實(shí)驗(yàn)五金黃色葡萄球菌檢測(cè)概述

實(shí)驗(yàn)五金黃色葡萄球菌檢測(cè)概述第一頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日生物學(xué)特性

---菌體形態(tài)及培養(yǎng)特征大多數(shù)菌株能生長(zhǎng)在6.5-46℃之間（最適溫度30-37℃）能在之間生長(zhǎng)（最適pH為）；大多數(shù)菌株產(chǎn)生類(lèi)胡羅卜素，使細(xì)胞團(tuán)呈現(xiàn)出深橙色到淺黃色，色素的產(chǎn)生取決于生長(zhǎng)的條件，而且在單個(gè)菌株中可能也有變化第二頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日生物學(xué)特性

---菌體形態(tài)及培養(yǎng)特征好氧生長(zhǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生接觸酶；產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、脂酶和溶菌酶，大多數(shù)菌株可水解天然的動(dòng)物蛋白，例如血紅蛋白、纖維蛋白、卵白、酪朊和多肽類(lèi)如明膠，水解脂類(lèi)、吐溫類(lèi)和磷脂蛋白質(zhì)，并釋放脂肪酸；所有的毒株產(chǎn)生凝固酶，人和動(dòng)物來(lái)源的菌株通?？赡掏?、人、馬和豬的血漿。第三頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日致病性金黃色葡萄球菌為條件致病菌，菌株致病力的強(qiáng)弱主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶：

a.溶血素：外毒素，分α、β、γ、δ四種，能損傷血小板，破壞溶酶體，引起肌體局部缺血和壞死；

b.殺白細(xì)胞素：可破壞人的白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；

c.血漿凝固酶：當(dāng)金黃色葡萄球菌侵入人體時(shí)，該酶使血液或血漿中的纖維蛋白沉積于菌體表面或凝固，阻礙吞噬細(xì)胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化與此酶有關(guān)；

d.脫氧核糖核酸酶：金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的脫氧核糖核酸酶能耐受高溫，可用來(lái)作為依據(jù)鑒定金黃色葡萄球菌；

e.腸毒素：金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生數(shù)種引起急性胃腸炎的蛋白質(zhì)性腸毒素，分為A、B、C、D、E五種。第四頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日致病性葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌腸毒素所引起的疾病，可引發(fā)不同程度的急性胃腸炎癥狀，惡心、嘔吐最為突出而且普遍，腹痛、腹瀉次之。當(dāng)金黃色葡萄球菌污染了含淀粉及水分較多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在溫度條件適宜時(shí)，經(jīng)8-10小時(shí)即可相當(dāng)數(shù)量的腸毒素。第五頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日分布在自然界中廣泛存在，空氣、水、灰塵及人和動(dòng)物的排泄物中都可找到。作為人和動(dòng)物的常見(jiàn)病原菌，其主要存在于人和動(dòng)物的鼻腔、咽喉、頭發(fā)上，50%以上健康人的皮膚上都有金黃色葡萄球菌存在。因而，食品受其污染的機(jī)會(huì)很多。傳播媒介為被該菌污染的食品，主要為淀粉類(lèi)(如剩飯、米面、粥等)、牛乳及乳制品，以及魚(yú)、肉、蛋類(lèi)等。被污染的食物在室溫20℃-22℃放置5小時(shí)以上時(shí)，病菌大量繁殖，并產(chǎn)生腸毒素。第六頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日流行病學(xué)季節(jié)分布，多見(jiàn)于春夏季；中毒食品種類(lèi)多，如奶、肉、蛋、魚(yú)及其制品。此外，剩飯、油煎蛋、糯米糕及涼粉等引起的中毒事件也有報(bào)道。上呼吸道感染患者鼻腔帶菌率83%，所以人畜化膿性感染部位常成為污染源。第七頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日流行病學(xué)金黃色葡萄球菌腸毒素是個(gè)世界性衛(wèi)生問(wèn)題，在美國(guó)由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒占整個(gè)細(xì)菌性食物中毒的33%，加拿大則更多，占45%，我國(guó)每年發(fā)生的此類(lèi)中毒事件也非常多。第八頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日流行病學(xué)腸毒素形成條件：存放溫度，在37°C內(nèi)，溫度越高，產(chǎn)毒時(shí)間越短；存放地點(diǎn)，通風(fēng)不良氧分壓低易形成腸毒素；食物種類(lèi)，含蛋白質(zhì)豐富，水分多，同時(shí)含一定量淀粉的食物，腸毒素易生成。第九頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日耐受力幾乎所有的消毒試劑以及熱加工過(guò)程對(duì)金黃色葡萄球菌都有嚴(yán)重的破壞作用腸毒素可耐受100℃30分鐘不被破壞。對(duì)于加工過(guò)的食品或食品加工設(shè)備而言，此菌或其腸毒素的存在通常作為衛(wèi)生條件差的一種指標(biāo)。第十頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日污染的控制防止金黃色葡萄球菌污染食品

