實時熒光定量PCR的原理操作及其應(yīng)用

實時熒光定量PCR的原理操作及其應(yīng)用第一頁，共四十二頁，2022年，8月28日大綱一.原理概述二.操作及結(jié)果分析

(一).樣品制備

(二).引物及探針的設(shè)計與合成

(三).標準品的制備---質(zhì)?；蚣兓蟮腜CR產(chǎn)物

(四).通道的選擇及增益的選擇

(五).標準曲線的建立

(六).加樣時應(yīng)注意的細節(jié)

(七).閾值的選定

(八).熔解曲線分析

(九).操作流程三.應(yīng)用

(一).絕對定量分析

(二).相對定量分析及實驗方案

(三).SNP檢測分析第二頁，共四十二頁，2022年，8月28日一、原理概述1.Real-TimePCR概論

實時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國AppliedBiosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應(yīng)用。實時熒光定量PCR：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。定量PCR儀是在普通PCR儀的基礎(chǔ)上加裝了熒光激發(fā)裝置和熒光檢測裝置，PCR擴增和檢測同時進行，最終結(jié)果不需進行電泳檢測，所以有效地避免了樣品間的交叉污染。常規(guī)PCR技術(shù)：對PCR擴增反應(yīng)的終點產(chǎn)物進行定量和定性分析，無法對起始模板準確定量，無法對擴增反應(yīng)實時檢測。實時定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析。第三頁，共四十二頁，2022年，8月28日一、原理概述2.定量PCR常用的三個常用概念擴增曲線、熒光閾值、Ct值

(1).擴增曲線：反映PCR循環(huán)次數(shù)和熒光強度的曲線，定量PCR儀每次輪PCR擴增都會自動錄熒光強度的變化每個循環(huán)進行一次熒光信號的收集第四頁，共四十二頁，2022年，8月28日一、原理概述2.定量PCR常用的三個常用概念擴增曲線、熒光閾值、Ct值

(2).熒光閾值：樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值，手動設(shè)置的原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時要盡量選擇進入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于0.99。

(3).CT值：PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)。第五頁，共四十二頁，2022年，8月28日一、原理概述3.熒光定量PCR所用的熒光報告基團(1).非特異性熒光標記：SYBRGreen(2).特異性熒光標記：TaqMan探針

MolecularBeacon分子信標第六頁，共四十二頁，2022年，8月28日一、原理概述4.非特異性熒光染料---SYBRGreen的特性(1).SYBRGreen能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位(2).SYBRGreen只有和雙鏈DNA結(jié)合受激后才發(fā)熒光(3).變性時，DNA雙鏈分開，無熒光(4).復(fù)性和延伸時，形成雙鏈DNA,SYBRGreen發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號。SYBRGreenSYBRGreen第七頁，共四十二頁，2022年，8月28日一、原理概述4.非特異性熒光染料---SYBRGreen的工作原理圖解5’3’5’3’SGNoEmissionSGSGSGExcitationSGSGSGSGSGSGSG5’3’5’3’EmissionExcitation

伴隨著每輪PCR的進行，特異的基因片段不斷積累，SYBRGreen不斷的與新增加的基因片段結(jié)合而發(fā)出熒光，熒光信號不斷積累，熒光定量PCR儀實時記錄了熒光信號的變化。第八頁，共四十二頁，2022年，8月28日一、原理概述5.非特異性熒光染料SYBRGreen的優(yōu)缺點優(yōu)點：

(1).對DNA模板沒有選擇性----適用于任何DNA(2).使用方便-----不必設(shè)計復(fù)雜探針

(3).非常靈敏

(4).可做熔解曲線分析

(5).便宜缺點：

(1).對引物特異性要求較高

(2).與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性,干擾實驗的準確性,尤其是分析表達量不高的基因時,這類情況尤其突出;需要不斷的優(yōu)化反應(yīng)體系,降低非特異性擴增.第九頁，共四十二頁，2022年，8月28日一、原理概述6.TaqMan---水解型雜交探針與目標序列互補TaqMan探針的特性：(1).5′端標記有報告基團(Reporter,R)，如FAM、VIC等

