第二周PCR檢測技術(shù)及應(yīng)用

PCR檢測技術(shù)及其應(yīng)用現(xiàn)代生物學(xué)檢測技術(shù)什么是PCR技術(shù)？PCR(polymerasechainreaction),即聚合酶鏈反應(yīng)。它是體外模擬DNA復(fù)制的過程，以單鏈DNA為模板，以人工設(shè)計的寡核苷酸為引物，利用穩(wěn)定的聚合酶，摻入單核苷酸來特異地擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。什么是PCR技術(shù)？反應(yīng)特點：特異性強(qiáng)；靈敏度高；簡便、快速；對標(biāo)本的純度要求低DNA復(fù)制過程簡述請課前準(zhǔn)備的同學(xué)進(jìn)行講解。PCR反應(yīng)原理PCR檢測分三個步驟：1是PCR擴(kuò)增模板的制備，也就是病原微生物基因

組提取2是PCR擴(kuò)增，即目的基因特異擴(kuò)增過程（最重要的步驟）3是瓊脂糖凝膠電泳分析，在紫外燈下檢測基因片

段重點步驟：PCR擴(kuò)增期（觀看動畫）PCR擴(kuò)增期包括變性－退火－延伸三個基本反應(yīng)步驟：模板DNA的變性：加熱至94-96℃，模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA離解成為單鏈；模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：溫度降至50-65℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；引物的延伸：在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，合成一條與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。

72℃

重復(fù)變性－退火－延伸三個過程，目的基因被擴(kuò)增放大幾百萬倍。每個循環(huán)需2-4min，整個PCR反應(yīng)需要2-3h。問題思考：聚合酶在催化引物延伸的反應(yīng)中在下一循環(huán)的加熱變性中會失活，導(dǎo)致循環(huán)都要加一次酶？怎么解決？

1988年初，Keohanog通過對所使用的酶的改進(jìn)，提高了擴(kuò)增的真實性。而后，Saiki等人又從生活在溫泉中的水生嗜熱桿菌內(nèi)提取到一種耐熱的DNA聚合酶，使得PCR技術(shù)的擴(kuò)增效率大大提高，叫做TaqDNA聚合酶。PCR的實驗室檢測觀看操作視頻檢測過程：設(shè)計引物---擴(kuò)增---檢測PCR的檢測過程PCR擴(kuò)增體系主要包括：引物 PCR反應(yīng)介導(dǎo)物DNA模板

被擴(kuò)增目的物耐熱DNA聚合酶 PCR反應(yīng)催化劑dNTPs 反應(yīng)底物緩沖液

提供反應(yīng)環(huán)境鎂離子

耐熱DNA聚合酶活性依賴離子PCR產(chǎn)物的檢測1、凝膠電泳：EB（溴化乙錠）可鑲嵌在DNA片段中，并在一定波長的紫外線下發(fā)射出橘紅色的可見光。在凝膠介質(zhì)中不同大小的PCR片段在一定電壓下的遷移率不同，從而在凝膠中呈現(xiàn)出不同的亮線。缺點：只能對終產(chǎn)物進(jìn)行分析，無法對起始模版準(zhǔn)確定量；必須在擴(kuò)增反映結(jié)束后借助電泳方法分析，費(fèi)時費(fèi)事；無法對擴(kuò)增反應(yīng)實時檢測；EB有毒Marker是人為的把一系列已知大小的DNA（或已知質(zhì)量的蛋白，當(dāng)然PCR中用的是DNAmarker不是蛋白marker）混合在一起，在電泳的時候?qū)φ沼?。PCR產(chǎn)物的檢測2、熒光PCR：反應(yīng)體系中在PCR過程中利用熒光染料在光刺激的情況下釋放的熒光能量的變化直接反映出PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化。優(yōu)點：無需PCR后電泳處理，儀器在線實時檢測，避免人為判斷，利用自動化和聯(lián)網(wǎng)管理。觀看熒光PCR檢測視頻PCR分類1、多重PCR技術(shù)（P170）常規(guī)一對引物擴(kuò)增，只產(chǎn)生一個特異的DNA片段。若有十分龐大的基因序列需要檢測，超過了PCR擴(kuò)增DNA片段的長度，則采用常規(guī)PCR就需要分段進(jìn)行多次擴(kuò)增，費(fèi)時費(fèi)力。常用于轉(zhuǎn)基因食品檢測。PCR分類2、實時熒光定量PCR技術(shù)（P171）視頻在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實現(xiàn)了實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，對起始模板進(jìn)行定量分析的方法。與普通PCR的區(qū)別普通PCR技術(shù)：在PCR結(jié)束后對終點產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。實時定量PCR技術(shù)：實時檢測PCR擴(kuò)增，在擴(kuò)增的指數(shù)期對起始模板進(jìn)行定量。PCR檢測所需要的儀器設(shè)備（1）、PCR實驗室

PCR只需幾個DNA分子作模板就可大量擴(kuò)增，應(yīng)注意防止反應(yīng)體系被痕量DNA模板污染和交叉污染，這也是最容易造成假陽性原因之一。實驗室布局應(yīng)重點考慮避免這種污染。因此用于PCR檢測的實驗室要進(jìn)行功能區(qū)域劃分，從對環(huán)境要求的嚴(yán)格程度和功能上可將PCR整個實驗流程劃分為四個區(qū)域：1.配液區(qū)（準(zhǔn)備區(qū)）2.模板提取區(qū)3.PCR擴(kuò)增區(qū)4.電泳區(qū)（二）實驗器材必須使用PCR專用吸頭試劑盒的運(yùn)輸和貯存PCR試劑盒在適當(dāng)?shù)馁A存溫度下的有效期一般為6個月核酸擴(kuò)增部分的試劑一般要貯存于-20℃產(chǎn)物檢測部分試劑則貯存于2～8℃。電泳槽、電泳儀的圖片凝膠成像系統(tǒng)的圖片觀看視頻，回憶PCR實驗室檢測步驟1是PCR擴(kuò)增模板的制備，也就是病原微生物基因組提取2是PCR擴(kuò)增，即目的基因特異擴(kuò)增過程3是瓊脂糖凝膠電泳分析，在紫外燈下檢測基因片段PCR檢驗技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用一、在食品致病微生物檢測中的應(yīng)用（P173）檢測沙門氏菌、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌等。二、在食品轉(zhuǎn)基因成分檢測中的應(yīng)用（補(bǔ)充）抗蟲害、抗病毒、抗雜草的轉(zhuǎn)基因玉米、黃豆、油菜、土豆、西葫蘆等。李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)（P173）對牛奶等食品均有不同程度的污染,是食品中的主要病原菌。傳統(tǒng)的檢測方法存在周期長、操作繁瑣等不足之處。在食品致病微生物檢測中的應(yīng)用（P173）PCR法：1）提取總DNA；2）根據(jù)LM的保守序列設(shè)計引物特異地PCR擴(kuò)增。優(yōu)點：對其它菌不產(chǎn)生反應(yīng)，顯示了較強(qiáng)的特異性；

檢測的敏感性非常高；檢測只需要5～6h,較之傳統(tǒng)方法快得多。通過對TaqDNA聚合酶和引物濃度等條件的優(yōu)化，建立簡便實用的快速檢測牛奶中LM菌的試劑盒，具有良好的應(yīng)用前景。在食品轉(zhuǎn)基因成分檢測中的應(yīng)用轉(zhuǎn)基因食品（geneticallymodifiedfoods,GMF)是由細(xì)胞DNA中經(jīng)非生殖方法插入了特定外源基因或基因片段，并獲得某種良好性狀的動物