制備針對(duì)TK不同抗原表位的多克隆抗體,免疫學(xué)論文

制備針對(duì)TK不同抗原表位的多克隆抗體,免疫學(xué)論文人組織激肽釋放酶(TK)作為人激肽釋放酶-緩激肽(KKS)系統(tǒng)中的一個(gè)關(guān)鍵酶,能通過裂解低分子量激肽原釋放緩激肽和激肽類物質(zhì),進(jìn)而與血管壁和其他部位的內(nèi)皮平滑肌細(xì)胞上的緩激肽受體2(B2)結(jié)合,激活一氧化氮-環(huán)磷酸腺苷(NO-cAMP)和前列環(huán)素-環(huán)磷酸腺苷(Prostacyclin-cAMP)等信號(hào)通路,觸發(fā)一系列生物活性效應(yīng),包括血管舒張、平滑肌收縮和舒張、抑制凋亡、炎癥、增殖、肥大和纖維化,及促進(jìn)血管生成和神經(jīng)發(fā)生等[1,2].由于B2受體廣泛存在于人體內(nèi)的組織及細(xì)胞中,如平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞中[3],因而TK具有廣泛的生物效應(yīng)并可能在心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展中具有廣泛的應(yīng)用前景.本研究利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)TK蛋白可能的高級(jí)構(gòu)造、親水性和抗原性高低,根據(jù)分析結(jié)果,選取預(yù)測(cè)抗原性較高、與已經(jīng)知道蛋白同源性低的多肽片段,將其免疫家兔,制備針對(duì)TK不同抗原表位的多克隆抗體,為TK檢測(cè)試劑盒的制備以及進(jìn)一步研究TK在心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的作用及機(jī)制奠定了基礎(chǔ).1材料與方式方法.1.1主要材料日本大耳白(2kg)購自華中科技.大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心;血藍(lán)蛋白(KLH)、戊二醛、弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏完全佐劑(FIA)、TMB購自Sigma公司;牛血清白蛋白(BSA)、甘氨酸、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG購自武漢凌飛生物有限公司;抗體親和層析試劑盒購自PIERCE公司;TK-4T1融合蛋白為本實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)[4];預(yù)染的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購自Fermentas(MBI)公司;PVDF膜購自德國(guó)SchleicherSchuell公司;化學(xué)發(fā)光試劑ECL購自PIERCE公司;凝膠成像系統(tǒng)(GeneGeniusBioIma-gingSystem)為Synegene公司產(chǎn)品;Westernblot設(shè)備為Biorad公司產(chǎn)品.1.2生物信息學(xué)分析登錄進(jìn)入采用Blastn和Blastx程序,進(jìn)行同源性檢索和保守性分析.采用ProtScale程序、ExPASy工具包程序、SWISSPROT蛋白數(shù)據(jù)庫和DNAstar(Protean)生物信息學(xué)軟件對(duì)TK(KLK1)的二級(jí)構(gòu)造、抗原性、親疏水性、結(jié)合位點(diǎn)、氨基酸的帶電性等理化性質(zhì)進(jìn)行分析.1.3TK多肽的設(shè)計(jì)與免疫原及包被原的合成.TK是位于人類染色體19q13.13~19q13.14上的一段絲氨酸蛋白酶(圖1),由262個(gè)氨基酸組成.我們根據(jù)生物信息學(xué)分析和預(yù)測(cè),按抗原性、親疏水性和同源性分析,分別設(shè)計(jì)了位于TK頭端的含11個(gè)氨基酸的多肽(11P:AC-Glu-Asn-His-Thr-Arg-Gln-Ala-Asp-Glu-Asp-Thr-COOH)和位于TK尾端含12個(gè)氨基酸的多肽(12P:NH2-Cys-Lys-Trp-Ile-Glu-Asp-Thr-Ile-Ala-Glu-Asn-Ser-COOH)(圖2).多肽的合成和純化由西安美聯(lián)公司完成(純度為98%).首先稱取10mg多肽溶于1mlPBS,取華而不實(shí)700l置于10ml試管中,分別參加1mlKLH及BSA,然后緩慢參加0.3%戊二醛,室溫下振搖2h直至反響液變?yōu)辄S色,參加1mmol/L甘氨酸125l終止反響.30min后將所有反響液體裝入透析袋內(nèi),并將透析袋置于2LPBS中,在4℃充分透析,隔日更換PBS繼續(xù)透析4h.