防止帶菌人群對(duì)各種食物的污染：定期對(duì)生產(chǎn)加工人員進(jìn)行健康檢查，患局部化膿性感染（如疥瘡、手指化膿等）、上呼吸道感染（如鼻竇炎、化膿性肺炎、口腔疾病等）的人員要暫時(shí)停止其工作或調(diào)換崗位。第十一頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日污染的控制防止金黃色葡萄球菌污染食品

防止金黃色葡萄球菌對(duì)奶及其制品的污染：如牛奶廠要定期檢查奶牛的乳房，不能擠用患化膿性乳腺炎的牛奶；奶擠出后，要迅速冷至-10℃以下，以防毒素生成、細(xì)菌繁殖。奶制品要以消毒牛奶為原料，注意低溫保存。第十二頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日污染的控制防止金黃色葡萄球菌污染食品

對(duì)肉制品加工廠，患局部化膿感染的禽、畜尸體應(yīng)除去病變部位，經(jīng)高溫或其他適當(dāng)方式處理后進(jìn)行加工生產(chǎn)。第十三頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日污染的控制防止金黃色葡萄球菌腸毒素的生成

應(yīng)在低溫和通風(fēng)良好的條件下貯藏食物，以防腸毒素形成；在氣溫高的春夏季，食物置冷藏或通風(fēng)陰涼地方也不應(yīng)超過(guò)6小時(shí)，并且食用前要徹底加熱。第十四頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日檢測(cè)步驟

---增菌利用金黃色葡萄球菌耐鹽的特性（可耐受15%的氯化鈉），用含10%氯化鈉的胰酪胨大豆肉湯增菌。第十五頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日檢測(cè)步驟

---分離血平板：金黃色葡萄球菌可以產(chǎn)生溶血素，因此在血平板上產(chǎn)生明顯的溶血環(huán)。血平板上其典型菌落呈金黃色，有時(shí)也為白色，大而突起，圓形，不透明，表面光滑，有溶血圈。第十六頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日檢測(cè)步驟

---分離BP平板：胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏提供碳源、氮源、硫、維生素和痕量礦物元素丙酮酸鈉是一種生長(zhǎng)促進(jìn)劑亞碲酸鹽對(duì)除金黃色葡萄球外的其他能分解卵黃的菌株有毒性，并使菌落產(chǎn)生黑色卵黃提供營(yíng)養(yǎng)和有利于觀察卵磷脂環(huán)甘氨酸和氯化鋰對(duì)金黃色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制作用。第十七頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日檢測(cè)步驟

---分離在BP平板上其典型菌落為：圓形，光滑突起，濕潤(rùn)，直徑2-3mm，顏色呈灰色到黑玉色，邊緣常為淡色（米黃色或灰白色略帶灰色或黃色的白色），周?chē)鸀橐换鞚釒?，在其外緣常有一透明圈。用接種針接觸菌落似有黃油樹(shù)膠的粘稠感。偶然會(huì)遇到不分解脂肪菌株，除無(wú)混濁帶及透明圈外，其他外觀基本相同。長(zhǎng)期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落，其黑色常較典型菌落淡些，且外觀可能粗燥，質(zhì)地較干燥。第十八頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日檢測(cè)步驟