(2).3′端標記有熒光淬滅基團(Quencher,Q)(3).探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光(4).Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針第十頁，共四十二頁，2022年，8月28日一、原理概述6.TaqMan---水解型雜交探針工作原理每擴增一條DNA分子，釋放一個熒光信號，可以在循環(huán)過程中任一點檢測熒光第十一頁，共四十二頁，2022年，8月28日一、原理概述7.探針法的優(yōu)缺點

(1).極高的特異性和準確性由于探針法除了引物序列的特異性之外，還有探針序列的特異性，從兩個方面保證了所擴增基因的特異性。

(2).良好的重復(fù)性

(3).目前合成價格較貴.(4).不能做熔解曲線分析.第十二頁，共四十二頁，2022年，8月28日一、原理概述8.熒光定量PCR的數(shù)學(xué)原理理想的PCR反應(yīng)：

X=X0*2n(擴增效率=1)實際的的PCR反應(yīng)：

X=X0*

(1+Ex)nn：擴增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)

X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量

X0：初始模板量

Ex：擴增效率第十三頁，共四十二頁，2022年，8月28日一、原理概述8.熒光定量PCR的數(shù)學(xué)原理在擴增產(chǎn)物達到閾值線時:XCt=X0(1+Ex)Ct=M(1)XCt:熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產(chǎn)物的量.在閾值線設(shè)定以后,它是一個常數(shù),我們設(shè)為M方程式(1)兩邊同時取對數(shù)得:logM=logX0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:logX0=-log(1+Ex)*Ct+logM(3)log(1+Ex)*Ct=-logX0+logM(4)Ct=

-logX0+logM(5)log(1+Ex)Log（x0的初始模板量）與到達閾值時的循環(huán)數(shù)（Ct值）呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴增達到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計算出樣品中所含的模板量第十四頁，共四十二頁，2022年，8月28日一、原理概述8.熒光定量PCR的數(shù)學(xué)原理模板DNA量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量第十五頁，共四十二頁，2022年，8月28日一、原理概述8.熒光定量PCR的數(shù)學(xué)原理25Sample確定未知樣品的C(t)值通過標準曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量第十六頁，共四十二頁，2022年，8月28日一、原理概述9.認識一下熒光定量PCR儀

儀器本身的功能：

1、控制參數(shù)（溫度）

2、控制循環(huán)數(shù)（時間）

3、記錄整個循環(huán)過程中的熒光值的變化，在所有的時間和溫度條件下，儀器都會忠實的記錄下熒光值的變化。熒光定量PCR儀就是通過對所記錄的參數(shù)來計算樣品的初始模板量的。循環(huán)數(shù)和熒光值曲線溫度和熒光值曲線第十七頁，共四十二頁，2022年，8月28日一、原理概述ABI7300型96孔熒光定量PCR儀，由于樣品間存在光程差，需ROX校正。RoterGene3000型36孔熒光定量PCR儀，旋轉(zhuǎn)加熱式，不需ROX校正第十八頁，共四十二頁，2022年，8月28日二、操作及結(jié)果分析1、樣品的制備

DNA樣品，主要是DNA提取，提取的DNA可TE緩沖液溶解后-20度保存；對于RNA樣品，抽提RNA后要迅速反轉(zhuǎn)錄，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，TE緩沖液溶解后可-20度保存。

