標(biāo)記免疫技術(shù)

標(biāo)記免疫技術(shù)標(biāo)記免疫技術(shù)=抗原抗體反應(yīng)示蹤物標(biāo)記靈敏性特異性標(biāo)記免疫技術(shù)的主要特點(diǎn)：高特異性、高靈敏性免疫技術(shù)+標(biāo)記技術(shù)2021/3/102標(biāo)記免疫技術(shù)免疫測(cè)定技術(shù)免疫組化技術(shù)示蹤物及標(biāo)記技術(shù)酶免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光技術(shù)金免疫技術(shù)生物素-親和素免疫放大技術(shù)

……2021/3/103第一節(jié)酶免疫技術(shù)

基本原理

利用酶催化底物反應(yīng)的生物放大作用,提高特異性抗原-抗體免疫學(xué)反應(yīng)的檢測(cè)敏感性的一種標(biāo)記免疫技術(shù)。2021/3/104

基本特點(diǎn)：

①標(biāo)記后保留酶和抗原(抗體)的活性。②酶促反應(yīng)專(zhuān)一性，保證特異性。③底物反應(yīng)放大作用，提高敏感性。④酶標(biāo)試劑保存穩(wěn)定。⑤操作簡(jiǎn)便，安全易行。2021/3/105一、

酶免疫技術(shù)的分類(lèi)

酶免疫組化用于檢測(cè)組織切片或細(xì)胞涂片中的抗原和抗體

酶免疫技術(shù)均相酶免疫測(cè)定酶免疫測(cè)定固相酶免疫測(cè)定異相酶免疫測(cè)定（ELISA）液相酶免疫測(cè)定2021/3/106二、酶免疫技術(shù)的技術(shù)要點(diǎn)

（一）固相載體基本要求結(jié)合容量高，結(jié)合穩(wěn)定；可與抗原抗體復(fù)合物等大分子蛋白結(jié)合；生物大分子固化后仍保持活性；固化方法簡(jiǎn)便易行、快捷經(jīng)濟(jì)。2021/3/107種類(lèi)與選擇1.塑料制品2.微顆粒3.膜載體2021/3/108（二）酶與酶作用底物1.用于標(biāo)記酶的要求：酶活性高標(biāo)記后酶活性穩(wěn)定，且不影響標(biāo)記抗原與抗體的免疫反應(yīng)性酶催化底物后信號(hào)易判定或測(cè)定酶活性不受樣品中其他成分的影響酶、輔助因子及底物理化性質(zhì)穩(wěn)定，安全無(wú)害，價(jià)廉2021/3/1092.常用酶及其底物（1）辣根過(guò)氧化物酶（HRP）

常用底物：鄰苯二胺（OPD）：反應(yīng)顯橙黃色，應(yīng)避光，致癌性。四甲基聯(lián)苯胺（TMB）：反應(yīng)后呈藍(lán)色，無(wú)需避光，無(wú)致癌性，但水溶性差。2021/3/1010（2）堿性磷酸酶（AP）

常用底物為對(duì)硝基苯磷酸酯（p-NPP），產(chǎn)物為黃色。

*AP靈敏性高與HRP，但不易獲得純品，穩(wěn)定性及酶標(biāo)記物收率低于HRP，且價(jià)高，故應(yīng)用不如HRP普及。2021/3/1011（三）酶標(biāo)記抗體或抗原基本要求：

酶標(biāo)記抗原純度要高，抗原性完整；抗體的特異性好，效價(jià)高，親和力強(qiáng)，比活性高以及易于批量生產(chǎn)和分離純化。2021/3/1012酶標(biāo)記方法

1.交聯(lián)法

以雙功能交聯(lián)劑為“橋”，分別與酶和抗體（抗原）連接形成結(jié)合物。如戊二醛交聯(lián)法。2.直接法

用過(guò)碘酸鈉活化酶蛋白分子后，再與抗體（抗原）結(jié)合。僅適用于含糖蛋白分子的酶（如HRP）標(biāo)記物制備。2021/3/1013（四）標(biāo)記抗體鑒定（五）免疫吸附劑（六）試劑最佳工作濃度的選擇2021/3/1014三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)(一)基本原理：使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性（固相抗原／抗體的形成）

