人工誘發(fā)單倍體及其應用

第十三章人工誘發(fā)單倍體及其應用第一節(jié)植物單倍體概念及人工誘發(fā)單倍體的應用二倍體(diploid)植物其單倍體（haploid）即一倍體（monoploid）如，玉米2n=2x=20n=x=10；水稻2n=2x=24n=x=12四倍體(tetraploid)植物其haploid為dihaploid如，馬鈴薯2n=4x=48，n=2x=24六倍體(hexaploid)植物其haploid為triploid如，普通小麥2n=6x=42，n=3x=21八倍體(octoploid)植物其haploid為tetraploid如，草莓2n=8x=56，n=4x=28單倍體(haploid)——指具有配子體（gametophyte）染色體數(shù)的孢子體(植物個體)(sporophyte)。

一、植物單倍體與人工誘發(fā)單倍體的應用人工誘發(fā)單倍體（artificialinducedhaploid）——單倍體細胞在人工離體條件下培養(yǎng)，使其單性發(fā)育成植物體。人工誘發(fā)單倍體的方法：組織和細胞離體培養(yǎng)遠緣雜交體細胞染色體消失異質(zhì)體孿生苗半配合和輻射等一、植物單倍體與人工誘發(fā)單倍體的應用單倍體的優(yōu)點：1.單倍體的每個染色體組都是單的，加倍后，由不育變可育，快速純合；2.單倍體每一種基因都只有一個，在單倍體內(nèi)，每個基因都能發(fā)揮自己對性狀發(fā)育的作用，不再區(qū)分基因的顯隱性，是研究基因性質(zhì)及作用的優(yōu)良材料；3.異源多倍體的各個染色體組之間并不是絕對異源的，一些染色體組間的染色體可能存在部分同源的關(guān)系，對研究物種起源和進化有幫助。二、植物單倍體在植物遺傳育種中的應用應用：1.利用單倍體植物控制雜種分離，加快常規(guī)育種速度；2.排除顯隱性基因的干擾，提高育種的選擇效率；3.遺傳分析；4.物種進化研究。二、植物單倍體在植物遺傳育種中的應用第二節(jié)花藥培養(yǎng)一、概述概念花藥培養(yǎng):把發(fā)育到一定階段的花藥接種在人工培養(yǎng)基上,使其發(fā)育和分化成為植株的過程.花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)是獲是植物單倍體的有效方法之一

體細胞染色體數(shù)減半；單倍體植物與二倍體相比較，有三個明顯的特點：

生長發(fā)育弱，體形小、各器官明顯減??；

雌雄配子嚴重敗育，有的甚至不能進入有性世代。

（二）花藥或花粉培養(yǎng)在作物育種中的作用：供體植株小孢子（N）花粉培養(yǎng)花粉植株（N）雄核發(fā)育自然加倍人工加倍純合植株（2N）（1）縮短育種年限：常規(guī)育種需4-6年獲得純系，而小孢子培養(yǎng)僅需1-2年。一年內(nèi)獲得純系例：二倍體供體植株基因型為AaBb，若要從后代中選擇基因為AAbb的純合單株常規(guī)方法：AAbb出現(xiàn)的概率為1/16，并且不能將AAbb與Aabb、aAbb區(qū)分開。

（2）提高了目標基因型的選擇效率

AB

aB

Ab

abAB AABB AaBB AABb AaBbaB aABB aaBB aABb aaBbAb AabB AabB AAbb Aabbab aAbB aabB aAbb aabb例：二倍體供體植株基因型為AaBb，若要從后代中選擇基因為AAbb的純合單株單倍體方法：AAbb出現(xiàn)的概率為1/4。

單倍體

二倍體

AB-------------------------->AABB

aB---------------------------->aaBB

Ab---------------------------->AAbb ab---------------------------->

aabb供體親本AaBb花粉培養(yǎng)

（2）提高了目標基因型的選擇效率

植株不受顯隱性的影響，在誘變育種中能在當代及時獲得突變個體，加倍后成為穩(wěn)定的純系。利于篩選隱性突變體提高誘變效率。

（3）誘變育種中的作用

（4） 利于獲得優(yōu)良植株如：蘆筍全雄系的培育

（5）用作基礎(chǔ)研究的各個領(lǐng)域花藥的結(jié)構(gòu)及花粉管的形成花藥的結(jié)構(gòu)及花粉粒的發(fā)育2NN減數(shù)分裂

四分體4個單核花粉粒（細胞壁薄、細胞質(zhì)濃、核位于細胞中央）

營養(yǎng)細胞（大）單核花粉粒（單核靠邊期）（兩者僅以質(zhì)膜相隔）精細胞生殖細胞（小）有絲分裂

（2-細胞花粉粒）精細胞

(3-細胞花粉粒）N雙核早期（三）花藥和花粉培養(yǎng)中雄核發(fā)育的途徑1、A途徑小孢子第一次有絲分裂為不均等分裂，形成營養(yǎng)細胞和生殖細胞（1）A-V途徑由營養(yǎng)細胞重復分裂形成單倍體（2）A-G途徑由生殖細胞重復分裂形成單倍體（3）A-VG途徑（E途徑）由營養(yǎng)細胞和生殖細胞各自獨立分裂，共同形成單倍體（4）C途徑營養(yǎng)細胞和生殖細胞通過核融合，形成多倍體植株2、B途徑小孢子第一次有絲分裂為均等分裂，形成大小相近的兩個細胞。然后由這兩細胞連續(xù)分裂形成單倍體植株，或者核融合形成多倍體植株。（三）花藥和花粉培養(yǎng)中雄核發(fā)育的途徑（四）花藥培養(yǎng)與花粉培養(yǎng)的異同點培養(yǎng)目的相同，均獲得小孢子植株?；ㄋ幣囵B(yǎng)屬于器官培養(yǎng)；而花粉培養(yǎng)屬于細胞培養(yǎng)?；ǚ叟囵B(yǎng)沒有藥壁組織干擾，單倍體產(chǎn)量高。（一）研究歷史：首先報道通過花藥培養(yǎng)獲得單倍體植株成功的是印度學者Guha和Maheshwari(1964,1966)。1996年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明,已有至少250多種植物花藥培養(yǎng)成功。