DNA或cDNA樣品也不要長期存放，因為在存放過程中會有少量的DNA降解，從而影響樣品中目的基因的含量。對于大量的樣品最佳的檢測方案是：根據(jù)實際情況安排好每天要提取的樣品數(shù)量，提取后若是RAN立即進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，并且將當(dāng)天反轉(zhuǎn)錄的樣品進行定量PCR檢測；千萬不可先將所有的樣品都提取RNA，提取完RNA后再統(tǒng)一反轉(zhuǎn)錄，然后在對cDNA樣品進行定量檢測，千萬不要這樣做，因為RNA是極不穩(wěn)定的，哪怕是存放于-80度冰箱，一方面RNA極其容易降解從而影響檢測的準確性，另一方面萬一實驗室的超低溫冰箱放生故障造成停機或停電，那所有提取的RNA將會很大程度的降解，對樣品造成不可挽回的損失！最好的安排是：當(dāng)天提取或反轉(zhuǎn)錄的樣品，當(dāng)天就進行定量PCR的檢測，最大程度的減少RNA的降解，這樣測定的結(jié)果才更準確。第十九頁，共四十二頁，2022年，8月28日二、操作及結(jié)果分析2、定量PCR引物及探針的合成定量PCR所擴增的片段長度一般都不超過300bp，這樣才能確保結(jié)果更準確；染料法對引物的特異性要求較高，探針法對引物的特異性要求不高，探針法所擴增的片段長度更短，一般都在200bp以下。引物和探針都要進行Blast分析，以避免非特異性擴增。第二十頁，共四十二頁，2022年，8月28日二、操作及結(jié)果分析3、標準品的制備---質(zhì)?；蚣兓蟮腜CR產(chǎn)物這一步驟一般在預(yù)實驗時完成，嚴格意義上的操作要求將PCR產(chǎn)物切膠后進行膠回收，并進行質(zhì)粒的連接、轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中，質(zhì)粒在大腸桿菌中增值后提取質(zhì)粒，并用分光光度計測定含有PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒的OD值，借此來確定質(zhì)粒的摩爾量，將已知摩爾量的質(zhì)粒做5倍或10倍的連續(xù)梯度稀釋，做成質(zhì)粒標準品，這是準確測定樣品中目的基因模板量的定量基礎(chǔ)?，F(xiàn)在也有的不做質(zhì)粒，直接測定純化后的PCR產(chǎn)物的摩爾量，然后梯度稀釋PCR產(chǎn)物，以此來作為標準品。一般做四個標準品左右