---鑒定金黃色葡萄球菌可以產(chǎn)生凝固酶，因此對(duì)其鑒別的主要實(shí)驗(yàn)是測(cè)定其凝固酶。對(duì)于凝固不完全的菌株，可以通過(guò)一些其他實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步確認(rèn)，例如：厭氧葡萄糖發(fā)酵、溶葡萄球菌酶敏感性實(shí)驗(yàn)、耐熱核酸酶實(shí)驗(yàn)等。所有這些實(shí)驗(yàn)不能作為鑒別其產(chǎn)毒與否的依據(jù)。第十九頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊罅私馐称返馁|(zhì)量與金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)的意義。掌握金黃色葡萄球菌的生物學(xué)特性。掌握金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)的生化試驗(yàn)的操作方法和結(jié)果的判斷。掌握食品中金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)的方法和技術(shù)。第二十頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日二、原理葡萄球菌在自然界分布極廣，空氣、土壤、水、飼料、食品(剩飯、糕點(diǎn)、牛奶、肉品等)以及人和動(dòng)物的體表粘膜等處均有存在，大部分是不致病，也有一些致病的球菌。金黃色葡萄球菌是葡萄球菌屬一個(gè)種?？梢鹌つw組織炎癥，還能產(chǎn)生腸毒素。如果在食品中大量生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生毒素，人誤食了含有毒素的食品，就會(huì)發(fā)生食物中毒，故食品中存在金黃色葡萄球菌對(duì)人的健康是一種潛在危險(xiǎn)，檢查食品中金黃色葡萄球菌及數(shù)量具有實(shí)際意義。金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生凝固酶，使血漿凝固，多數(shù)致病菌株能產(chǎn)生溶血毒素，使血瓊脂平板菌落周?chē)霈F(xiàn)溶血環(huán)，在試管中出現(xiàn)溶血反應(yīng)。這些是鑒定致病性金黃色葡萄球菌的重要指標(biāo)。第二十一頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日三、試劑和儀器（一）最先準(zhǔn)備的器材規(guī)格名稱(chēng) 數(shù)量 用途1、500ml三角瓶 1個(gè) 7.5%氯化鈉肉湯2、500ml三角瓶 1個(gè) 10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯3、250ml三角瓶 4個(gè) 制血培養(yǎng)基等4、10×100mm試管 6支 血漿凝固酶試驗(yàn)5、1ml移液管 2支6、10ml移液管 2支7、直徑為90mm平皿12套 制血平板、B-P平板8、250ml量筒 1支（二）應(yīng)滅菌的其它器材剪刀1把 不銹鋼湯匙1把稱(chēng)量紙適量第二十二頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日（三）應(yīng)制備的培養(yǎng)基培養(yǎng)基總量 所用容器7.5%氯化鈉肉湯 225ml/瓶1瓶 500ml三角瓶10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯225ml/瓶1瓶500ml三角瓶血瓊脂 100ml/瓶1瓶 250ml三角瓶B—P培養(yǎng)基 95ml/瓶1瓶 250ml三角瓶兔血液 5ml第二十三頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日A.110%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯A.1.1成分胰酪胨（或胰蛋白胨）17.0g植物蛋白胨（或大豆蛋白胨）3.0g氯化鈉100.0g磷酸氫二鉀2.5g丙酮酸鈉10.0g葡萄糖2.5g蒸餾水1000mLpH7.3±0.2A.1.2制法將上述成分混合，加熱，輕輕攪拌并溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝，每瓶225mL，121℃高壓滅菌15min。第二十四頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日A.27.5%氯化鈉肉湯

A.2.1成分蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g氯化鈉75g蒸餾水1000mLpH7.4A.2.2制法將上述成分加熱溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝，每瓶225mL，121℃高壓滅菌15min。第二十五頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日A.3血瓊脂平板A.3.1成分：豆粉瓊脂（pH7.4～7.6）100mL脫纖維羊血（或兔血）5mL～10mLA.3.2制法：加熱溶化瓊脂，冷卻至50℃，以無(wú)菌操作加入脫纖維羊血，搖勻，傾注平板。血瓊脂平板：蛋白胨10g牛肉膏5g氯化鈉5g瓊脂10~20g蒸餾水1000ml