在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)（抗原抗體反應(yīng)）2021/3/1015用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開(kāi)，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。（酶標(biāo)抗原抗體復(fù)合物的分離）

加入底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。（顯色反應(yīng)）2021/3/1016（二）ELISA技術(shù)類(lèi)型：ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體，在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑：固相的抗原或抗體，酶標(biāo)記的抗原或抗體，酶作用的底物。

2021/3/10171．雙抗體夾心法2021/3/1018特點(diǎn)：非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)常用于抗原的檢測(cè)適用于分子中具有至少兩個(gè)抗原決定簇的多價(jià)抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測(cè)所用兩種抗體分別針對(duì)同一個(gè)抗原分子的不同抗原決定簇

2021/3/10192．間接法2021/3/10203.競(jìng)爭(zhēng)法2021/3/1021特點(diǎn)：用于抗原和半抗原的定量測(cè)定，也可對(duì)抗體進(jìn)行測(cè)定。酶標(biāo)Ag（Ab）與樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的非標(biāo)記Ag（Ab）具有相同的與固相Ab(Ag)結(jié)合的能力。反應(yīng)體系中，固相Ab（Ag）和酶標(biāo)Ag（Ab）是固定限量的，且前者的結(jié)合位點(diǎn)少于酶標(biāo)記與非標(biāo)記Ag（Ab）的分子數(shù)量和。反應(yīng)后，結(jié)合與固相載體上復(fù)合物中被測(cè)定的酶標(biāo)Ag（Ab）的量（酶活性）與樣品中非標(biāo)記Ag（Ab）的濃度成反比。2021/3/10224.捕獲法（反向間接法）

主要用于血清中某種抗體亞型成分（如IgM）的測(cè)定。2021/3/1023注意事項(xiàng)：加樣

應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。保溫

1、一般均采用水浴箱，使溫度迅速平衡。

2、為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔。2021/3/1024洗滌：

決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。目的：洗去反應(yīng)液中沒(méi)有與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動(dòng)洗滌儀外，手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種。2021/3/1025比色

比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中。用特定的波長(zhǎng)測(cè)讀吸光值。

比色結(jié)果的表達(dá)以往通用光密度（opticaldensity，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長(zhǎng)寫(xiě)于A字母的右下角，如OPD的吸收波長(zhǎng)為492nm，表示方法為"A492nm"或"OD492nm"。2021/3/1026四、均相酶免疫吸測(cè)定

基本原理：利用酶標(biāo)抗體結(jié)合抗原形成復(fù)合物后，標(biāo)記酶的活性發(fā)生改變的原理，在不將復(fù)合物與游離酶標(biāo)抗體分離的情況下，直接測(cè)定系統(tǒng)中總的標(biāo)記酶活性的改變，進(jìn)而推算出待檢樣品中的抗原量。

主要用于小分子抗原或半抗原的檢測(cè).2021/3/1027(一)酶擴(kuò)大免疫測(cè)定技術(shù):

（enzyme-multipliedimmunoassaytechnique，EMIT）基本原理:半抗原與酶結(jié)合成酶標(biāo)半抗原，保留半抗原和酶的活性。當(dāng)酶標(biāo)半抗原與抗體結(jié)合后，所標(biāo)的酶與抗體密切接觸，使酶的活性中心受影響而活性被抑制。2021/3/1028（二）克隆酶供體免疫測(cè)定

（clonedenzymedonorimmunoassay,CEDIA）

利用重組DNA技術(shù)制備β-半乳糖苷酶的兩個(gè)片段：大片段稱(chēng)為酶受體（enzymeacceptor,EA），小片段稱(chēng)為酶供體（enzymedonor,ED），兩個(gè)片段本身均不具酶活性，但結(jié)合在一起就具有酶活性，利用這一特性建立的均相酶免疫測(cè)定稱(chēng)為克隆酶供體免疫測(cè)定(CEDIA)。