5-25-125-625-312510-100-1000-10000-100000第二十一頁，共四十二頁，2022年，8月28日二、操作及結(jié)果分析4、通道的選擇及增益的選擇對于任何一款熒光定量PCR儀來說，都有一組或幾組激發(fā)光和濾光片以及相應(yīng)的檢測器和濾光片，這些就構(gòu)成了定量PCR儀的通道。不同的發(fā)光基團都有相應(yīng)的激發(fā)光和相應(yīng)的檢測器。定量PCR儀從最初的單通道發(fā)展到現(xiàn)在的多通道，常用的通道有FAM/HEX/JOE等?？筛鶕?jù)自己所用的發(fā)光基團來選擇相應(yīng)的通道。增益（gain），是熒光信號的放大倍數(shù)，發(fā)光基團的熒光是很微弱的，必須經(jīng)過適量的信號放大才能被檢測，否則，整個擴增曲線的熒光強度非常小，以致無法準確檢測。所以在實驗前，要選擇合適的增益倍數(shù)。第二十二頁，共四十二頁，2022年，8月28日二、操作及結(jié)果分析5、標準曲線的建立梯度稀釋后，標準品的擴增曲線間距相等，標準曲線上的間距也相等，說明標準曲線建立的很成功，假如間距參差不齊，說明梯度稀釋時操作誤差太大，建議重新做標準品的梯度稀釋，重新做標準曲線，直到擴增曲線之間的間距相等為止。因為這一步直接影響著樣品中目的基因原始模板量的準確性。第二十三頁，共四十二頁，2022年，8月28日二、操作及結(jié)果分析6、加樣時的操作所有的加樣操作要圍繞著盡量使反應(yīng)體系均一化為目的，除了樣品外，其他試劑都要進行預(yù)混，預(yù)混后分裝到各個PCR管中，最后加樣品，移液器要盡量準確，因為這一步的操作可以說是差之毫厘，謬以千里。第二十四頁，共四十二頁，2022年，8月28日二、操作及結(jié)果分析7、閾值的設(shè)定定量PCR反應(yīng)結(jié)束時開始對結(jié)果進行分析，此時需要劃定閾值，也就是在擴增曲線的指數(shù)期劃一條直線，這條線就叫閾值線，在閾值線上，所有的樣品的熒光值都一致相同，不同的只是所對應(yīng)的CT值和初始模板量！閾值的設(shè)定要盡量讓回歸系數(shù)最大！圖中的虛線即為閾值線第二十五頁，共四十二頁，2022年，8月28日二、操作及結(jié)果分析8.熔解曲線分析熔解曲線（melt分析）是指定量PCR反應(yīng)結(jié)束后讓樣品繼續(xù)升溫直到PCR產(chǎn)物的雙鏈全部打開，這時由于雙鏈打開，熒光染料不發(fā)熒光，這樣熒光值會有一個陡然的突降，借以檢測PCR產(chǎn)物的特異性，相當(dāng)于進行電泳檢測。因為不同的PCR產(chǎn)物片段其TM值不同，單一的雙鏈DNA其熒光陡降的溫度一致，加入含有非特異性擴增產(chǎn)物，那么其熒光陡降的溫度不止一個（兩個或更多或雜亂無章）。如圖：特異性強的溶解曲線第二十六頁，共四十二頁，2022年，8月28日二、操作及結(jié)果分析8.熔解曲線分析第二十七頁，共四十二頁，2022年，8月28日二、操作及結(jié)果分析9、操作流程確立實驗方案樣品制備設(shè)計引物及探針預(yù)實驗標準品及標準曲線的建立定量PCR檢測分析數(shù)據(jù)第二十八頁，共四十二頁，2022年，8月28日三、熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用1、絕對定量分析這是熒光定量PCR技術(shù)的直接應(yīng)用，可用于檢測病毒及細菌的濃度！第二十九頁，共四十二頁，2022年，8月28日三、熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用2、相對定量分析及實驗方案基因表達(geneexpression)是指細胞在生命過程中,把儲存在DNA順序中遺傳信息經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯,轉(zhuǎn)變成具有生物活性的蛋白質(zhì)分子.遺傳物質(zhì)DNA首先要把所攜帶的遺傳信息轉(zhuǎn)錄成為信使RNA（mRNA）,攜帶遺傳信息的mRNA從細胞核進入到細胞質(zhì)中與核糖體結(jié)合，在核糖體中mRNA攜帶的遺傳信息被翻譯成為多肽，多肽經(jīng)過進一步加工后變成蛋白質(zhì)，至此遺傳物質(zhì)DNA完成了表達過程。期間的轉(zhuǎn)錄過程是基因表達中非常重要的調(diào)節(jié)步驟，所轉(zhuǎn)錄的mRNA的多少直接影響著相關(guān)最終蛋白質(zhì)的多少，所以通過對細胞內(nèi)某條基因mRNA含量多少的分析，就能大致判斷出該條基因的表達是否活躍。第三十頁，共四十二頁，2022年，8月28日三、熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用2、相對定量分析及實驗方案研究基因表達的情況，我們只需搞清楚該基因在不同生理階段的變化趨勢如何就行了，而無需知道該基因的絕對量有多少?；虮磉_調(diào)控研究中，由于RNA純化后得率不同、RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初始樣品濃度不同，這就造成了比較上的混亂，因此在進行基因表達調(diào)控研究中都會用一些看家基因來標準化，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。所謂的看家基因即內(nèi)參基因，是指在各生理階段表達量恒定的基因，也稱奢侈基因，該基因表達一般不隨外界的變化而變化，所以常被用作參照，常用的內(nèi)參基因有GAPDH基因、β-Actin基因，18srRNA基因等。因此，在做基因表達調(diào)控分析時至少要做兩個基因，目的基因和一個看家基因。假定在1生理時期，X基因的表達量為X1；其內(nèi)參基因表達量為Y1；X1/Y1就將1生理時期的取樣、RNA提取、純化、反轉(zhuǎn)錄等過程的所有偏差均一化了；同樣在2生理時期，X2/Y2就將2生理時期的取樣、RNA提取、純化、反轉(zhuǎn)錄等過程的所有偏差均一化了；最后（X1/Y1）/（X2/Y2），所得的值就能就能較為真實的反應(yīng)在1、2生理時期，X基因的變化情況。常用的相對定量方法主要有兩種，雙標準曲線法和Delta-deltaCt法。第三十一頁，共四十二頁，2022年，8月28日三、熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用2、相對定量分析及實驗方案---雙標準曲線法所謂的雙標準曲線法就是對內(nèi)參基因和所研究的目的基因都做絕對定量，然后將各生理階段的目的基因的量和內(nèi)參基因的量相除，得出一個比值；最后再將不同生理階段所得的比值相除，最終得出目的基因在不同生理階段的表達變化。雙標準曲線法思路直觀、條理清晰，最大限度的避免了實驗的誤差，是一種很好的分析方法。第三十二頁，共四十二頁，2022年，8月28日三、熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用2．Delta-deltaCt法此法是經(jīng)定量的數(shù)學(xué)原理推導(dǎo)而來該方法直接利用看家基因來校正樣品初始量，但同時默認兩個基因擴增效率一致，而并非真實擴增情況的反映，因此實驗條件需要嚴格優(yōu)化，并且總會存一定的偏差。在預(yù)實驗中，必需對目的基因和看家基因做兩組標準曲線。軟件會自動給出兩組標準曲線的R值、擴增效率等信息，如果兩組標準曲線的斜率，即M值的差小于0.1，表明兩個基因的擴增效率已非常接近，那么后續(xù)實驗中就可以用此法進行相對定量分析。反之，如果M差值大于0.1，就無法用該方法進行相對定量分析。此時的解決方法有兩種，一是優(yōu)化實驗，使兩組標準曲線的斜率差值小于0.1，二是換用其它的相對定量方法。第三十三頁，共四十二頁，2022年，8月28日三、熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用3、SNP檢測分析基因組DNA是生物體各種生理、病理性狀的物質(zhì)基礎(chǔ)。人類眾多個體的基因組序列的一致性高達99%以上，但個體之間各種性狀的差異仍然很大，包括對疾病的易感性、對同一疾病治療藥物的反應(yīng)性等。在同一生物種群中明顯存在兩種以上不同的遺傳性狀，而且出現(xiàn)頻率較高，稱為遺傳的多態(tài)性(polymorphism)，而遺傳物質(zhì)DNA的多態(tài)性如RFLP、STR、ABO血型、HLA和單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)是個體間差異的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

