260.0151.0700.0001.2840.0281.0780.0111:5000PN0.6640.0150.8630.0180.8880.0020.9700.0010.9460.0050.8360.0301:6000PN0.5110.0100.7330.0130.6990.0020.7980.0210.6800.0070.6260.017（二）TP抗體的免疫學結合酶標抗體稀釋度抗原包被量最佳工作條件:TP抗原包被量為5μg/mg酶標抗原為1:3000稀釋（三）化學發(fā)光條件的優(yōu)化1.選擇反應體系Tris陽性陰性發(fā)光太弱CBS陽性陰性均發(fā)光HRPLuminolH2O2PIPabTris體系發(fā)光結果相對光子數(shù)時間（s）陽性陰性abab相對光子數(shù)時間（s）陽性陰性ab

CBS體系發(fā)光結果PBS陽性發(fā)光，陰性不發(fā)光PBST陽性發(fā)光，陰性不發(fā)光PBS體系發(fā)光結果ab相對光子數(shù)時間（s）陽性陰性abab相對光子數(shù)時間（s）陽性陰性abPBST體系發(fā)光結果（三）化學發(fā)光條件的優(yōu)化（三）化學發(fā)光條件的優(yōu)化2.緩沖體系中Tween-20濃度的影響Tween20濃度(v/v)發(fā)光信號吐溫0.3％0.2％0.15％0.1％0.05％0.0％陽性75922852369296131661989陰性383838304630空光劑7676918411484（三）化學發(fā)光條件的優(yōu)化3.選擇pH值pH6.577.588.5陽性129592280946551352陰性883011499空白8882323發(fā)光劑88815152pH值發(fā)光信號（三）化學發(fā)光條件的優(yōu)化4.選擇luminol濃度1.25×10-31×10-30.75×10-30.5×10-30.25×10-3陽性2856534487332122933921648陰性7684535330空白3838382315發(fā)光劑311258167144121Luminol濃度（mol/L）相對光子數(shù)（三）化學發(fā)光條件的優(yōu)化5.選擇H2O2濃度1.81.51.20.90.60.3陽性180019132392262723311192陰性463023232323空白38382315158發(fā)光劑536161383015H2O2濃度(μl/mL)發(fā)光信號（三）化學發(fā)光條件的優(yōu)化6.選擇PIP濃度6×10-35×10-34×10-33×10-32×10-31×10-3陽性249129013121321228701450陰性383838304630空白1588232312發(fā)光劑616165848491PIP濃度(mol/mL)發(fā)光信號＋HRP化學發(fā)光Luminol,H2O2,PIP＋HRPAg-Ab-酶復合物（四）磁酶免化學發(fā)光方法的建立及評價1.磁酶免化學發(fā)光法標準曲線測定R2=0.9988陽性血清梯度稀釋發(fā)光信號（四）磁酶免化學發(fā)光法的建立及評價將陽性血清梯度稀釋，線性關系良好y=10406x-4.619（四）磁酶免化學發(fā)光法的建立及評價2.磁酶免化學發(fā)光法與其他方法靈敏度的比較以金磁微粒為固相載體進行酶免檢測，靈敏度提高2倍。結合化學發(fā)光檢測，靈敏度可提高16倍。陽性血清稀釋倍數(shù)檢測結果商品化試劑盒磁酶免法磁酶免化學發(fā)光法1:25+++1:50+++1:100+++1:200+++1:400-++1:800-+-+1:1600--+1:3200--+1:6400--+-1:12800---（四）磁酶免化學發(fā)光法的建立及評價3.磁酶免化學發(fā)光檢測方法的精密度在線性范圍內選取1:400稀釋的陽性血清，重復測定11次，計算測定值的相對標準偏差RSD=5.5%。

磁分離化學發(fā)光免疫法檢測陽性樣品11次重復測定相對光子數(shù)五：全文總結優(yōu)化磁酶免反應條件優(yōu)化化學發(fā)光條件制備免疫磁珠包被時間的選擇選擇抗原包被量選擇磁粒用量優(yōu)化封閉反應條件封閉劑的選擇HPR標記抗原稀釋液的選擇優(yōu)化免疫反應時間選擇抗原包被濃度選擇HPR標記抗原的濃度選擇反應體系緩沖體系中Tween-20濃度選擇pH值選擇lumino