CEDIA的反應(yīng)模式為競(jìng)爭(zhēng)法。2021/3/1029基本原理：標(biāo)本中的抗原和ED標(biāo)記的抗原與特異性抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，形成兩種抗原抗體復(fù)合物。ED標(biāo)記的抗原與抗體結(jié)合后由于空間位阻，不能再與EA結(jié)合。反應(yīng)平衡后，剩余的ED標(biāo)記抗原與EA結(jié)合，形成具有活性的酶，加入底物測(cè)定酶活力，酶活力的大小與標(biāo)本中抗原含量呈正比。2021/3/1030五、固相膜免疫測(cè)定

固相膜免疫測(cè)定與ELISA相類(lèi)似,其特點(diǎn)是以微孔膜作為固相.標(biāo)記物可用酶和各種有色微粒子,如彩色乳膠、膠體金等。常用固相膜為硝酸纖維素（NC）膜。類(lèi)型：免疫滲濾試驗(yàn)：穿流形式免疫層析試驗(yàn)：橫流形式斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗(yàn)（dot-ELISA）免疫印跡法

(Westernblot)2021/3/1031（一）斑點(diǎn)ELISA(dot-ELISA)2021/3/1032（二）免疫印跡法

（immunoblottingtest，IBT）亦被稱(chēng)為Westernblot分三個(gè)階段進(jìn)行:SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）電轉(zhuǎn)移酶免疫定位

2021/3/1033免疫印跡法原理示意圖

2021/3/1034第二節(jié)熒光免疫技術(shù)

免疫熒光技術(shù)(immunofluorescencetechnique)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光物質(zhì)檢測(cè)的敏感性和直觀性結(jié)合起來(lái)的一種方法。2021/3/1035基本原理

利用熒光素標(biāo)記抗體，使之在涂片上或組織切片上與標(biāo)本中的待檢抗原特異結(jié)合，采用高發(fā)光效率的點(diǎn)光源，透過(guò)濾色板發(fā)出一定波長(zhǎng)的光，使結(jié)合在標(biāo)本上的熒光素被激發(fā)而產(chǎn)生熒光，借助熒光顯微鏡觀察底物片上熒光染色形態(tài)，來(lái)判斷有無(wú)待檢抗原或抗體。2021/3/1036一、免疫熒光顯微技術(shù)（一）基本原理：使熒光抗體與標(biāo)本切片中組織或細(xì)胞表面的抗原進(jìn)行反應(yīng)，洗滌除去游離的熒光抗體后，于熒光顯微鏡下觀察，在黑暗背景上可見(jiàn)明亮的特異熒光。2021/3/1037（二）熒光抗體的制備（1）熒光抗體的標(biāo)記作為標(biāo)記的熒光素應(yīng)符合以下要求：

①應(yīng)具有能與蛋白質(zhì)分子形成共價(jià)健的化學(xué)基團(tuán)，與蛋白質(zhì)結(jié)合后不易解離，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物易于清除。②熒光效率高,與蛋白質(zhì)結(jié)合后，仍能保持較高的熒光效率。③熒光色澤與背景組織的色澤對(duì)比鮮明。④與蛋白質(zhì)結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有的生化與免疫性質(zhì)，與蛋白質(zhì)的結(jié)合物穩(wěn)定，易于保存。

⑤標(biāo)記方法簡(jiǎn)單、安全無(wú)毒。2021/3/1038熒光抗體是將熒光素（如FITC）與特異性抗體以化學(xué)方式共價(jià)結(jié)合而成。常用于標(biāo)記的熒光素：異硫氰酸熒光黃（FITC）

四乙基羅丹明（RB200）

四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）標(biāo)記方法：攪拌法(適合大樣品)

