實驗一雞卵類粘蛋白的分離與純化轉(zhuǎn)

實驗一雞卵類粘蛋白的分離與純化轉(zhuǎn)第一頁，共二十五頁，2022年，8月28日【目的要求】

了解并熟悉雞卵類黏蛋白的提取、分離、純化的方法,掌握凝膠過濾柱層析、離子交換柱層析、透析純化等方法分離純化雞卵類黏蛋白的原理及操作方法。第二頁，共二十五頁，2022年，8月28日【學(xué)科知識點】

選擇性沉淀法從雞蛋清中提取雞卵類黏蛋白；凝膠層析法純化雞卵類黏蛋白粗提液；離子交換柱層析法進一步純化雞卵類黏蛋白提取液；透析純化的方法去除樣品中鹽類；紫外分光光度法鑒定樣品含量及純度；有機溶劑等電沉淀法獲得雞卵類黏蛋白純品。第三頁，共二十五頁，2022年，8月28日實驗內(nèi)容

雞卵類黏蛋白的提取

凝膠層析對雞卵類黏蛋白提取液的純化

雞卵類黏蛋白純品的制備第四頁，共二十五頁，2022年，8月28日

雞卵黏蛋白是一種糖蛋白，存在于雞蛋清中，在10％三氯乙酸或50％丙酮溶液中有較好的溶解度。選擇合適的pH值，三氯乙酸濃度和丙酮濃度，可以從蛋清中獲得雞卵黏蛋白的粗提液?！净驹怼?/p>

雞卵類黏蛋白的提取第五頁，共二十五頁，2022年，8月28日【操作步驟】1)

取1個雞蛋蛋清，量出體積，加入等體積的10％三氯乙酸溶液，形成類似于酸奶狀的白色沉淀，攪拌均勻，在酸度計上檢查pH值,若偏離3.5，

則要用10％

NaOH溶液調(diào)至pH3.5室溫靜置4h。雞卵類黏蛋白的提取第六頁，共二十五頁，2022年，8月28日2)4h后,

3000r/min離心10min。收集上清液，再用濾紙過濾，除去上清液中脂類物質(zhì)及其它不溶物。濾液量體積，轉(zhuǎn)入500mL燒杯內(nèi)，緩慢加入3倍體積冷丙酮，攪勻，用塑料薄膜封嚴，置冰箱放置2h。雞卵類黏蛋白的提取第七頁，共二十五頁，2022年，8月28日3)小心虹吸出部分上清液，剩余部分全部轉(zhuǎn)移到離心管里，經(jīng)平衡后以3500r/min離心10min，棄清液，沉淀物放在真空干燥器內(nèi)，抽氣除去殘留丙酮。4)離心管中加入20mL蒸餾水溶解，將溶解液用SephadexG-25層析柱脫鹽。雞卵類黏蛋白的提取第八頁，共二十五頁，2022年，8月28日

蛋白質(zhì)混合溶液在經(jīng)過凝膠層析柱時，大分子蛋白質(zhì)沿顆粒間的空隙以較快的速度流過凝膠柱，最先流出柱外。而鹽或其他小分子物質(zhì)因進入凝膠顆粒的微孔中向下移動的速度較慢，所以最后流出柱外。因此通過凝膠層析可以達到除去小分子物質(zhì)的目的。凝膠層析對雞卵類黏蛋白提取液的純化【基本原理】第九頁，共二十五頁，2022年，8月28日凝膠層析對雞卵類黏蛋白提取液的純化凝膠層析分離原理示意圖第十頁，共二十五頁，2022年，8月28日1）凝膠的處理

