實(shí)驗(yàn)一雞卵類粘蛋白的分離與純化轉(zhuǎn)

實(shí)驗(yàn)一雞卵類粘蛋白的分離與純化轉(zhuǎn)第一頁，共二十五頁，2022年，8月28日【目的要求】

了解并熟悉雞卵類黏蛋白的提取、分離、純化的方法,掌握凝膠過濾柱層析、離子交換柱層析、透析純化等方法分離純化雞卵類黏蛋白的原理及操作方法。第二頁，共二十五頁，2022年，8月28日【學(xué)科知識(shí)點(diǎn)】

選擇性沉淀法從雞蛋清中提取雞卵類黏蛋白；凝膠層析法純化雞卵類黏蛋白粗提液；離子交換柱層析法進(jìn)一步純化雞卵類黏蛋白提取液；透析純化的方法去除樣品中鹽類；紫外分光光度法鑒定樣品含量及純度；有機(jī)溶劑等電沉淀法獲得雞卵類黏蛋白純品。第三頁，共二十五頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

雞卵類黏蛋白的提取

凝膠層析對(duì)雞卵類黏蛋白提取液的純化

雞卵類黏蛋白純品的制備第四頁，共二十五頁，2022年，8月28日

雞卵黏蛋白是一種糖蛋白，存在于雞蛋清中，在10％三氯乙酸或50％丙酮溶液中有較好的溶解度。選擇合適的pH值，三氯乙酸濃度和丙酮濃度，可以從蛋清中獲得雞卵黏蛋白的粗提液。【基本原理】

雞卵類黏蛋白的提取第五頁，共二十五頁，2022年，8月28日【操作步驟】1)

取1個(gè)雞蛋蛋清，量出體積，加入等體積的10％三氯乙酸溶液，形成類似于酸奶狀的白色沉淀，攪拌均勻，在酸度計(jì)上檢查pH值,若偏離3.5，

則要用10％

NaOH溶液調(diào)至pH3.5室溫靜置4h。雞卵類黏蛋白的提取第六頁，共二十五頁，2022年，8月28日2)4h后,

3000r/min離心10min。收集上清液，再用濾紙過濾，除去上清液中脂類物質(zhì)及其它不溶物。濾液量體積，轉(zhuǎn)入500mL燒杯內(nèi)，緩慢加入3倍體積冷丙酮，攪勻，用塑料薄膜封嚴(yán)，置冰箱放置2h。雞卵類黏蛋白的提取第七頁，共二十五頁，2022年，8月28日3)小心虹吸出部分上清液，剩余部分全部轉(zhuǎn)移到離心管里，經(jīng)平衡后以3500r/min離心10min，棄清液，沉淀物放在真空干燥器內(nèi)，抽氣除去殘留丙酮。4)離心管中加入20mL蒸餾水溶解，將溶解液用SephadexG-25層析柱脫鹽。雞卵類黏蛋白的提取第八頁，共二十五頁，2022年，8月28日

蛋白質(zhì)混合溶液在經(jīng)過凝膠層析柱時(shí)，大分子蛋白質(zhì)沿顆粒間的空隙以較快的速度流過凝膠柱，最先流出柱外。而鹽或其他小分子物質(zhì)因進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中向下移動(dòng)的速度較慢，所以最后流出柱外。因此通過凝膠層析可以達(dá)到除去小分子物質(zhì)的目的。凝膠層析對(duì)雞卵類黏蛋白提取液的純化【基本原理】第九頁，共二十五頁，2022年，8月28日凝膠層析對(duì)雞卵類黏蛋白提取液的純化凝膠層析分離原理示意圖第十頁，共二十五頁，2022年，8月28日1）凝膠的處理