透析法(適合小樣品)標(biāo)記抗體的純化：透析法、層析分離法2021/3/1039（2）熒光抗體的鑒定F/P比率：

將制備的熒光抗體稀釋至A280≈1.0，分別測(cè)讀A280（蛋白質(zhì)特異吸收峰）和標(biāo)記熒光素的特異吸收峰。

2021/3/1040F/P值越高，說(shuō)明抗體分子上結(jié)合的熒光素越多，反之則越少。一般用于固定標(biāo)本的熒光抗體以F/P＝1.5為宜，用于活細(xì)胞染色的以F/P＝2.4為宜。

2021/3/1041抗體效價(jià)：效價(jià)越大標(biāo)記抗體的特異性越高非特異熒光越少。效價(jià)在1:16-1:32者較為理想?？贵w特異性

：免疫電泳和交叉免疫電泳觀察特異性沉淀線或沉淀峰，在紫外線照射下發(fā)出強(qiáng)烈熒光。

2021/3/1042（三）技術(shù)類(lèi)型

直接法優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、特異性高、非特異熒光染色因素少。缺點(diǎn)：靈敏度偏低，每檢查一種抗原需制備相應(yīng)的特異熒光抗體。2021/3/1043間接法優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，在不同抗原的檢測(cè)中只需應(yīng)用一種熒光抗體。既可檢測(cè)抗原，也可檢測(cè)抗體。2021/3/1044（四）熒光免疫顯微技術(shù)在

醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用1．血清中自身抗體的檢測(cè)2．各種微生物階快速檢查和鑒定3．寄生蟲(chóng)感染的診斷4．白細(xì)胞分化抗原的檢測(cè)5．人類(lèi)白細(xì)胞抗原(HLA)的檢測(cè)6．腫瘤組織中腫瘤抗原的檢測(cè)7．組織中免疫球蛋白和補(bǔ)體組分的檢測(cè)8．激素和酶的組織定位2021/3/1045二、熒光免疫測(cè)定技術(shù)

熒光免疫測(cè)定同酶免疫測(cè)定一樣，根據(jù)抗原抗體結(jié)合后是否需要將結(jié)合狀態(tài)與游離狀態(tài)的的熒光標(biāo)記抗原（或抗體）分離開(kāi)，而將之為均相和非均相兩種類(lèi)型。

2021/3/1046(一)時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定

1.基本原理時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定(time-resolvedfluorescenceimmunoassay，TR-FIA)是熒光分析（FIA）的基礎(chǔ)上，用具較長(zhǎng)壽命熒光的稀土金屬（Eu、Tb、Sm、Dy）的作為標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記抗體或抗原，從而檢測(cè)標(biāo)本中的相應(yīng)抗原或抗體的新技術(shù)。

2021/3/10472.技術(shù)類(lèi)型

(1)固相雙位點(diǎn)夾心法(2)固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法(3)固相抗體競(jìng)爭(zhēng)法2021/3/1048(二)熒光偏振免疫測(cè)定

FPIA是一種均相競(jìng)爭(zhēng)熒光免疫分析法。其原理是：標(biāo)本中的抗原與熒光標(biāo)記的抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體。反應(yīng)平衡后，與抗體結(jié)合的熒光標(biāo)記抗原的量與標(biāo)本中抗原濃度的量呈反比。由于抗體的分子量遠(yuǎn)大于抗原的分子量，游離的熒光標(biāo)記抗原與結(jié)合抗體的熒光標(biāo)記抗原所產(chǎn)生的偏振熒光強(qiáng)度相差甚遠(yuǎn)。因此在FPIA中測(cè)定的偏振熒光強(qiáng)度與標(biāo)本中抗原的濃度呈反比。通過(guò)小分子抗原標(biāo)準(zhǔn)品與熒光偏振強(qiáng)度關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，可檢測(cè)小分子抗原的濃度。2021/3/1049第三節(jié)放射免疫技術(shù)