量取100mLSephadexG-25凝膠，加入200mL磷酸鹽緩沖液，沸水浴中1h。上柱前用真空干燥器抽氣?！静僮鞑襟E】凝膠層析對雞卵類黏蛋白提取液的純化2）裝柱將柱子垂直地安裝好，關(guān)閉層析柱出水口，將脫氣后的凝膠緩緩地倒進柱內(nèi)，使之自然沉降。第十一頁，共二十五頁，2022年，8月28日3）平衡打開核酸蛋白檢測儀、記錄儀電源，將柱出水口與核酸蛋白檢測儀比色池進液口相連，開啟柱口下夾子，用約2倍體積的pH6.5磷酸鹽緩沖液平衡。直至流出液在蛋白檢測儀上繪出穩(wěn)定的基線。凝膠層析對雞卵類黏蛋白提取液的純化第十二頁，共二十五頁，2022年，8月28日第十三頁，共二十五頁，2022年，8月28日第十四頁，共二十五頁，2022年，8月28日

4)上樣取樣品溶解液上SephadexG-25層析柱。控制流速15d/min，收集蛋白峰。即可得到雞卵類黏蛋白粗提液。并準備進一步用DEAE-纖維素柱層析純化。凝膠層析對雞卵類黏蛋白提取液的純化第十五頁，共二十五頁，2022年，8月28日第十六頁，共二十五頁，2022年，8月28日【基本原理】

初步提取得到的雞卵類粘蛋白，經(jīng)DEAE-纖維素離子交換柱進一步純化，可除去少量的雜蛋白。得到雞卵類粘蛋白的純?nèi)芤骸Ｈ缓蠼?jīng)透析、丙酮沉淀、抽真空干燥即可獲得雞卵類粘蛋白純品。雞卵類黏蛋白純品的制備第十七頁，共二十五頁，2022年，8月28日1)量取已處理的DEAE-纖維素50mL，用60mLpH6.5磷酸鹽緩沖液浸泡約15mim，脫氣。2）裝柱將脫氣后的DEAE-纖維素裝入柱內(nèi)。用pH6.5磷酸鹽緩沖液平衡，流出液在核酸蛋白質(zhì)檢測儀上繪出穩(wěn)定的基線即可加樣?！静僮鞑襟E】雞卵類黏蛋白純品的制備第十八頁，共二十五頁，2022年，8月28日

4)洗脫

改用含0.3mol/LNaCl的pH6.5的磷酸鹽緩沖液洗脫，收集蛋白峰。3)上樣吸附

取經(jīng)上述純化后的雞卵類粘蛋白粗品上樣，待樣品全部流入柱床后，用pH6.5的磷酸鹽緩沖液平衡，洗去未被吸附的雜蛋白。雞卵類黏蛋白純品的制備第十九頁，共二十五頁，2022年，8月28日

5)透析除鹽

將層析收集的蛋白溶液放入透析袋內(nèi)，對蒸餾水進行透析，間隔1h更換一次蒸餾水，直至經(jīng)1%AgNO3檢查無氯離子為止（過夜）。6)

量透析后蛋白樣品體積。取出1mL,稀釋10倍，在紫外分光光度計280nm處測定雞卵類粘蛋白的含量。剩余樣品用1mol/LHCl調(diào)至pH4.0。雞卵類黏蛋白純品的制備第二十頁，共二十五頁，2022年，8月28日紫外分光光度計第二十一頁，共二十五頁，2022年，8月28日

7)蛋白溶液中加入3倍體積冷丙酮，用塑料薄膜封口，放入冰箱靜置4h。8)傾去上清，渾濁液轉(zhuǎn)到離心管內(nèi)，于3500r/min離心10min,沉淀抽真空干燥，即可得到透明膠狀物－雞卵類粘蛋白。雞卵類黏蛋白純品的制備第二十二頁，共二十五頁，2022年，8月28日

BA

1)雞卵類粘蛋白（mg/mL）=

———————2)雞卵類粘蛋白的產(chǎn)率（mg/mL）=100mL雞蛋清得到雞卵粘蛋白的mg數(shù)。

3)繪制SephadexG-25柱層析分離雞卵粘蛋白的層析圖。

4)繪制離子交換柱層析分離雞卵粘蛋白的層析圖。A280×稀釋倍數(shù)0.413實驗結(jié)果與數(shù)據(jù)處理