花藥培養(yǎng)獲得單倍體的技術(shù)途徑已在禾本科作物、茄科作物、十字花科作物的育種中廣泛應用。二、花藥培養(yǎng)技術(shù)（二）花藥培養(yǎng)的基本程序是：外植體選擇－消毒—剝?nèi)』ㄋ帯臃N—誘導培養(yǎng)—植株再生外植體的選擇：供試材料的遺傳背景，供試材料的生理狀態(tài)，花粉的發(fā)育時期等。

四分體4個單核花粉粒（細胞壁薄、細胞質(zhì)濃、核位于細胞中央）

營養(yǎng)細胞（大）單核花粉粒（單核靠邊期）（兩者僅以質(zhì)膜相隔）精細胞生殖細胞（?。┯薪z分裂

（2-細胞花粉粒）精細胞

(3-細胞花粉粒）N雙核早期

選擇花藥時，一般通過鏡檢來確定其中的花粉是否處于適宜的發(fā)育期。最常用的方法有醋酸洋紅法。但是，某些植物的花粉細胞核不易著色，需采用焙花青-鉻礬法，這種方法能將花粉細胞核染成藍黑色。（二）花藥培養(yǎng)的基本程序是：外植體選擇－消毒—剝?nèi)』ㄋ帯臃N—誘導培養(yǎng)—植株再生花藥的剝?nèi)。罕苊饣ㄋ幨艿綋p傷，因為損傷常會刺激花藥壁組織的發(fā)育，形成二倍體的愈傷組織?；ㄋ庮A處理大量試驗結(jié)果表明，花藥培養(yǎng)前給予一定的低溫處理是十分必要的。

花藥培養(yǎng)常用的基本培養(yǎng)基：

N6：高硝態(tài)氮，低銨態(tài)氮，廣泛用于禾本科植物的花藥培養(yǎng)

B5、MS、White、Nitch等。

C17（王培等，1986）：適于小麥花藥培養(yǎng)，提高出愈率。激素：相對較低的激素水平蔗糖：一般2-3%，高濃度對禾谷類較有利

番茄花藥培養(yǎng)對蔗糖濃度的誘導反應蔗糖濃度2％3％4％6％10％13％

17％

誘導頻率5％10％12％18％25％45％

8％培養(yǎng)條件－溫度和光照：第三節(jié)花藥培養(yǎng)注意的問題1.材料選擇（基因型；生理狀態(tài)；光照；花藥發(fā)育時期）2.預處理：如低溫冷藏3.材料滅菌4.花粉植株誘導花藥和花粉培養(yǎng)中的白花苗白化苗的控制

花粉發(fā)育時期：花藥培養(yǎng)中，白花苗的比例隨接種時花粉發(fā)育時期的延遲而提高。培養(yǎng)基成分：高濃度的2,4-D會使花粉愈傷組織分化出更多的白化苗培養(yǎng)溫度：當培養(yǎng)溫度提高時，白花苗的數(shù)目也隨之增加。第四節(jié)花粉培養(yǎng)花粉培養(yǎng)(小孢子培養(yǎng)):從花藥中分離出花粉粒,使之成為分散的或游離狀態(tài),通過培養(yǎng)使花粉粒脫分化,進而發(fā)育成完整植株的過程.花粉培養(yǎng)技術(shù)1、取材時期：四分體時期到單核早期?；ǚ叟囵B(yǎng)技術(shù)2、花粉的分離：1）自然散落法(漂浮培養(yǎng)自然釋放法)：將花藥接種在預處理液或液體培養(yǎng)基上，待花粉自動散落后，收集培養(yǎng)。2）機械游離法

a.磁攪拌法：用磁力攪拌器低速攪拌培養(yǎng)液中的花藥，使花粉游離出來；

b.擠壓法：在燒杯或研缽中擠壓花藥，將花粉擠出后收集培養(yǎng)。花粉培養(yǎng)技術(shù)3、小孢子純化：對獲得的小孢子混合物進行分級過篩、梯度離心處理純化小孢子花粉培養(yǎng)技術(shù)4、花粉的培養(yǎng)平板培養(yǎng)：花粉置瓊脂固化培養(yǎng)基上培養(yǎng)。液體培養(yǎng)：花粉懸浮在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，需震蕩，以利通氣。雙層培養(yǎng)：先鋪一層瓊脂固體培養(yǎng)基（加入失活花藥的浸提液），凝固后，在表面加入少量液體培養(yǎng)基培養(yǎng)?？醋o培養(yǎng)：利用花藥或花藥愈傷組織釋放出的活性物質(zhì)促進花粉小孢子發(fā)育。微室培養(yǎng)：利用小的蓋玻片和凹穴載玻片形成微室進行花粉培養(yǎng)?？醋o培養(yǎng)圖解

1、胚狀體發(fā)育途徑：小孢子經(jīng)歷胚發(fā)生的各個階段，最后子葉展開，形成花粉植株?；ǚ壑仓甑男螒B(tài)發(fā)生方式煙草花藥培養(yǎng)——通過胚狀體途徑再生形成小植株

2、愈傷組織發(fā)育途徑：小孢子分裂數(shù)次形成愈傷，再分化形成花粉植株。此途徑產(chǎn)生的植株會出現(xiàn)變異