放射免疫分析（radioimmunoassay,RIA）免疫放射分析（immunoradiometricassay,IRMA）

廣義放射免疫技術(shù)還包括放射受體分析（使用受體測(cè)量抗原）和放射配體結(jié)合分析（使用配體研究受體）。特點(diǎn):靈敏度高(10-9-10-15g/L)、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等2021/3/1050一、放射免疫分析（RIA）基本原理

采用定量的標(biāo)記抗原（Ag＋）和非標(biāo)記抗原（Ag）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合有限量特異性抗體（Ab）的反應(yīng)。2021/3/1051二、免疫放射分析（IRMA）基本原理單位點(diǎn)IRMA：利用過(guò)量標(biāo)記抗體與待測(cè)抗原進(jìn)行反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物，反應(yīng)平衡后，用固相抗原結(jié)合反應(yīng)液中剩余的未結(jié)合標(biāo)記抗體并將其分離，測(cè)定上清液的放射量。2021/3/1052雙位點(diǎn)IRMA

先用固相抗體與抗原反應(yīng)結(jié)合,然后再用過(guò)量的標(biāo)記抗體與已結(jié)合于固相抗原的另一抗原決定簇結(jié)合,形成固相抗體-抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物,洗棄反應(yīng)液中剩余的標(biāo)記抗體,測(cè)定固相上的放射性。2021/3/1053IRMA與RIA的異同點(diǎn)1.標(biāo)記物2．反應(yīng)速率3．反應(yīng)原理4．特異性5．靈敏度和檢測(cè)范圍6．分析誤差

2021/3/1054第四節(jié)發(fā)光免疫技術(shù)

發(fā)光免疫技術(shù)(luminescenceimmuno-technique)是將發(fā)光分析系統(tǒng)和免疫測(cè)定相結(jié)合而建立的一種新的超微量免疫分析技術(shù)。該方法既具有免疫反應(yīng)的高度特異性又有發(fā)光分析的高靈敏度。2021/3/1055根據(jù)發(fā)光免疫技術(shù)中發(fā)光標(biāo)記物不同，分為三種類(lèi)型。化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescenceimmuneassay，CLIA)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(luminescenceenzymeimmunoassay，IEIA)生物發(fā)光免疫分析（bioluminescenceimmunoassay，BLIA）2021/3/1056一、發(fā)光與發(fā)光底物（一）發(fā)光（二）光照發(fā)光（三）生物發(fā)光（四）化學(xué)發(fā)光氨基苯二酰肼類(lèi)、吖啶酯（acridiniumester，AE）類(lèi)2021/3/1057二、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記技術(shù)

（一）發(fā)光標(biāo)記法的分類(lèi)生物標(biāo)記法（直接合成法）直接化學(xué)發(fā)光劑物質(zhì)標(biāo)記法（直接偶聯(lián)法）催化劑和協(xié)同因子標(biāo)記抗原抗體法（間接偶聯(lián)法）2021/3/1058（二）標(biāo)記方法碳二亞胺（EDC）縮合法重氮鹽偶聯(lián)法（重氮化法）過(guò)碘酸鹽法戊二醛法琥珀酸酐法異硫氰酸酯衍生物法O-（羧甲基）羧胺法2021/3/1059第五節(jié)金標(biāo)記免疫技術(shù)

金標(biāo)記免疫技術(shù)（immunogoldlabelingtechnique）是以膠體金作為標(biāo)記抗原或抗體，檢測(cè)樣品中抗體或抗原的性質(zhì)、含量、形態(tài)學(xué)特征等進(jìn)行分析的綜合技術(shù)。它是利用金顆粒光學(xué)檢測(cè)的靈敏性與免疫反應(yīng)的特異性相結(jié)合的一種技術(shù)。2021/3/1060一、膠體金的特性（一）膠體特性（二）光學(xué)特性（二）穩(wěn)定性（三）溶膠的聚沉現(xiàn)象2021/3/1061二、膠體金標(biāo)記技術(shù)的類(lèi)型