分裝包被原(11P-KLH;12P-KLH)及反響原(11P-BSA;12P-BSA),-20℃保存.1.4TK多克隆抗體的制備及純化分別取多肽免疫原(11P-KLH;12P-KLH)與等量弗氏完全佐劑充分乳化,按300g/只的劑量對(duì)家兔進(jìn)行背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射,3周后,將免疫原與等量弗氏不完全佐劑充分乳化,并用同樣的方式方法免疫小鼠,以后每隔3周免疫1次,共免疫3次.末次免疫后7d于耳緣靜脈取血,試血達(dá)理想效價(jià)后頸動(dòng)脈放血,收集兔血清并進(jìn)行親和層析純化.1.5TK多克隆抗體效價(jià)及抗原表位分析利用間接ELISA法來測(cè)定TK兔抗血清的效價(jià).以包被原為固相,參加倍比稀釋的兔抗清及HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體,以1∶200稀釋的正常兔血清作為陰性對(duì)照,應(yīng)用間接ELISA方式方法以TMB為底物測(cè)定OD450nm值,以(被檢標(biāo)本值-空白對(duì)照值)/(陰性對(duì)照值-空白對(duì)照值)即P/N2.1為陽性.采用間接ELISA相加實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定.以TK-4T1融合蛋白為抗原包被酶標(biāo)板,前兩孔分別參加上述兩種多抗(抗11P及抗12P),其OD值分別記錄為A1和A2,第3孔先以華而不實(shí)一種飽和量的多抗于37℃作用1h,洗滌后再與另一種多抗作用1h.洗滌后,參加HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG,于37℃保溫30min,洗滌后加TMB顯色,A450值記錄為A1+2,計(jì)算相加指數(shù):AI=[2A1+2/(A1+A2)-1]100%.每組做3個(gè)復(fù)孔,取其平均值.AI50%者,即以為這兩種多抗辨別TK不同的抗原表位.1.6TK多克隆抗體的特異性及純度檢測(cè)我們將TK-4T1與純化后的TK多克隆抗體行Westernblot檢測(cè)以鑒定多克隆抗體的特異性.然后利用SDS檢測(cè)多抗的純化效果.2結(jié)果.2.1多肽抗體的制備和效價(jià)家兔免疫后獲得的血清進(jìn)行倍比稀釋,以P/N,2.1為陽性,間接ELISA測(cè)定效價(jià)均達(dá)1∶25600以上,表示清楚獲得高效價(jià)的多抗.2.2抗原表位分析經(jīng)間接ELISA法檢測(cè),A1的均值為0.79,A2的均值為0.92,A(1+2)的均值為1.58;抗11P與抗12P的相加指數(shù)為0.85%,其值大于50%.因而抗11P與抗12P辨別不同的抗原表位.2.3多肽抗體的特異性為了檢測(cè)兔血清的特異性,我們分別將TK-4T1融合蛋白和陰性對(duì)照PEGX-4T1轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,然后將分別將純化后的抗體稀釋到1∶8000倍進(jìn)行Westernblot印跡分析,結(jié)果均顯示轉(zhuǎn)印至PVDF膜上的TK-4T1蛋白與免疫兔血清在Mr約55kD處構(gòu)成單一陽性染色帶,與TK-4T1蛋白分子量的理論值相符,而陰性對(duì)照處則無條帶出現(xiàn),表示清楚獲得了抗TK的多克隆抗體(圖3).2.4多肽抗體的純度利用親和層析法分別純化了抗11P與抗12P,并采用回收的抗體樣本做了SDS染色,結(jié)果均發(fā)現(xiàn)了清楚明晰的兩條帶(輕鏈和重鏈)且未見雜帶.因而,該抗體的純化率為100%(圖4).3討論.人組織激肽釋放酶是一類絲氨酸蛋白酶,位于人類染色體19q13.13~19q13.14上,因編碼不同的絲氨酸蛋白酶而具有不同的功能.人組織激肽釋放酶由15個(gè)成員組成.人和動(dòng)物的組織激肽釋放酶中只要一種酶能有效地使激肽原釋放生物活性物激肽即為TK[5].我們前期制備TK多抗的方式方法是采用構(gòu)建原核表示出載體,在大腸桿菌中表示出并純化圖4TK多克隆抗體經(jīng)親和層析純化后的SDAFig.4SDAofaffinitychromatographyforpoly-clonalantibodiesNote:M.Proteinmarker;1.Anti-11P;2.Anti-12P.融合蛋白(TK-4T1),隨后免疫動(dòng)物制備抗血清[4].鑒于利用融合蛋白制備抗體的經(jīng)過繁瑣,費(fèi)時(shí)費(fèi)力,特異性不理想,不利于我們進(jìn)一步進(jìn)行TK相關(guān)的臨床研究.因而我們利用信息學(xué)在基因辨別、蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)、蛋白質(zhì)生理范圍確實(shí)定、蛋白質(zhì)高級(jí)構(gòu)造的預(yù)測(cè)等方面的重要作用來對(duì)TK的抗原性、跨膜構(gòu)造域、二級(jí)構(gòu)造、疏水性、結(jié)合位點(diǎn)、氨基酸的帶電性、所選擇氨基酸偏堿性和偏酸性及多肽的合成難易等進(jìn)行分析[6].