核酸與核苷類藥物

第一節(jié)概述一、基本概念核酸與核苷類藥物是指具有藥用價(jià)值的核酸、核苷酸、核苷或者堿基天然的、類似物、衍生物及其聚合物作用：影響生物的蛋白質(zhì)合成和脂肪、糖類的代謝恢復(fù)正常代謝或干擾某些異常代謝用途：放射病、血小板減少癥、白細(xì)胞減少癥、急慢性肝炎、心血管疾病和肌肉萎縮、腫瘤、病毒病第1頁/共28頁核酸是一種多聚體大分子，它的組成單元是核苷酸，將核苷酸中的磷酸基團(tuán)去掉，剩余部分稱核苷，核苷進(jìn)一步分解可生成戊糖和堿基。胰核酸酶胰、腸核苷酸酶核苷酶第2頁/共28頁嘌呤核苷酸GMPAMP嘧啶核苷酸的結(jié)構(gòu)第3頁/共28頁核酸類藥物分類

——具有天然結(jié)構(gòu)的核酸類物質(zhì)如：ATP、GTP、CTP、UTP、IMP、CoA、CoI(NAD+)

、CoII(NADP+)

。這類藥物有助于改善物質(zhì)代謝和能量平衡，修復(fù)受損組織，促使缺氧組織恢復(fù)正常生理機(jī)能。臨床上廣泛用于放射病、血小板減少癥、白細(xì)胞減少癥、急慢性肝炎、心血管疾病和肌肉萎縮等的治療。這些藥物多數(shù)是生物體自身能夠合成的物質(zhì)，在具有一定臨床功能的前提下，毒副作用小，它們的生產(chǎn)基本上都可以經(jīng)微生物發(fā)酵或從生物資源中提取。ATP：用于心肌炎、心肌梗死、心力衰竭、及動(dòng)脈或冠狀動(dòng)脈硬化、肝炎等的治療或輔助治療。肌苷(IMP)：用于急慢性肝炎、肝硬化、白細(xì)胞減少、血小板減少等。第4頁/共28頁核酸類藥物分類

——自然結(jié)構(gòu)核酸類物質(zhì)的類似物和聚合物它們是當(dāng)今人類治療病毒、腫瘤、艾滋病的重要藥物，也是產(chǎn)生干擾素、免疫抑制劑的臨床藥物。主要有疊氮胸苷、阿糖腺苷、阿糖胞苷、聚肌胞等。第5頁/共28頁他莫昔芬擾雌激素的某些活動(dòng),模擬其它雌激素作用.用于治療某些乳腺癌和卵巢癌.第6頁/共28頁（一）酶解法及堿水解法制備核苷酸