（一）斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)1.原理斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)(dotimmunogoldfiltrationassay，DIGFA)是以NC膜為載體，包被抗原或抗體于滲濾裝置中，依次滴加標(biāo)本、免疫金及洗滌液，因微孔濾膜貼置于吸水材料上故溶液流經(jīng)滲濾裝置時(shí)與膜上的抗原或抗體快速結(jié)合并起到濃縮作用，達(dá)到快速檢測(cè)目的(一般5min左右完成)。2021/3/10622.技術(shù)類(lèi)型

（1）雙抗體夾心法（2）間接法金免疫滲濾裝置示意圖

2021/3/1063（二）斑點(diǎn)免疫層析試驗(yàn)1.原理斑點(diǎn)免疫層析試驗(yàn)（dot-immunochromatographicassay，DICA）簡(jiǎn)稱(chēng)免疫層析試驗(yàn)（ICA），也以NC膜為載體，但利用了微孔膜的毛細(xì)管作用，滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端滲移，猶如層析一般。在移動(dòng)過(guò)程中被分析物與固定于載體膜上某一區(qū)域的抗體或抗原結(jié)合而被固相化，無(wú)關(guān)物則越過(guò)該區(qū)域而被分離，然后通過(guò)膠體金的呈色條帶來(lái)判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2021/3/10642.技術(shù)類(lèi)型

（1）雙抗體夾心法（2）競(jìng)爭(zhēng)法（3）間接法免疫層析試驗(yàn)原理示意圖

2021/3/1065第六節(jié)生物素-親和素

免疫放大技術(shù)

生物素-親和素系統(tǒng)（biotin-avidinsystem，BAS）是以生物素和親和素具有的獨(dú)特結(jié)合特性為基礎(chǔ)，結(jié)合二者即可偶聯(lián)抗原抗體等大分子生物活性物質(zhì)，它們的結(jié)合迅速、專(zhuān)一、穩(wěn)定，并具有多級(jí)放大效應(yīng)。2021/3/1066一、生物素-親和素系統(tǒng)的特點(diǎn)生物素（biontin，B）由卵黃和肝組織中提取，分子量244.31kD生物素分子有兩個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)

Ⅰ環(huán)為咪唑酮環(huán)，與親和素結(jié)合的主要部位；

II環(huán)為噻吩環(huán)，其末端羧基是結(jié)合抗體和其他生物大分子的惟一結(jié)構(gòu)，經(jīng)化學(xué)修飾后成為活化生物素。2021/3/1067親和素（avidin，AV）亦稱(chēng)抗生物素蛋白、卵白素由卵白蛋白中提取，4個(gè)相同亞基組成的堿性糖蛋白，分子量為68kD耐熱井耐受多種蛋白水解酶的作用．尤其是與生物素結(jié)合后，穩(wěn)定性更好。每個(gè)親和素能結(jié)合4個(gè)分子的生物素，二者之間的親和力極強(qiáng)，比抗原與抗體間的親和力至少高1萬(wàn)倍，因此二者的結(jié)合特異性高和穩(wěn)定性好。2021/3/1068

BAS特點(diǎn)：靈敏度

①形成的生物素衍生物，保持原有生物活性，比活度高，具多價(jià)性。②每個(gè)親和素分子有四個(gè)生物素結(jié)合部位，可同時(shí)以多價(jià)形式結(jié)合生物素化的大分子衍生物和標(biāo)記物。③具有多級(jí)放大作用，提高靈敏度。2021/3/1069特異性

①具有極高的親和力，其反應(yīng)呈高度專(zhuān)一性；②不會(huì)因反應(yīng)試劑的高度稀釋而受影響，可最大限度地降低反應(yīng)試劑的非特異作用。穩(wěn)定性

①親和常數(shù)極高，解離常數(shù)很小，反應(yīng)不可逆；②酸、堿、變性劑、蛋白溶解酶以及有機(jī)溶劑均不影響其結(jié)合。2021/3/1070適用性