充分評(píng)估這些因素后我們選擇了針對(duì)TK不同表位的兩條多肽來制備針對(duì)TK不同表位的多克隆抗體.由于合成的多肽純度均高達(dá)98%,并且是針對(duì)TK一段表位的,因而其可能具有較高的效價(jià)及純度,并具有較強(qiáng)的特異性.我們的結(jié)果證實(shí)利用這兩條肽段制備的多抗均具有較高的效價(jià)及較強(qiáng)的特異性,并且是針對(duì)TK不同表位的抗體,經(jīng)純化后,這兩種抗體的純度均為100%.這講明我們的多抗制備是非常成功的.除此之外,由于這兩種抗體是針對(duì)TK不同表位的,我們能夠?qū)⑦@兩種抗體應(yīng)用于TK的雙抗體夾心ELISA試劑盒的制備及其他TK相關(guān)臨床及基礎(chǔ)研究.汪道文教授的團(tuán)隊(duì)及和LeeChao等人通過使用轉(zhuǎn)基因的方式方法使激肽釋放酶-激肽在體內(nèi)的持續(xù)供給,發(fā)現(xiàn)KKS系統(tǒng)具有抗高血壓,2型糖尿病的胰島素抵抗的作用及通過抑制氧化應(yīng)激來發(fā)揮心血管、腎臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保衛(wèi)作用[2,7].直接輸注TK的基因或蛋白能夠直接改善心功能、腎功能和神經(jīng)功能而不伴有血壓的降低.還有研究證明,過表示出的TK能減輕2糖尿病誘導(dǎo)的高血壓和腎臟損害.除此之外,體外研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均證明TK具有防護(hù)缺血性腦卒中的作用[2,9].我們前期的一項(xiàng)大規(guī)模的多中心研究亦證實(shí)血漿中TK的含量與腦卒中及其復(fù)發(fā)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,并且血漿中TK含量高的患者具有較長(zhǎng)的無異常感覺和狀態(tài)生存期[4].這一系列的研究進(jìn)一步證實(shí)了TK在心腦血管及腎臟疾病的診斷和治療方面可能具有廣闊的應(yīng)用前景,也講明了開發(fā)TK相關(guān)產(chǎn)品的潛在應(yīng)用價(jià)值.總之,我們通過合成肽來制備針對(duì)TK不同表位的多克隆抗體不僅提供了一種簡(jiǎn)便的行之有效的方式方法,還為TK相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)以及TK相關(guān)基礎(chǔ)及臨床研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).以下為參考文獻(xiàn):[1]TornelJ,MadridMI,Garcia-SalomM,etal.Roleofkininsinthecontrolofrenalpapillarybloodflow,pressurenatriuresis,andar-terialpressure[J].CircRes,2000,86(5):589-595.[2]ChaoJ,ChaoL.Kallikrein-kinininstroke,cardiovascularandre-naldisease[J].ExpPhysiol,2005,90(3):291-298.[3]RegoliD,RhalebNE,DrapeauG,etal.Kininreceptorsubtypes[J].JCardiovascPharmacol,1990,6:S30-S38.[4]ZhangQ,DingH,YanJ,etal.Plasmatissuekallikreinlevelisnegativelyassociatedwithincidentandrecurrentstroke:amulti-centercase-controlstudyinChina[J].AnnNeurol,2018,70(2):265-273.[5]HecquetC,TanF,MarcicBM,etal.HumanbradykininB(2)receptorisactivatedbykallikreinandotherserineproteases[J].Molecularpharmacology,2000,58(4):828-836.[6]BartlettGJ,ToddAE,ThorntonJM.Inferringproteinfunctionfromstructure[J].MethodsBiochemAnal,2003,44:387-407.[7]ZhaoC,WangP,XiaoX,etal.Genetherapywithhumantissuekallikreinreduceshypertensionandhyperinsulinemiainfructose-inducedhypertensiverats[J].Hypertension,2003,42(5):1026-1033.[8]XiaCF,YinH,YaoYY,etal.Kallikreinprotectsagainstischemicstrokebyinhibitinyapoptosisandinflammationandpromotinga