1、酶解法制備脫氧核苷酸桔青霉產(chǎn)生5`-磷酸二脂酶

紅酵母產(chǎn)生3`-磷酸二脂酶二、核苷酸的生產(chǎn)方法第7頁/共28頁

第8頁/共28頁2、酶解法制備戊糖核苷酸

我國從60年代開始使用核酸酶P1降解核糖核酸生產(chǎn)單核苷酸，日本年產(chǎn)呈味核苷酸（肌苷酸和鳥苷酸）3000噸，其中60%是使用酶解法生產(chǎn)的。酶解法生產(chǎn)5‘-單核苷酸工藝流程第9頁/共28頁3．菌體自溶法生產(chǎn)核苷酸磷酸二酯酶在合適的條件下降解細(xì)胞內(nèi)的RNA可產(chǎn)生5’-核苷酸。在國內(nèi)用谷氨酸產(chǎn)生菌體自溶法生產(chǎn)5’-核苷酸。菌體自溶法生產(chǎn)核苷酸工藝流程：第10頁/共28頁4．堿水解法生產(chǎn)2’,3’-混合核苷酸RNA結(jié)構(gòu)中的磷酸二酯鍵對(duì)于堿性條件不穩(wěn)定,很容易生成2,3-環(huán)狀磷酸酯,此環(huán)狀磷酸酯對(duì)堿更不穩(wěn)定,很易加水分解生成2,3-混合核苷酸。取RNA配成3％～3.5%的水溶液,加氫氧化鈉達(dá)0.3mol/L濃度,升溫至38℃,保溫16～20小時(shí),用6mol/L鹽酸中和至pH7.0,從RNA水解成2,3-核苷酸的降解率達(dá)95％以上,將2,3-混合核苷酸制成每片含50～100mg的片劑,經(jīng)臨床使用,對(duì)非特異性血小板減少癥、對(duì)白血球減少癥、癌腫的化療和放療后的升白血球均有較好療效。第11頁/共28頁（二）發(fā)酵法生產(chǎn)核苷酸1．發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷酸（IMP）2、發(fā)酵生產(chǎn)黃苷酸（XMP）及酶法轉(zhuǎn)化成鳥苷酸第12頁/共28頁IMP生成總反應(yīng)過程第13頁/共28頁①SAMP合成酶③IMP脫氫酶②SAMP裂解酶④GMP合成酶AMP和GMP的生成SAMP黃苷酸肌苷酸肌苷酸肌苷酸第14頁/共28頁（三）半合成法制備核苷酸(略)由于發(fā)酵法生產(chǎn)核苷的產(chǎn)率很高，核苷懸浮于磷酸三甲酯或磷酸三乙酯中，在冷卻條件下加入氯化氧磷，進(jìn)行磷酸化，從核苷生成5’-核苷酸收率可達(dá)90%。例一：肌苷2mmol/L懸浮于5ml磷酸三乙酯中，溫度控制0℃，添加氯化氧磷6mmol/L，水2mmol/L，反應(yīng)2h，5’-IMP摩爾產(chǎn)率達(dá)91％。例二：鳥苷2mmol/L懸浮于5ml磷酸三甲酯中，溫度控制0℃，添加氯化氧磷6mmol/L，水2mmo/L，反應(yīng)6h，5’-GMP摩爾產(chǎn)率達(dá)90%。第15頁/共28頁第二節(jié)核酸類物質(zhì)的生產(chǎn)

一、RNA的提取與制備1.RNA的工業(yè)來源從微生物中提取RNA，是工業(yè)上最實(shí)際和有效的方法，一些最常見的菌體含有豐富的核酸資源。通常在細(xì)菌中RNA占5％-25％，在酵母中占2.7％～15％，在霉菌中占0.7%~28%,面包酵母含RNA4.1％～7.2％。

2.高RNA含量酵母菌體的篩選酵母菌體收率高，易于提取RNA?？梢詮淖匀唤绾Y選并可用誘變育種的方法提高酵母的RNA含量。第16頁/共28頁發(fā)酵法生產(chǎn)高含量RNA酵母及其RNA提取工藝流程見圖第17頁/共28頁2.RNA提取實(shí)例第18頁/共28頁二、DNA的提取與制備

DNA，可以促進(jìn)細(xì)胞的活化，調(diào)節(jié)新陳代謝，延緩機(jī)體衰老，維護(hù)正常免疫功能有積極的作用。1．工業(yè)用DNA的提取從冷凍魚精中提取。魚精中主要含有核蛋白、酶類以及多種微量元素。核蛋白的主要成分是脫氧核糖核酸(DNA)和堿性蛋白質(zhì)(魚精蛋白)，其中DNA占大約2／3。第19頁/共28頁2．具有生物活性DNA的制備可從動(dòng)物內(nèi)臟（肝、脾、胸腺）中提取制備，操作條件0～3℃。動(dòng)物內(nèi)臟加4倍量生理鹽水經(jīng)組織搗碎機(jī)搗碎1分鐘，勻漿于2500rpm離心30分鐘，沉淀用同樣體積的生理鹽水洗滌3次，每次洗滌后離心，將沉淀懸浮于20倍量的冷生理鹽水中，再搗碎3分鐘，加入2倍量5％十二烷基磺酸鈉，并攪拌2～3小時(shí)，在0℃2500rpm離心，在上層液中加入等體積的冷乙醇，離心即可得纖維狀DNA，再用冷乙醇和丙酮洗滌，減壓低溫干燥得粗品DNA。第20頁/共28頁三、核苷類藥物的制備