①可與酶、熒光素和放射性核素等各類(lèi)標(biāo)記技術(shù)結(jié)合，用于檢測(cè)體液、組織或細(xì)胞中的抗原-抗體、激素—受體和核酸系統(tǒng)以及其他多種生物學(xué)反應(yīng)體系，②可制成親和介質(zhì)，用于分離提純上述各反應(yīng)體系中的反應(yīng)物。其他

①可制成多種通用性試劑，實(shí)驗(yàn)成本低；②結(jié)合具高速、高效的特性，所需的溫育時(shí)間短，實(shí)驗(yàn)往往只需數(shù)小時(shí)即可完成．2021/3/1071二、生物素的理化性質(zhì)與標(biāo)記生物素及其活化

生物素經(jīng)活化后，可容易地與各種抗原、抗體、酶及核酸分子中相應(yīng)基團(tuán)偶聯(lián)形成生物素化標(biāo)記物。

常用的活化生物素的標(biāo)記制備方法

①標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基的活化生物素②標(biāo)記蛋白質(zhì)醛基的活化生物素③標(biāo)記蛋白質(zhì)巰基的活化生物素

④標(biāo)記核酸的活化生物素2021/3/1072生物素化蛋白質(zhì)衍生物

特性：

一個(gè)蛋白質(zhì)分子可聯(lián)結(jié)多個(gè)生物素分子，具較高的比活性，在與親和素的反應(yīng)中成為多價(jià)。生物素化大分子的多價(jià)性，是BAS多級(jí)放大作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

類(lèi)型：（二類(lèi)）①生物素化的大分子生物活性物質(zhì)如：抗原、抗體等②標(biāo)記材料結(jié)合生物素后制成的標(biāo)記物如：酶類(lèi)等2021/3/1073蛋白質(zhì)生物素標(biāo)記注意事項(xiàng)：①應(yīng)根據(jù)抗原或抗體分子結(jié)構(gòu)中基團(tuán)種類(lèi)（氨基、醛基或巰基）及分子理化性質(zhì)（酸性、中性或堿性），選擇相應(yīng)的活化生物素和反應(yīng)條件。②控制每個(gè)蛋白質(zhì)分于上標(biāo)記的生物素分子數(shù)量在一定范圍，以免影響標(biāo)記物活性。③在生物索與被標(biāo)記物間加入交聯(lián)臂樣結(jié)構(gòu)，減少大分于物質(zhì)造成的空間位阻，利于結(jié)合。④生物素與抗原、抗體等蛋白質(zhì)結(jié)合后應(yīng)不影響后者的免疫活性。2021/3/1074三、親和素、鏈霉親和素的理化性質(zhì)與標(biāo)記親和素及其活性

親和素在純水中的溶解度類(lèi)似于球蛋白，而在50％硫酸銨溶液中的溶解度又與白蛋白相似，親和素富含的色氨酸與其活性密切相關(guān)，是親和素與生物素咪唑環(huán)酮結(jié)合的基團(tuán)。2021/3/1075鏈霉親和素及其活性

①鏈霉親和素（streptavidin，SA）是由鏈霉菌分泌的一種蛋白質(zhì)，分子量為65kD。②鏈霉親和素分子由4條相同的肽鏈組成，甘氨酸和丙氨酸的含量較大，結(jié)合生物素的活性基團(tuán)是肽鏈中色氨酸殘基；③與親和素一樣，一個(gè)鏈霉親和素分子也能結(jié)合4個(gè)生物素分子。④鏈霉親和素可在N端10～12和Ｃ端19-21間斷裂，形成的核心鏈霉親和素仍然保持完整的結(jié)合生物素的能力。2021/3/1076親和素（或鏈霉親和素）的標(biāo)記

幾乎所有用于標(biāo)記的物質(zhì)均可以同親和素（AV）或鏈霉親合素（SA）結(jié)合。小分子