發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)

第四章種子的擴大培養(yǎng)種子擴大培養(yǎng)的目的與要求種子制備實例種子制備的技術(shù)概要第一頁，共36頁。種子擴大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍枯燥管中處休眠狀態(tài)的消費菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養(yǎng),最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。第一節(jié)種子擴大培養(yǎng)的目的與要求種子擴大培養(yǎng)的概念:第二頁，共36頁。種子擴培的目的

接種量的需要

菌種的馴化縮短發(fā)酵時間、保證消費程度種子的要求：

總量及濃度能滿足要求

生理狀況穩(wěn)定，個體與群體活力強，移種至發(fā)酵后，可以迅速生長

無雜菌污染第三頁，共36頁。第一節(jié)種子制備過程舉例一、谷氨酸消費的種子制備制備過程斜面菌種→一級種子培養(yǎng)→二級種子培養(yǎng)→發(fā)酵第四頁，共36頁。1、斜面(AS1.299)培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化鈉

瓊脂2%，培養(yǎng)基特點：有利于菌體的生長，原料比較精細培養(yǎng)條件：32℃，生長18-24小時生長斜面要求：生長良好，所使用斜面連續(xù)傳代不超過

3次第五頁，共36頁。2.一級種子〔搖瓶〕培養(yǎng)條件：于1000ml三角瓶中，裝液200-250ml,32℃培養(yǎng)12小時。培養(yǎng)基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米漿2.5%，

K2HPO40.1%，硫酸鎂培養(yǎng)基特點：有利于菌體的生長，所使用的原料已經(jīng)基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基一級種子質(zhì)量要求種齡：12hpH值：6.4±0.1光密度：凈增OD值以上殘?zhí)牵海ヒ韵聼o菌檢查：(-)噬菌體檢查：(-)鏡檢：菌體生長均勻、粗壯，排列整齊革蘭氏陽性反響第六頁，共36頁。3.二級種子(種子罐)培養(yǎng)條件：在種子罐中培養(yǎng)〔容積為發(fā)酵罐的1%〕，32℃培養(yǎng)7-10個小時培養(yǎng)基：和一級種子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，濃度為2.5%培養(yǎng)基的特點：長菌體，更接近于發(fā)酵培養(yǎng)基通風(fēng)量:50L種子罐1:0.5,攪拌轉(zhuǎn)速340r／min；

250L種子罐1:0.3,攪拌轉(zhuǎn)速300r／min500L種子罐1:0.25,攪拌轉(zhuǎn)速230r／min第七頁，共36頁。種子的質(zhì)量要求：108-109個/ml大小均勻，呈單個或八字排列時完畢，活力旺盛無菌檢查第八頁，共36頁。二、青霉素消費的種子制備制備過程安培管→斜面孢子→大米孢子→一級種子→二級種子→發(fā)酵第九頁，共36頁。1、斜面孢子培養(yǎng)基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等培養(yǎng)基特點：有利于長孢子，用量少而精細培養(yǎng)條件：25℃、7天,注意濕度50%左右第十頁，共36頁。2、大米孢子培養(yǎng)基：大米及氮源〔玉米漿〕培養(yǎng)基的特點：本錢低、米粒之間構(gòu)造疏松進步比外表積和氧的傳質(zhì)，營養(yǎng)適當(dāng)〔要求大米的白點小〕有利于孢子的生長。培養(yǎng)條件：25℃、7天，控制濕度大米孢子的要求：1粒米含1.4*106個孢子第十一頁，共36頁。3、一級種子培養(yǎng)基：〔葡萄糖、乳糖、蔗糖〕、玉米漿目的：長菌體培養(yǎng)條件：27℃，40小時接種量：200億孢子/噸4、二級種子培養(yǎng)基：同上培養(yǎng)條件：27℃、10-14小時接種量：10%第十二頁，共36頁。三、啤酒酵母的擴大培養(yǎng)三級擴大培養(yǎng)擴大倍數(shù)：第1級到第2級為8-10倍第2級到第3級為4-6倍1，實驗室擴大培養(yǎng)第十三頁，共36頁。2，車間擴大培養(yǎng)第十四頁，共36頁。從實驗室搖瓶或孢子懸浮液容器接種接種方式：從種子罐接種：第十五頁，共36頁。種子的質(zhì)量要求菌絲長稠呈絲狀、菌絲團很少，有中小空孢，處于Ⅲ—Ⅳ期青霉素發(fā)酵菌絲體的生長共分為6個期，1-4為年青期，4-6期合成青霉素的才能最強第十六頁，共36頁。第二節(jié)種子制備的技術(shù)概要一、種子制備的過程實驗室階段：不用種子罐，所用的設(shè)備為培養(yǎng)箱、搖床等實驗室常見設(shè)備，在工廠這些培養(yǎng)過程一般都在菌種室完成，因此現(xiàn)象地將這些培養(yǎng)過程稱為實驗室階段的種子培養(yǎng)。消費車間階段：種子培養(yǎng)在種子罐里面進展，一般在工程歸為發(fā)酵車間管理，因此形象地稱這些培養(yǎng)過程為消費車間階段。第十七頁，共36頁。二、實驗室階段1、培養(yǎng)物選擇的原那么目的：種子擴培到一定的量和質(zhì)，根據(jù)菌種的特點最終的培養(yǎng)物可分為兩類：

對于不產(chǎn)孢子和芽胞的微生物

——獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體對于不產(chǎn)芽孢和孢子的微生物，實驗室階段的種子擴培最終是獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體，如谷氨酸的種子培養(yǎng)。第十八頁，共36頁。

獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的孢子菌絲體培養(yǎng)步驟少，因此更容易獲得量和質(zhì)穩(wěn)定的種子，但操作繁瑣。

對于產(chǎn)孢子的微生物

獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌絲體便于操作，但需要更仔細的控制。第十九頁，共36頁。例：放線菌孢子的制備采用瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基含麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無機鹽等。培養(yǎng)溫度一般為28?C。培養(yǎng)時間為5~14天。第二十頁，共36頁。2，厭氧培養(yǎng)：對于酵母菌〔啤酒，葡萄酒，清酒等〕試管→三角瓶→卡式罐→種子罐對于產(chǎn)孢子才能不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，如產(chǎn)鏈霉素的灰色鏈霉菌、產(chǎn)卡那霉素的卡那鏈霉菌可以用搖瓶液體培養(yǎng)法。將孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于搖瓶機上恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得菌絲體，作為種子。試管→三角瓶→搖床→種子罐第二十一頁，共36頁。2、培養(yǎng)基選擇的原那么培養(yǎng)基的選擇應(yīng)該是有利于菌體的生長，對孢子培養(yǎng)基應(yīng)該是有利于孢子的生長。在原料方面，實驗室種子培養(yǎng)階段，規(guī)模一般比較小，因此為了保證培養(yǎng)基的質(zhì)量，培養(yǎng)基的原料一般都比較精細。第二十二頁，共36頁。3、起始接種物的傳代問題

細菌保藏斜面→活化斜面

產(chǎn)孢子保藏→母斜面→子斜面目的：使菌種的傳代次數(shù)盡可能的少。第二十三頁，共36頁。

母瓶：活化、純化，使保藏菌種生長，并去處變異株。所以接種時要稀一點、便于純化生長到單菌落。

子瓶:大量繁殖，得到大量孢子。接種：①從母斜面上點接種，選取生長好的單菌落②接種時密一點，得到大量的孢子。孢子培養(yǎng)時注意濕度，子斜面使用一般不超過1個月孢子培養(yǎng)第二十四頁，共36頁。三、消費車間階段1、培養(yǎng)物的選擇原那么在消費車間階段，最終一般都是獲得一定數(shù)量的菌絲體。

縮短發(fā)酵時間

有利于獲得好的發(fā)酵結(jié)果菌絲體比孢子要有利：第二十五頁，共36頁。2、培養(yǎng)基選擇的原那么目的：獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體，因此培養(yǎng)基的選擇應(yīng)首先考慮的是有利于孢子的發(fā)育和菌體的生長，所以營養(yǎng)要比發(fā)酵培養(yǎng)基豐富。在原料方面：不如實驗室階段那么精細，而是根本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基，這有兩個方面的原因:

一是本錢二是馴化第二十六頁，共36頁。例：檸檬酸發(fā)酵

以蔗糖為原料成分斜面種子罐發(fā)酵麥芽汁麥汁蔗糖2.5-5%20%NH4NO30.225%0.11%K2HPO40.03%MgSO4.H2O0.025%0.025%KCl0.015%瓊脂2%第二十七頁，共36頁。

薯干粉成分斜面種子罐發(fā)酵麥芽汁麥汁薯干粉10%22-28%(NH4)2SO40.5%瓊脂2%第二十八頁，共36頁。3、發(fā)酵級數(shù)確實定谷氨酸：三級發(fā)酵一級種子〔搖瓶〕→二級種子〔小罐〕→發(fā)酵青霉素：三級發(fā)酵一級種子〔小罐〕→二級種子〔中罐〕→發(fā)酵一般由菌絲體培養(yǎng)開場計算發(fā)酵級數(shù)，但有時，工廠從第一級種子罐開場計算發(fā)酵級數(shù)第二十九頁，共36頁。發(fā)酵級數(shù)確定的根據(jù)

級數(shù)受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長特性、接種量的影響

級數(shù)大，難控制、易染菌、易變異，管理困難，一般2-4級。在發(fā)酵產(chǎn)品的放大中，反響級數(shù)確實定是非常重要的一個方面第三十頁，共36頁。細菌：二級發(fā)酵茄子瓶→種子罐→發(fā)酵罐霉菌：如青霉菌，三級發(fā)酵孢子懸浮液→一級種子罐〔27?C,40小時孢子發(fā)芽〕→二級種子罐〔27?C,10~24小時〕→發(fā)酵罐放線菌：四級發(fā)酵酵母：比細菌慢，比霉菌，放線菌快，通常用一級種子常用微生物發(fā)酵級數(shù)：第三十一頁，共36頁。4、接種量確實定

移入種子的體積接種量＝—————————

接種后培養(yǎng)液的體積過大過小都不好，以理論定，如大多數(shù)抗生素為7-15%。但是一般認為大一點好。通常接種量：細菌1~5%，酵母菌5~10%，霉菌7~15%，有時20~25%雙種：兩個種子罐接種到一個發(fā)酵罐中。倒種：一部分種子來源于種子罐，一部分來源于發(fā)酵罐。第三十二頁，共36頁。5、種齡種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌體開場移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。種齡短：菌體太少；種齡長：易老化。原那么：對數(shù)生長期末，細胞活力強，菌體濃度相對較大，但是最終由實驗結(jié)果定。嗜堿性芽孢桿菌消費堿性蛋白酶，12小時最好。第三十三頁，共36頁。6、種子的質(zhì)量要求：量：要求到達一定的濃度質(zhì):形態(tài)〔生長處于某個階段、均勻等等〕理化指標：C、N、P的含量，pH，產(chǎn)物生成量