發(fā)酵法生產(chǎn)核苷是近代發(fā)酵工程領(lǐng)域中的杰出成果，產(chǎn)率高，周期短，控制容易，產(chǎn)量大。用發(fā)酵法生產(chǎn)各種核苷的菌株有著許多共同特點(diǎn)：①它們都使用磷酸單酯酶活力很強(qiáng)的枯草芽孢桿菌或短小芽抱桿菌為誘變出發(fā)菌株；②它們都是通過使用物理或化學(xué)誘變方法選育出在遺傳性狀上具有特定標(biāo)記的誘變菌；③它們?cè)诎l(fā)酵培養(yǎng)時(shí)必須提供限量的生長(zhǎng)因素，并且好氧，在某一特定的范圍內(nèi)累積大量核苷。第21頁/共28頁ADPAMPGMPGTPGDPSAMPIMPXMPAMP脫氨酶IMP脫氫酶GMP還原酶SAMP合成酶PRPPAICARSAICARPRPPATPSAMP裂解酶GMP合成酶

在右邊的合成途徑中，嘌呤核苷酸生物合成的第一個(gè)酶PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶受AMP、ADP、以及腺嘌呤衍生物的強(qiáng)烈抑制而受鳥嘌呤衍生物的抑制很弱。IMP脫氫酶受最終產(chǎn)物GMP及鳥嘌呤衍生物反饋抑制，SAMP合成酶受AMP反饋抑制的?？莶輻U菌的腺嘌呤缺陷型，當(dāng)培養(yǎng)基中提供限量腺嘌呤時(shí)就累積肌苷。而枯草桿菌的腺嘌呤、黃嘌呤缺陷型，當(dāng)培養(yǎng)基中提供限量鳥嘌呤時(shí)就累積腺苷?？莶輻U菌的嘌呤核苷酸合成途徑PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶強(qiáng)弱第22頁/共28頁生產(chǎn)菌株：（1）酶6、7缺失（為腺嘌呤缺陷型）積累IMP---肌苷（肝炎輔助藥）；（2）酶4缺失（為鳥嘌呤缺陷型）積累XMP---黃苷；（3）酶5缺失積累鳥苷。第23頁/共28頁肌苷生產(chǎn)菌（AJ11102）遺傳性狀：（菌種見P197）①腺嘌呤缺陷型（A-）；②GMP還原酶缺失（GMPred-）；③磺胺脒抗性（SGr）；④精氨酸缺陷型（Arg-）。選育出從遺傳上解除正常代謝控制的理想菌株。肌苷產(chǎn)率達(dá)20g/L.（一）發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷（I或Iou）第24頁/共28頁碳源為葡萄糖；保證充足的氮源（肌苷高的含N）；Mg+、Ca+有促進(jìn)作用；最適發(fā)酵溫度為30--34℃，pH6.0—6.2；需大風(fēng)量,高溶氧和低CO2第25頁/共28頁（二）聚肌胞苷酸（聚肌胞）(略)1、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1967年美國人Field發(fā)現(xiàn)聚肌胞是干擾素誘導(dǎo)物，而且具有廣譜抗病毒作用。本品是人工合成的干擾素誘導(dǎo)劑，系由多聚肌苷酸和多聚胞苷酸組成的雙股多聚核苷酸。本品可溶于0.85％氯化鈉溶液。2、生產(chǎn)工藝70年代中期我國開始研制聚肌胞，其生產(chǎn)工藝如下：1）底物5’-核苷二磷酸吡啶鹽的制備（P199）第26頁/共28頁（3）固定化多核苷酸磷酸化酶，將分離純化的酶液滴加入冰浴中的載體，得到共價(jià)結(jié)合的固定化多核苷酸磷酸化。3）PolyI：C制備（1）底物預(yù)處理：CDP吡啶鹽轉(zhuǎn)成鋰鹽，IDP轉(zhuǎn)成鈉鹽。（2）酶促反應(yīng)：（每毫升反應(yīng)液含μmol／L數(shù)）IDP或

CDP15；Tris150；MgC126；

2）固定化多核苷酸磷酸化酶的制備第27頁/共28頁EDTA1；聚合酶5