量取100mLSephadexG-25凝膠，加入200mL磷酸鹽緩沖液，沸水浴中1h。上柱前用真空干燥器抽氣。【操作步驟】凝膠層析對(duì)雞卵類黏蛋白提取液的純化2）裝柱將柱子垂直地安裝好，關(guān)閉層析柱出水口，將脫氣后的凝膠緩緩地倒進(jìn)柱內(nèi)，使之自然沉降。第十一頁，共二十五頁，2022年，8月28日3）平衡打開核酸蛋白檢測(cè)儀、記錄儀電源，將柱出水口與核酸蛋白檢測(cè)儀比色池進(jìn)液口相連，開啟柱口下夾子，用約2倍體積的pH6.5磷酸鹽緩沖液平衡。直至流出液在蛋白檢測(cè)儀上繪出穩(wěn)定的基線。凝膠層析對(duì)雞卵類黏蛋白提取液的純化第十二頁，共二十五頁，2022年，8月28日第十三頁，共二十五頁，2022年，8月28日第十四頁，共二十五頁，2022年，8月28日

4)上樣取樣品溶解液上SephadexG-25層析柱?？刂屏魉?5d/min，收集蛋白峰。即可得到雞卵類黏蛋白粗提液。并準(zhǔn)備進(jìn)一步用DEAE-纖維素柱層析純化。凝膠層析對(duì)雞卵類黏蛋白提取液的純化第十五頁，共二十五頁，2022年，8月28日第十六頁，共二十五頁，2022年，8月28日【基本原理】

初步提取得到的雞卵類粘蛋白，經(jīng)DEAE-纖維素離子交換柱進(jìn)一步純化，可除去少量的雜蛋白。得到雞卵類粘蛋白的純?nèi)芤?。然后?jīng)透析、丙酮沉淀、抽真空干燥即可獲得雞卵類粘蛋白純品。雞卵類黏蛋白純品的制備第十七頁，共二十五頁，2022年，8月28日1)量取已處理的DEAE-纖維素50mL，用60mLpH6.5磷酸鹽緩沖液浸泡約15mim，脫氣。2）裝柱將脫氣后的DEAE-纖維素裝入柱內(nèi)。用pH6.5磷酸鹽緩沖液平衡，流出液在核酸蛋白質(zhì)檢測(cè)儀上繪出穩(wěn)定的基線即可加樣。【操作步驟】雞卵類黏蛋白純品的制備第十八頁，共二十五頁，2022年，8月28日

4)洗脫

改用含0.3mol/LNaCl的pH6.5的磷酸鹽緩沖液洗脫，收集蛋白峰。3)上樣吸附

取經(jīng)上述純化后的雞卵類粘蛋白粗品上樣，待樣品全部流入柱床后，用pH6.5的磷酸鹽緩沖液平衡，洗去未被吸附的雜蛋白。雞卵類黏蛋白純品的制備第十九頁，共二十五頁，2022年，8月28日

5)透析除鹽

將層析收集的蛋白溶液放入透析袋內(nèi)，對(duì)蒸餾水進(jìn)行透析，間隔1h更換一次蒸餾水，直至經(jīng)1%AgNO3檢查無氯離子為止（過夜）。6)

量透析后蛋白樣品體積。取出1mL,稀釋10倍，在紫外分光光度計(jì)280nm處測(cè)定雞卵類粘蛋白的含量。剩余樣品用1mol/LHCl調(diào)至pH4.0。雞卵類黏蛋白純品的制備第二十頁，共二十五頁，2022年，8月28日紫外分光光度計(jì)第二十一頁，共二十五頁，2022年，8月28日

7)蛋白溶液中加入3倍體積冷丙酮，用塑料薄膜封口，放入冰箱靜置4h。8)傾去上清，渾濁液轉(zhuǎn)到離心管內(nèi)，于3500r/min離心10min,沉淀抽真空干燥，即可得到透明膠狀物－雞卵類粘蛋白。雞卵類黏蛋白純品的制備第二十二頁，共二十五頁，2022年，8月28日

BA

1)雞卵類粘蛋白（mg/mL）=

———————2)雞卵類粘蛋白的產(chǎn)率（mg/mL）=100mL雞蛋清得到雞卵粘蛋白的mg數(shù)。

3)繪制SephadexG-25柱層析分離雞卵粘蛋白的層析圖。

4)繪制離子交換柱層析分離雞卵粘蛋白的層析圖。A280×稀釋倍數(shù)0.413實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)處理