煮沸至充分溶解，高壓滅菌15~20min待冷卻至50℃左右時(shí)加入50ml抗凝羊血（除去纖維）或兔血。搖勻或攪勻倒平板或試管斜面。溫度過(guò)高，培養(yǎng)基呈棕褐色；溫度過(guò)低則不利于血液與培養(yǎng)基混勻。第二十六頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日A.4Baird－Parker瓊脂平板A.4.1成分胰蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g酵母膏1.0g丙酮酸鈉10.0g甘氨酸12.0g氯化鋰（LiCl·6H2O）5.0g瓊脂20.0g蒸餾水950mLpH7.0±0.2A.4.2增菌劑的配法30%卵黃鹽水50mL與經(jīng)過(guò)除菌過(guò)濾的1%亞碲酸鉀溶液10mL混合，保存于冰箱內(nèi)。A.4.3制法將各成分加到蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，調(diào)節(jié)pH。分裝每瓶95mL，121℃高壓滅菌15min。臨用時(shí)加熱溶化瓊脂，冷至50℃，每95mL加入預(yù)熱至50℃的卵黃亞碲酸鉀增菌劑5mL搖勻后傾注平板。培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明的。使用前在冰箱儲(chǔ)存不得超過(guò)48h。稱(chēng)取本品63克,加入950ml蒸餾水中,加熱煮沸溶解，分裝,121℃高壓滅菌15分鐘備用。冷至50℃，每95ml加入預(yù)熱至50℃的卵黃亞碲酸鉀增菌液(04-025)配套試劑（用法與用量見(jiàn)配套試劑說(shuō)明）。搖勻后傾注平皿。培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明的。使用前在冰箱儲(chǔ)存不得超過(guò)48h）第二十七頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

（一）、增菌培養(yǎng)法樣品處理→→選擇性增菌→→選擇性平板分離→→血漿凝固酶試驗(yàn)鑒別→→結(jié)果報(bào)告第二十八頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日第一天樣品處理和增菌培養(yǎng)（一）、樣品處理固體或半固體食品：以無(wú)菌操作稱(chēng)取25g樣品，放入裝有225mL滅菌生理鹽水的滅菌均質(zhì)杯內(nèi)，于8000r/min均質(zhì)1～2min，制成1:10樣品勻液。

液體食品:：用滅菌吸管吸取25mL樣品，放入裝有225mL滅菌生理鹽水的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)(瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)，經(jīng)充分振搖制成1:10樣品勻液。（二）、增菌培養(yǎng)接種操作：吸取5mL稀釋液接入7.5%NaCl肉湯或胰蛋白胨肉湯中。37°C培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)：放于36±1℃培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)果：在NaCl肉湯中呈混濁生長(zhǎng)，胰蛋白胨肉湯中有時(shí)液體澄清，菌量多時(shí)呈混濁生長(zhǎng)。第二十九頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日第二天接種選擇性平板進(jìn)行分離培養(yǎng)（一）、接種選擇性平板取增菌液1環(huán)，劃線接種于血平板或B－P平板。（二）、培養(yǎng)放于36±1℃培養(yǎng)24h。第三十頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日第三天觀察分離結(jié)果、鏡檢、做血漿凝固酶試驗(yàn)（一）、觀察分離結(jié)果結(jié)果：金黃色葡萄球菌，在血平板上呈：金黃或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周?chē)腥苎?；在Baird-Parker平板上：菌落為圓形，直徑2-3mm，顏色灰或黑色，周?chē)幸粶啙釒?，在其外層有一透明圈。（二）、革蘭氏染色、鏡檢操作：革蘭氏染色→鏡檢結(jié)果：金黃色葡萄球菌，革蘭氏陽(yáng)性，顯微鏡下呈葡萄狀排列無(wú)芽胞，直徑0.5-1μm。（三）、結(jié)果報(bào)告：綜合形態(tài)特征，血平板情況以及血漿凝固酶試驗(yàn)結(jié)果，判別檢樣有否金黃色葡萄球菌作出報(bào)告。第三十一頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，