SNPs是指在基因組水平上由于單個核苷酸位置上存在轉(zhuǎn)換(C與T互換，在其互補鏈上則為G與A互換)或顛換(C與A，G與T，C與G，A與T互換)等變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP是人類可遺傳的變異中最常見的一種,占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個堿基對中就有1個，估計其總數(shù)可達300萬個甚至更多。第三十四頁，共四十二頁，2022年，8月28日三、熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用3、SNP檢測分析通常所說的SNP都是二等位多態(tài)性的，轉(zhuǎn)換的發(fā)生率總是明顯高于其它幾種變異，具有轉(zhuǎn)換型變異的SNP約占2/3，其它幾種變異的發(fā)生幾率相似。轉(zhuǎn)換的幾率之所以高，可能是因為CpG二核苷酸上的胞嘧啶殘基是人類基因組中最易發(fā)生突變的位點，其中大多數(shù)是甲基化的，可自發(fā)地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。在基因組DNA中，任何堿基均有可能發(fā)生變異，因此SNP既有可能在基因序列內(nèi)，也有可能在基因以外的非編碼序列上?？偟膩碚f，位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP(cSNP)比較少，因為在外顯子內(nèi)，其變異率僅及周圍序列的1/5。但它在遺傳性疾病研究中卻具有重要意義，因此cSNP的研究更受關(guān)注。從對生物